第九章 动物早期胚胎操作

一、胚胎切割的基本程序
• 1.切割器具的准备
器械：倒置显微镜和显微操作仪。 胚胎固定管：末端钝圆，外径与所固定 胚胎直径相近，内径一般为20~30um。 切割针：玻璃针和微刀两种。玻璃针一 般用实心玻璃棒拉成，微刀是用锋利的金 属刀片与微细玻璃棒粘在一起制成
玻璃针进行胚胎分割 微刀进行胚胎分割
• 2.胚胎预处理： 为了减少切割损伤，胚胎在切割前 一般用链霉蛋白酶进行短时间处理，使透明带软化 并变薄或者在显微操作仪下直接去除透明带。
一）胚胎移植的生理学基础（p227）
• 成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在 外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和 排卵数可达数十个
• 每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育 • 早期胚胎处于游离状态 • 胚胎发育一般不存在免疫问题 • 胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组
联系
• 胚胎的遗传性不受受体的影响
• 3.胚胎分割方法： • 1）willadsen法 • 2）williams法 • 3）铃木分割法 • 4）显微吸管分割法 • 5）徒手分割法
• (1)桑椹胚之前的胚胎 （Willianms分割法）
这一阶段胚胎因为卵裂球较大，直接切 割对卵裂球的损伤较大。
常用的方法是用微针切开透明带，用微 管吸取单个或部分卵裂球，放人另一空透明 带中，空透明带通常来自未受精卵或退化的 胚胎。
牛超数排卵示意图
2）.PMSG法
孕马血清促性腺激素(PMSG)处理法 在 情 期 的 11 ～ 12d ， 一 次 肌 注 PMSG2500 ～ 30001U ，
48h后宫注PGF2α2.4mg。发情后约18h肌注等量的 抗PMSG。
发情观察和配种
PGF2α处理后40～48h，大部分处理牛发情。 通常要求从注PGF第2d傍晚开始观察发情，至少 早晚各观察一次。在观察到接受爬跨后4～6h进 行第一次输精，间隔12h后第二次输精。每次有 效精子数不得少于50×106，输入两侧子宫角或 子宫体。注意输精时不得触摸卵巢。
二）胚胎移植的基本原则（p228）
• 胚胎移植前后所处的环境的同一性 – 供体和受体在分类学上的相同属性。 – 动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上 的同期性。
– 动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性 • 胚胎发育的期限：胚胎日龄不能超过周期黄体的寿
命。
• 胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中 不受不良因素的影响。
• 手术法：
• 早期胚胎（如4d以前）的收集：
• 剖腹，拉出输卵管和子宫，从子宫角尖端（牛、 羊）或输卵管末端（猪）注入冲胚液，从输卵 管伞部接取冲胚液。
• 晚期胚胎（胚胎已经进入子宫角）的收集：
• 从子宫角上端注入30—50ml的冲胚液，由基 部接取，或由基部入针，从上端接取。
手术法采胚
A. 由宫管联结部冲向伞部 B. 由伞部冲向宫管联结部 C. 由宫管联结部冲向子宫角基部
B.采用具有溶黄体作用的前列腺素及 其类似物，使卵巢上的功能黄体同时迅速 溶解、消退，使卵泡解除抑制并迅速发育， 从而导致母畜的同期发情。
四）供体早期胚胎的收集
• 胚胎的收集是指在配种或输精后的适当时 间，从超排供体回收胚胎，以准备给受体 移植，简称采胚。
• 一般将配种当日记为0天，从配种后第二天 开始计算采胚天数。
二、胚胎移植的技术程序
• 1.供体和受体的选择 • 2.供体的超数排卵处理 • 3.同期发情处理 • 4.供体早期胚胎的收集 • 5.胚胎的质量检查 • 6.胚胎的体外培养与保存 • 7.供体胚胎移植到受体生殖道内 • 8. 胚胎在受体中的着床、妊娠及分娩。
一）供体和受体的选择
• 供体应具有相当高的育种价值 • 供体生殖机能应处于较高的状态：无生殖
• 3. 其他因素：移植方法、污染程度、操作 熟练程度等。
第二节、胚胎分割技术
• 胚胎分割(embryo splitting)是运用显微操作系统 将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育 潜力部分的生物技术，运用胚胎分割可获得同卵 孪生后代。
• 在畜牧生产上，胚胎分割可用来扩大优良家畜的 数量;在实验生物学或医学中，运用同卵孪生后代 作实验材料，可消除遗传差异，提高实验结果的 准确性。
2.同期发情的机理：主要是借助外源激素对卵巢的作用，使被 处理的母畜卵巢按预定的要求发生变化，并使其功能处于一个 共同的基础之上，达到同期表现发情的目的。
目前的同期 发情技术有 两种方法：
A.用孕激素处理抑制卵巢上卵泡的生 长发育和发情表现，待所有处理母畜的自 然黄体退化，功能消失后，同时停药；此 时，由于卵巢失去了孕激素的抑制作用， 于是卵泡又迅速发育并表现发情。
• (2)桑椹胚和囊胚的分割
对于这一阶段的胚胎， 通常采用直接切割法， 操作时，用微针或微刀由胚胎正上方缓慢下降，轻 压透明带以固定胚胎，然后继续下切，直至胚胎一 分为二，再把裸露半胚移入预先准备好的空透明带 中，或直接移植给受体。在进行囊胚切割时，要注 意将内细胞团等分。
A.准备拟分割胚与空透明带；B.用二分离针拨开小孔；C.扩展开口；D.用吸管 插入开口吸取卵裂球团；E.吸出后胚胎又复原；F.用切割吸管等份分割； G.切
大动物手术法采胚
• 非手术法：
• 此法一般适宜配种后6-8天胚胎的收集。
• 母畜保定---尾椎硬膜外腔麻醉---插入三通管 ---由充气孔注水或气体至气球膨胀，使子宫 角基部堵塞---30-60ml冲胚液从注射孔灌入， 充满整个子宫角---辅以按摩子宫，或将子宫 角倒提等方法令冲胚液回流，从回收孔收集。
• 动物常用超排激素： PMSG、FSH、LH、GnRH、hCG等。
• 超排原理（p195）： 外源激素可以改变卵巢上只有一个或少数卵泡成熟
排卵的定势，解除单胎动物优势卵泡发育对同一拨其 他卵泡发育的抑制作用，促使同一拨卵泡群中大部分 卵泡能够发育成熟并排卵。
卵泡发育波理论（P195）
• 募集：只有部分小卵泡能接受FSH刺激开始发育。
后10~12h
绵羊 发情开始 1.5
2
2.5
3
后24~30h
3~4 6~7 7~8 15
猪 发情开始 1~2 2~3 3~4 4~5 5~6
后35~45h
6 7~8 13
兔 交配后 10~11h
1 1~1.5 1.5~2 2~3 2.5~3 3~4
• 采胚方法：
• 大家畜：手术法
•
非手术法
• 小鼠等实验动物：处死动物，解剖法。
三）同期发情 p229
（一）同期发情（同步发情）：用人工的方法对母畜发情 周期进行同期化处理的方法叫同期发情。在胚胎移植技术 中，受体子宫和供体胚胎处于高度同步化状态才有利于移 植胚的发育。
1.同期发情在畜牧Fra Baidu bibliotek产中的意义：A.便于集中或定时对一群 母畜进行输精；B.可做到同期配种，从而使母畜的妊娠、分 娩、幼畜的培育相对集中，提高生产效率和经济效益。C.利 于家畜的胚胎移植技术的应用。
• 琼脂包埋的作用是固定胚胎，便于回收，但不影响 胚胎的发育。
超数排卵方法
1.小鼠的超数排卵 腹腔注射PMSG 10U，一 般选择在中午注射，间隔 48小时后注射HCG，光照 周期保持12～14h，
2.牛等的超数排卵
1）促卵泡素(FSH)减量注射法：供体牛 在发情后的9～13d肌注FSH，早晚各一次， 间隔12h，分4d减量注射。在第3d时同时宫 注PGF2α2.0～2.4mg或氯前列烯醇0.6mg。如 使用国产FSH总剂量为325单位时，处理方法 如附图所示。
牛胚胎的胚龄与胚胎发育的关系
六） 胚胎移植
• 手术法胚胎移植：
大动物非手术法胚胎移植
• 目前牛的胚胎移植主要采用非手术法。人 工受精管中装入胚胎，通过子宫颈后注入 所装胚胎即可。
• 注意： • 移植前应保证受体牛生殖道无病理情况 • 移植中要尽量减少对生殖道的刺激，以免
引起子宫收缩排出移植胚。
系统疾病，体质强健
• 受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适 应性强，体型中上等，非优良品种
• 受体健康状况良好，已进入发情季节 • 供受体发情时间应接近或一致
二）供体的超数排卵处理（p231）
• 超数排卵： 在母畜发情周期的适当时间，利用外源激素，增进
卵巢的生理活性，使其排出超过常规数量卵子的技术 称为超数排卵。
后之二分胚；H.将二分胚分别送入空透明带中；I.已完成分割的二分胚。 1.吸出吸管；2.分离针；3.刺入针；4.待分割胚；5.空透明带；6.固定吸管
4.分割胚的培养
• 为提高半胚移植的妊娠率和胚胎利用率，分割后的 半胚需放入空透明带中或者用琼脂包埋移入中间受 体在体内或直接在体外培养。
• 半胚的体外培养方法基本同于体外受精卵。 体内 培养的中间受体一般选择绵羊、家兔等动物的输卵 管，输卵管在胚胎移入后需要结扎以防胚胎丢失。
第九章 动物胚胎工程
• 一、胚胎移植技术 • 二、胚胎分割技术 • 三、嵌合体技术 • 四、细胞核移植技术
第一节、胚胎移植技术
• 一、胚胎移植的概念及生理基础和原则： • 概念：将处于某一发育阶段的早期胚胎移植到
与其发育阶段相对应的同种母畜生殖道内，使 之受孕并产生后代的技术。即借腹怀胎。 • 供体：提供胚胎的个体，一般为良种。 • 受体：接受胚胎的个体，提供胚胎孕育时间和 空间。
• 选择：FSH的作用使得雌激素水平增加，负反馈作用 于下丘脑，使没有发生募集作用的小卵泡发生闭锁。
• 优势化：卵泡发育的后期，只有少数几个或一个具有 优势的卵泡进一步发育。
• 排卵：排卵前，卵泡中的LH达到峰值而触发排卵，排 卵后破裂卵泡处形成黄体，分泌孕酮和少量雌激素， 它们负反馈作用于下丘脑，进一步抑制FSH、LH的分 泌，从而抑制其他卵泡的发育。
（2）子宫采胚法：
受精后60–72小时，一些致密的8细胞胚 胎已进入子宫。而桑椹胚和囊胚的收集则一 定要从子宫中获得。
五）供体胚胎的分级检查
• 冲胚液回收后，应立即收集冲胚液中的胚胎， 并进行质量检查。
• 形态学标准：教材P236、P237 • 形态大小正常，卵裂球均一，透明带完整等。 • 采卵时间与胚胎发育时间是否吻合。
• 3.羊的超数排卵
• 可采用牛的超排处理方法，FSH减量注射 或PMSG + PGF2α法。
• 也可采用如下方法：
• 每日肌注孕酮10-12mg，连续处理约14d后， 一次性肌注PMSG1000-2000IU，1-2天配 种。
• 影响超数排卵的因素： • 1. 动物个体状况： • 不同个体对激素的敏感性不同 • 动物的遗传基础的差异 • 动物的年龄差异 • 2. 外界环境因素： • 季节 • 光照周期 • 气候条件及动物营养水平 • 3. 药物因素：PMSG、FSH等 • 4. 激素的注射部位及超排程序
• 在体视显微镜下观察输卵管伞，并用 移卵管吸取胚胎，次序为石蜡油、空 气泡1、培养液、空气泡2、胚胎(尽可 能少带入培养液)。空气泡3、培养液。
七）影响胚胎移植成功率的因素
• 1. 胚胎因素：胚胎的质量、发育阶段、数 量、供体质量、体外停留时间等。
• 2. 母体因素：供受体发情的同期化程度、 受体孕酮水平、移植部位、受体营养水平、 受体子宫等生殖系统状态等。
• 小鼠等实验动物的采胚：
（1）输卵管采胚法：
以脱颈椎法杀死受精1天后的母鼠（此时胚胎 一般处于2细胞期），暴露子宫、输卵管；剪下子 宫、输卵管，置于平皿中；在灭菌平皿中剪下输 卵管置入盛有冲卵液的集卵杯中，在体视显微镜 下撕开壶腹部，释放受精卵并用用新鲜的培养液 洗1–2次。
• 用透明质酸酶处理受精卵细胞团
胚胎移植的意义
• 1. 充分发挥优良母畜的繁殖潜力，加快优 良品种的改良。对牛羊等繁殖力较低的优 良品种来说，结合人工受精技术可克服其 产仔数和世代间隔的限制。
• 2. 体外受精、胚胎嵌合和核移植等技术都 必须通过胚胎移植获得活体。
• 3. 结合胚胎冷冻可长期保存珍贵遗传资源， 并且方便它们的运输。
• 不同动物早期胚胎发育速度和到达子宫的 时间各有差异（p233，表9-1），应根据采 胚目的来选择合适的采胚时间。
各种家畜的排卵时间和胚胎发育速度
发育速度(排卵后天数) 畜别 排卵时间 2细胞 4细胞 8细胞 16细胞 进入子宫 囊胚
孵化
附植
牛 发情结束 1~1.5 2~3 3 3~4 4~5 7~8 8~10 22