骨骼肌核质线粒体分离技术

骨骼肌组织分离细胞核、胞浆、线粒体

1 50mg胫前肌组织，置于已预冷的玻璃培养皿，用剪刀剪碎。

2 剪碎的组织加入300-500uL STM buffer，于冰上研磨1min以使均质化

（using a tight-fitting Teflon pestle attaché to a potter S homogenizer set to 600-

1000rpm），检查组织是否已均匀化，若否，重做均质化步骤。

3 均质化组织加入离心管，冰浴30min，最大速度离心15秒，4℃。然后800g

离心15分钟。沉淀标志为P0，上清S0。

沉淀P0

4 沉淀P0为细胞核和细胞碎片残骸。用300-500uL STM溶液重悬，最大速度vortex 15秒，500g离心15min 。沉淀标为P1，上清S1弃去。此时可以用显微

镜检测细胞核纯度：取P1少量溶于台盼蓝溶液，放入血球计数器（haemocytometer）显微镜下检测，若其中含有很多细胞碎片，则重复此步操作。

5 此步为提高P1的纯度：将步骤4沉淀重悬于300-500uL 的STM溶液，最大

速vortex 15秒，然后1000g 离心15min ，沉淀标识为P5 ，上清S5弃去。

6 用200-500uL 的NET重悬，用枪头吹打至均匀（using a pipette to triturate until homogeneous），最大速vortex 15秒，置冰上30min ，该组分即含有nuclei组分，超声（at a high setting for 10-15s with 30s pauses whilst being kept on ice throughout.）9000g 离心30分钟，4℃。上清S6 即为nuclear fraction。

上清S0

7 S0：cytosolic and mitochondrial fractions 。离心800g ，10min ，上清S2保留，沉淀P2可弃去亦可与P0合并。

8 S2 11000 g 10min 离心，上清S3（包含cytosol and microsomal fraction）用冷

的纯（100%）丙酮在-20℃沉淀至少1小时后12000 ，5min 。沉淀P7重悬于

100-300ul的STM buffer，标志为 cytosolic fraction，其中可能包含一些微粒体（microsomal content）。

9 沉淀P3重悬于100-200uL的STM ,11000g 离心10分钟，沉淀P4为线粒体组分。该组分重悬于SOL buffer，超声（at high seting for 5-10 seconds with 30 second pauses ）标志为 mitochondrial fraction。

Buffers:

STM:

250mM sucrose

50mM Tris-HCl pH7.4

5mM MgCl2

Protease and phosphatase inhibitor cocktails

NET

HEPES pH 7.9

MgCl2 0.5M

EDTA 0.2mM

Glycerol 20%

Triton-X-100 1%

Protease and phosphatase inhibitor cocktails

SOL

Tris HCl 50mM pH 6.8

EDTA 1mM

Triton-X-100 0.5%

Protease and phosphatase inhibitor cocktails

文献：a simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue。