分子生物学实验
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DNA(可用作文库构建)。
可能的结果：
由于基因组DNA比较难溶、且容易被降解，电泳时经常 会出现弥散的或不均一的条带（如左图）。所以实验时 一定要注意机械力对大分子DNA的破坏作用，如避免振 荡、使用扩口枪头等。另外要适当的延长溶解时间。
Biblioteka Baidu
12000rpm离心15min，弃上清
沉淀用1mL 75%冷乙醇洗两次，每次12000rpm离心10min，
弃上清
超净台中干燥加 50uL TE, 40C溶解过夜，-200C保存
基因组DNA的检测
前述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、 PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及 质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影 响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检 测DNA的产量和质量。 1. DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260 /OD280 比 值, 明确DNA的含量和质量。 (☆) 2. 取2-5μl 在0.7% agarose胶上80V电泳, 检测DNA 的分子大小。 (☆) 3. 取2μg DNA, 用10单位(U)HindⅢ酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检测能否完全酶解(做RFLP, DNA 必须完全酶解)。
3. 生理盐水(0.7%) 1000 mL 灭菌备用 4. 3mol/L NaAc pH5.2 100 mL 灭菌备用
先用50mL水溶解固体NaAc 再用3mol/L乙酸调pH至5.2， 最后定容
同时灭菌备用： 枪头： 1mL 、200uL 各一盒 小指管: 2.0、0.5mL各20个 研磨棒: 20支 无菌水：250ml X 2瓶
（加RNase ,终浓度200ug/mL，370C保温60min）
加等体积酚/氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置 10-20min
40C，10000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清
上清加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀
40C,10000rpm，用扩口枪头取上清
上清加1/10体积的NaAc和加2倍体积的无水乙醇慢慢混匀沉 淀DNA，-200C静置30min，DNA沉淀形成白色絮状物。
如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或 小分子DNA多, 影响接续的分析和操作,可以用 下列方法处理：
（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 （2）酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。 （3）Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小
分子DNA。 （4）CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段
四、实验步骤
基因组DNA的提取： 0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎
加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入2mL匀浆液混匀
匀浆液转入2mL小指管，40C , 5000rpm离心2min,
沉淀加0.4mL无菌水，吹散，再加0.4mL酶解液，慢慢颠倒混 匀
550C 水浴酶解过夜或2小时以上，40C存放
三、试剂：
1. 组织匀浆液 200 mL 灭菌备用 10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 25mmol/L EDTA 100mmol/L NaCl
2. 酶解液 100 mL （灭菌后再加蛋白酶K和SDS) 20mmol/L Tris-HCl pH 8.0 50mmol/L EDTA 200mmol/L NaCl 200ug/mL蛋白酶K 1％SDS
可能的结果：
由于基因组DNA比较难溶、且容易被降解，电泳时经常 会出现弥散的或不均一的条带（如左图）。所以实验时 一定要注意机械力对大分子DNA的破坏作用，如避免振 荡、使用扩口枪头等。另外要适当的延长溶解时间。
Biblioteka Baidu
12000rpm离心15min，弃上清
沉淀用1mL 75%冷乙醇洗两次，每次12000rpm离心10min，
弃上清
超净台中干燥加 50uL TE, 40C溶解过夜，-200C保存
基因组DNA的检测
前述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、 PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及 质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影 响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检 测DNA的产量和质量。 1. DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260 /OD280 比 值, 明确DNA的含量和质量。 (☆) 2. 取2-5μl 在0.7% agarose胶上80V电泳, 检测DNA 的分子大小。 (☆) 3. 取2μg DNA, 用10单位(U)HindⅢ酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检测能否完全酶解(做RFLP, DNA 必须完全酶解)。
3. 生理盐水(0.7%) 1000 mL 灭菌备用 4. 3mol/L NaAc pH5.2 100 mL 灭菌备用
先用50mL水溶解固体NaAc 再用3mol/L乙酸调pH至5.2， 最后定容
同时灭菌备用： 枪头： 1mL 、200uL 各一盒 小指管: 2.0、0.5mL各20个 研磨棒: 20支 无菌水：250ml X 2瓶
（加RNase ,终浓度200ug/mL，370C保温60min）
加等体积酚/氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置 10-20min
40C，10000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清
上清加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀
40C,10000rpm，用扩口枪头取上清
上清加1/10体积的NaAc和加2倍体积的无水乙醇慢慢混匀沉 淀DNA，-200C静置30min，DNA沉淀形成白色絮状物。
如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或 小分子DNA多, 影响接续的分析和操作,可以用 下列方法处理：
（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 （2）酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。 （3）Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小
分子DNA。 （4）CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段
四、实验步骤
基因组DNA的提取： 0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎
加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入2mL匀浆液混匀
匀浆液转入2mL小指管，40C , 5000rpm离心2min,
沉淀加0.4mL无菌水，吹散，再加0.4mL酶解液，慢慢颠倒混 匀
550C 水浴酶解过夜或2小时以上，40C存放
三、试剂：
1. 组织匀浆液 200 mL 灭菌备用 10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 25mmol/L EDTA 100mmol/L NaCl
2. 酶解液 100 mL （灭菌后再加蛋白酶K和SDS) 20mmol/L Tris-HCl pH 8.0 50mmol/L EDTA 200mmol/L NaCl 200ug/mL蛋白酶K 1％SDS