MTT法检测细胞活力
细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检测方法1.细胞计数法细胞计数法是最常用的细胞增殖检测方法之一、该方法通过显微镜观察细胞密度和数量来判断细胞的增殖情况。
首先，将培养皿中的细胞样本取出，使用显微镜观察细胞的形态和数量，然后用显微镜同时观察已知数量的细胞，计算出单位面积或体积中的细胞数量，最后通过比较细胞数量的变化来评估细胞的增殖情况。
2.三(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑盐(MTT)法MTT法是一种常用的细胞活力检测方法。
MTT是一种黄色噻唑盐，可以通过还原作用转化为紫色的甲氧基-4-硝基苯胺（formazan），这个转化过程是仅在活细胞中发生的。
首先，将MTT溶液加入细胞培养皿中，细胞内的活细胞色素（还原酶）可以将MTT转化为紫色的formazan。
然后，用溶剂将formazan溶解，测量溶液的吸光度，就可以通过测量吸光度的变化来评估细胞的活力。
3.荧光素酶体积法（ATP法）ATP法是一种用于检测细胞的能量代谢水平的方法。
ATP是细胞内的能量分子，在细胞进行代谢活动时会不断产生。
将细胞样品加入含有高能底物的反应溶液中，ATP酶将底物中的ATP转化为体积比较大的荧光素酶（luciferin）。
接下来，荧光素酶与荧光素生成一个反应产生的发光，发光强度与ATP浓度成正比。
通过测量发光强度来评估细胞的活力。
4.分子探针染色法分子探针是一种与特定分子结合的荧光标记物质，可以通过显微镜观察细胞中特定分子的分布和浓度。
常用的分子探针有细胞核染色剂（如DAPI），线粒体染色剂（如JC-1），胞质钙染色剂（如Fluo-3）等。
将细胞与特定分子探针共同孵育，根据分子探针的荧光强度和分布情况，可以评估细胞内特定分子的含量和活动水平，从而间接评估细胞的增殖和活力。
5.流式细胞术流式细胞术是一种基于细胞的物理和化学性质，通过细胞悬浮液在液体流动中的传递和分析的技术。
通过染色、抗体标记、荧光探针等方法，可以区分和分析细胞的不同类型和状态。
MTT法检测细胞活力精讲
耐药性机制研究
通过MTT法可以研究肿瘤 耐药性的机制，了解耐药 相关基因和蛋白的表达及 功能。
逆转耐药性
MTT法可用于筛选能够逆 转肿瘤耐药性的药物或分 子，提高肿瘤治疗的疗效。
注意事项与局限性
01
02
03
04
实验条件控制
细胞状态与培养时间
干扰因素
仅适用于贴壁细胞
MTT法的实验条件需严格控制 ，以确保实验结果的准确性和 可靠性。
细胞类型特异性
MTT法在不同类型的细胞 中表现出不同的敏感性， 可用于研究不同细胞类型 的毒性特征。
细胞凋亡检测
通过MTT法可以检测细胞 凋亡的发生，了解凋亡相 关基因和信号通路的活性。
在肿瘤耐药性研究中的应用
肿瘤耐药性评估
MTT法可用于评估肿瘤细 胞对化疗药物的耐药性， 为制定有效的治疗方案提 供依据。
通过MTT法可以研究药物的作用机制， 了解药物对细胞生长、增殖和凋亡等 方面的影响。
药物浓度与细胞毒性关系
通过MTT法可以观察不同浓度的药物 对细胞活力的影响，从而确定药物的 毒性阈值和安全使用范围。
在细胞毒性研究中的应用
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细胞毒性评估
MTT法可用于评估不同因 素对细胞造成的毒性作用， 如化学物质、辐射、病毒 等。
80%
细胞毒性评估
通过比较给药组与对照组的OD值 ，可评估药物的细胞毒性。OD值 降低表明药物对细胞活力产生负 面影响。
02
mtt法的操作步骤
细胞培养与样品准备
细胞培养
选择适宜的细胞系，在适宜的培 养条件下进行细胞培养，确保细 胞生长旺盛、状态良好。
样品准备
将待检测的细胞样品离心，去除 培养液，并用磷酸盐缓冲液清洗 细胞，去除残留的培养液。
计算细胞活力实验报告
一、实验目的本实验旨在通过MTT/CCK8法检测细胞活力，计算细胞存活率，为后续细胞实验提供数据支持。
二、实验材料1. 细胞系：人胚胎肾细胞系HEK2932. MTT试剂：美国Sigma公司3. CCK8试剂：日本Dojindo公司4. 细胞培养箱：美国Thermo Fisher公司5. 酶标仪：美国BioTek公司6. 细胞培养瓶：美国Corning公司7. 无菌操作台：上海力辰科技8. 移液器：上海力辰科技三、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，待细胞贴壁生长至约80%时进行实验。
2. 实验分组：将细胞分为对照组和实验组，实验组加入一定浓度的药物或化学物质处理。
3. 细胞活力检测：待细胞生长至实验所需状态时，按照以下步骤进行MTT/CCK8法检测。
（1）将细胞悬液以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板中，每组设3个复孔。
（2）培养24小时后，对照组加入100μl无药物培养液，实验组加入100μl含有药物或化学物质的培养液。
（3）继续培养24小时后，对照组加入20μl MTT试剂，实验组加入20μl CCK8试剂。
（4）培养4小时后，使用酶标仪检测各组吸光度（OD值）。
4. 数据分析：根据OD值计算细胞存活率，计算公式如下：细胞存活率 = （实验组OD值 - 空白组OD值）/（对照组OD值 - 空白组OD值）×100%四、实验结果实验结果显示，随着药物浓度的增加，实验组细胞存活率逐渐降低，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。
五、讨论本实验通过MTT/CCK8法检测细胞活力，结果表明药物或化学物质对HEK293细胞具有抑制作用，随着药物浓度的增加，细胞活力逐渐降低。
这为后续细胞实验提供了数据支持，有助于了解药物或化学物质对细胞的毒性作用。
六、实验总结本实验采用MTT/CCK8法检测细胞活力，操作简便、快速，结果准确。
细胞活力测试实验报告
通过本实验，了解细胞活力测试的基本原理和方法，掌握MTT法（MTT比色法）测定细胞活力的操作步骤，并分析细胞在不同条件下的活力变化。
实验时间：2023年4月10日实验地点：细胞生物学实验室实验材料：1. 细胞系：人肺上皮细胞（A549）2. MTT试剂：3-（4，5-二甲基噻唑-2-yl）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）3. DMSO（二甲基亚砜）4. 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素5. 细胞培养瓶、细胞培养板、移液器、吸管、试管、离心机、酶标仪等实验方法：1. 细胞培养：将人肺上皮细胞（A549）接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 细胞传代：待细胞生长至约80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代至新的培养瓶中。
3. 实验分组：将传代后的细胞分为实验组和对照组，实验组细胞在特定条件下培养，对照组细胞在正常培养条件下培养。
4. 细胞接种：将实验组和对照组细胞分别接种于96孔细胞培养板中，每孔接种细胞数量为5×104个。
5. 细胞培养：将细胞培养板置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24小时。
6. MTT实验：向每孔细胞中加入20μl MTT试剂，继续培养4小时。
7. 终止培养：弃去孔内液体，向每孔加入150μl DMSO，振荡混匀。
8. 比色：用酶标仪在490nm波长下测定各孔的吸光度（OD）值。
9. 数据分析：计算实验组和对照组的细胞活力，并比较两组间的差异。
1. 实验组细胞活力较对照组显著降低，说明特定条件下细胞活力受到抑制。
2. 不同浓度药物处理的实验组细胞活力呈剂量依赖性下降，说明药物浓度越高，细胞活力抑制越明显。
实验结论：通过MTT法测定细胞活力，可以有效地评估细胞在不同条件下的生长状态。
本实验结果表明，特定条件下细胞活力受到抑制，且药物浓度越高，细胞活力抑制越明显。
实验讨论：1. MTT法是一种简单、快速、灵敏的细胞活力测定方法，适用于多种细胞系和药物筛选实验。
mtt法测定细胞活力的原理
mtt法测定细胞活力的原理MTT法是一种常用的细胞活力测定方法，它通过测量细胞中还原MTT试剂的能力来评估细胞的生存和代谢活性。
MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）是一种黄色水溶性化合物，可被细胞内酶系统还原生成紫色的可溶性甲硫唑酮（formazan）晶体，这种生成的晶体可以用光谱法测定其吸光度，从而间接反映细胞的活力。
MTT法的原理基于细胞代谢活性和酶系统的相互作用。
正常活跃的细胞具有强大的代谢能力，其中含有还原酶（主要为线粒体中的NADH/NADPH依赖的酶）。
当细胞处于正常状态时，这些酶可将MTT试剂还原为可溶性甲硫唑酮（formazan）。
甲硫唑酮的形成需要细胞内的还原酶作用以及细胞内的线粒体呼吸产生的还原型辅酶NADH/NADPH。
因此，MTT法测定的是细胞内还原酶的酶活性以及细胞的氧化还原状态。
MTT法的具体步骤如下：1.培养细胞：将需要测定的细胞以适宜的细胞密度接种于培养皿中，使其在培养基中生长至合适的状态。
细胞的密度和培养时间可以根据实验需要进行调整。
2.甲硫唑酮的制备：将MTT试剂溶于PBS（磷酸盐缓冲液）中，摇晃使其完全溶解，准备工作台上的MTT溶液。
3.细胞处理：根据实验设计，给细胞添加待测物，如药物、激素等，使其暴露于不同的处理条件下。
4.添加MTT试剂：将上述处理后的细胞分别加入到含MTT试剂的培养基中，使细胞与MTT试剂接触。
5.孵育细胞：在适宜的温度和气体环境下，培养细胞和MTT试剂的混合物一段时间（通常为2～4小时），使细胞内酶系统完全还原MTT试剂为甲硫唑酮。
6.溶解甲硫唑酮：去除培养基，向培养皿中加入溶剂（一般为DMSO），使甲硫唑酮溶解。
DMSO具有良好的溶解MTT产物的能力。
7.吸光度测定：将溶剂溶液转移至96孔板或玻璃瓶中，使用酶标仪或分光光度计测定甲硫唑酮的吸光度。
细胞活力研究检测指标
细胞活力研究检测指标细胞活力研究通常涉及多种检测指标，以评估细胞的生理状态、代谢活性和功能。
以下是一些常见的检测指标：1. 细胞增殖能力：1)MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）试验：通过测量活细胞中线粒体脱氢酶的活性来评估细胞增殖。
2)CCK-8（Cell Counting Kit-8）试验：类似于MTT，但使用水溶性四唑盐WST-8，减少了实验步骤。
3)BrdU（5-溴脱氧尿苷）掺入试验：通过检测BrdU在DNA合成期的掺入来评估细胞增殖。
2. 细胞存活率：1)细胞计数：直接使用血球计数板或自动细胞计数器计算活细胞数量。
2)台盼蓝染色：排除法，活细胞不会吸收台盼蓝，死细胞会被染成蓝色。
3. 细胞凋亡检测：1)Annexin V/PI染色：通过流式细胞仪检测细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和细胞膜完整性来识别早期和晚期凋亡细胞。
2)TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记）试验：检测DNA断裂，是细胞凋亡的标志。
4. 细胞周期分析：流式细胞仪：使用PI或Hoechst染料对DNA进行染色，分析细胞周期分布。
5. 细胞代谢活性：1)ATP含量测定：ATP是细胞能量代谢的重要指标。
2)乳酸脱氢酶（LDH）释放：衡量细胞膜完整性和细胞损伤程度。
6. 氧化应激指标：1)ROS（活性氧物种）检测：使用荧光探针如DCFH-DA进行检测。
2)抗氧化酶活性：如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。
7. 蛋白质和基因表达：1)Western blot：检测特定蛋白质的表达水平。
2)qPCR（实时定量聚合酶链反应）：检测特定基因的mRNA表达水平。
8. 细胞信号通路活性：磷酸化蛋白检测：通过Western blot检测特定蛋白的磷酸化状态来评估信号通路的激活。
9. 细胞粘附和迁移能力：1)划痕试验：评估细胞迁移能力。
2)侵袭和迁移试验：使用Transwell小室评估细胞的侵袭和迁移能力。
MTT法检测细胞活力讲解
评估细胞因子对免疫细胞活性的影响
实验中遇到的问题与解决方案
问题一
细胞培养污染导致实验结果异常
解决方案
严格控制细胞培养环境，定期进 行细胞污染检测
问题二
不同批次细胞生长状态不一致
解决方案
加强实验操作培训，提高实验员 操作水平
问题三
MTT法操作过程中出现误差
解决方案
标准化细胞培养条件，确保细胞 生长状态一致
可见光下稳定
MTT结晶在可见光下稳定，不易分解，因此可以长 时间保存和测量。
细胞代谢与颜色变化
细胞代谢
活细胞通过代谢将MTT染料还原成蓝紫色结晶，结晶的数量与细 胞活性成正比。
颜色变化
随着结晶的形成，培养液的颜色逐渐由黄色变为蓝紫色，颜色的 深浅与细胞活力成正比。
细胞活力的判定标准
80%
细胞存活率
荧光染色法
利用荧光染料对活细胞进行染色，通 过荧光显微镜观察荧光信号判断细胞 活力。
mtt法与其他方法的优缺点比较
染色法
操作简单，但主观性强，误差 较大。
代谢活性检测
客观准确，但试剂成本较高。
荧光染色法
灵敏度高，但操作复杂，需要 荧光显微镜。
MTT法
操作简便，成本低，结果准确 可靠。
选择合适的细胞活力检测方法的原则
经验总结与未来展望
经验总结
MTT法是一种简单、可靠的检测细胞 活力的方法，但在实验过程中需要注 意避免污染、误差等问题。
未来展望
随着细胞生物学研究的深入，MTT法 将会有更多的应用场景，如药物筛选、 免疫疗法评估等。同时，需要不断优 化实验条件和方法，提高实验结果的 准确性和可靠性。
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MTT细胞计数及活力测定
MTT细胞计数及活力测定MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。
活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以用酶标仪在570nm 处进行测定。
在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。
由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会有反应。
台盼兰用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。
利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。
二、仪器、用品与试剂1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计），青霉素小瓶2、试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、DMSO3、材料：细胞悬液三、操作步骤（一）细胞计数1、细胞用胰酶消化后，加入DMEM终止，彻底重悬，室温静置5min，吸取上清至新的15mlEP 管中，1000rpm×10min，弃上清，沉淀用DMEM充分重悬。
2、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
3、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。
4、静置3分钟。
5、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。
然后按下式计算：细胞数/ml＝（4大格细胞总数/ 4）×10000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
（二）细胞活力1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。
2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。
3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。
4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。
MTT法测定细胞相对数和相对活力
MTT法测定细胞相对数和相对活力一、原理噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。
二、试剂材料准备与实验仪器1）对数生长期细胞2）受试因素（药物）3）MTT：以PBS配制成5mg./ml，抽虑除菌，保存在4˚C4）DMSO（二甲基亚砜）5）96孔板6）酶联免疫检测仪7）细胞培养箱三、实验步骤（实用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。
3）加入不同浓度的药物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般3天。
4）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。
5）每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。
7）每孔加入150 ul二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
三、结果统计学处理所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。
可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。
或计算抑制率。
四、注意事项与常见问题1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
实验报告细胞活力
一、实验目的1. 了解细胞活力的概念和测定方法。
2. 掌握MTT法和CCK-8法测定细胞活力的原理和操作步骤。
3. 通过实验验证细胞活力测定方法的有效性。
二、实验原理细胞活力是指细胞生长、增殖和代谢的能力。
细胞活力测定是细胞生物学和分子生物学实验中常用的技术，用于评估细胞增殖和细胞毒性。
常用的细胞活力测定方法有MTT法、CCK-8法等。
1. MTT法：MTT法是一种通过检测细胞代谢产物（如NADH）还原MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四唑溴化物）生成甲紫（Formazan）的量来间接反映细胞活力的一种方法。
在一定条件下，活细胞内的脱氢酶可以将MTT还原成甲紫，甲紫呈紫色，其颜色的深浅与细胞活力成正比。
2. CCK-8法：CCK-8法是一种基于细胞代谢产生乳酸脱氢酶（LDH）的原理，通过检测LDH将CCK-8还原成水溶性甲偶氮盐的量来反映细胞活力的一种方法。
在一定条件下，活细胞内的LDH可以将CCK-8还原成甲偶氮盐，甲偶氮盐呈黄色，其颜色的深浅与细胞活力成正比。
三、实验材料1. 细胞：待测细胞系2. MTT试剂：3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四唑溴化物3. DMSO（二甲基亚砜）：用于溶解MTT4. CCK-8试剂：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二硫唑基)-2H-四唑5. 96孔板：用于细胞培养和实验操作6. 细胞培养试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素7. 其他：移液器、吸头、酶标仪、水浴锅、恒温培养箱、超净工作台等四、实验方法1. 细胞培养：将待测细胞系按照一定密度接种于96孔板中，置于恒温培养箱中培养至细胞贴壁生长。
2. MTT法测定细胞活力：（1）将细胞培养至一定密度后，加入MTT试剂，置于恒温培养箱中继续培养；（2）待细胞代谢完成后，加入DMSO溶解甲紫；（3）使用酶标仪在490nm波长处检测吸光度值。
MTT法测定细胞相对数和相对活力
MTT法测定细胞相对数和相对活力一、原理噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。
二、试剂材料准备与实验仪器1）对数生长期细胞2）受试因素（药物）3）MTT：以PBS配制成5mg /ml，抽滤除菌，保存在4˚C4）DMSO（二甲基亚砜）5）96孔板6）酶联免疫检测仪7）细胞培养箱三、实验步骤（适用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。
3）加入不同浓度的药物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般3天。
4）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。
5）每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。
7）每孔加入150 ul二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
三、结果统计学处理所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。
可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。
或计算抑制率。
四、注意事项与常见问题1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
mtt法检测细胞活性原理
mtt法检测细胞活性原理
MTT法是一种常用的细胞活力检测方法，其原理基于细胞内的代谢活性。
以下为实验步骤及原理解释，其中省略了标题：
1. 细胞培养：首先，将需要进行活力检测的细胞进行培养。
常见的细胞培养基包含营养成分和适宜的生长条件，如适温、适湿度和适透气性。
2. 处理样本：将细胞培养至一定密度后，根据实验需要进行不同的处理。
例如，给予药物处理，确保适当时间和浓度。
3. MTT染色液制备：MTT（3-(4,5-二甲基硫酰基)-2,5-二苯基-2H-四唑）是一种黄色体内还原剂，可穿透细胞膜并转化为紫色的维甲酸鞘。
将MTT按照实验需要溶解于无菌磷酸盐缓冲液中，制备MTT染色液。
4. 细胞处理：将处理后的细胞溶液均匀地分配到96孔板中。
为了排除干扰，设置空白对照及阳性对照。
5. MTT染色：向细胞孔中加入MTT染色液，使其与细胞内的还原剂反应。
将细胞培养在37°C的细胞培养箱中，一般为4小时。
6. 结晶溶解：将培养液中的MTT染色产物溶解。
加入溶液（如二甲基亚硫酰胺）使产生的紫色颗粒溶解。
7. 光密度测定：使用酶标仪等工具，测量液体的光密度（OD
值）。
OD值正比于细胞活力。
8. 数据分析：根据不同处理组的OD值，计算细胞活力的百分比。
活力高的样本表现出较高的OD值。
MTT法通过测量细胞内活性代谢物的转化，能够准确反映细胞生长状态和代谢活力。
这种方法广泛应用于药物筛选、细胞毒性测试和细胞增殖研究等领域。
MTT法检测细胞活力讲解
MTT法检测细胞活力
甘肃中医药大学
MTT法目的和意义
检测细胞存活和生长情况 用于评价药物产生的细胞毒作用
原理
• 四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简称MTT • 活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难 溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。 二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶 联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映 活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。 • 在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正 比。
药物的配制
• 浓度 • 体积 • 过滤
MTT的配制
• MTT一般最好现用现配，过滤后4º C避光保存两周内有效，或配制成 5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用 避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当MTT变为灰绿 色时就绝对不能再用了。 • MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配 成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有 关系，因为时间较短。
4.培养时间。100ul的培养液对于10的4～5次方的增
殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话， 细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果， 我们是在48h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不 能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因
最新MTT法检测细胞活力
注意事项
1． 选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每 一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数 条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和 培养时间。
2． 设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空 白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。
实验前应明确的问题
1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板
实验结果统计学处理
所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析， p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。 可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线 曲线，专门公式求IC50（半数抑制浓度 ）。或计算 抑制率。 OD对照组-OD实验组 ×100 % 抑制率 % = OD对照组
MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算 奇怪。特别是新手，20％的波动也是常见的，所以很可能 是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。
注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔 中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样 器操作要熟练，尽量避免人为误差。另外，吹散次数过多 也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。
4.培养时间。100ul的培养液对于10的4～5次方的增
殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话， 细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果， 我们是在48h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不 能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因
为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
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翻转倒扣法：可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）2－3次，比用“
吸”的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助 吸液，但前提是细胞贴壁要比较牢。
MTT法检测细胞活性
MTT法MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
什么是MTT法?又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
最新MTT法检测细胞活力
7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加
培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、 培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物 的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8.避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，
高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增 加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培 养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴 壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预 实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下 的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间， 以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形 成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降 低，太少观察不到差异。
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MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算 奇怪。特别是新手，20％的波动也是常见的，所以很可能 是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。
注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔 中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样 器操作要熟练，尽量避免人为误差。另外，吹散次数过多 也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。
实验结果统计学处理
所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析， p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。 可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线 曲线，专门公式求IC50（半数抑制浓度 ）。或计算 抑制率。 OD对照组-OD实验组 ×100 % 抑制率 % = OD对照组
翻转倒扣法：可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）2－3次，比用“
四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力
四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力一、实验目的掌握MTT法检测细胞活力的方法。
二、实验原理四甲基偶氮唑盐(MTT)为淡黄色粉末，水溶性好，易通过细胞膜而进入细胞。
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶于水的紫色结晶物甲躜，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
一般情况下结晶物的生成量与活细胞数成正比。
酸性异丙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)或二甲亚砜(DMSO)均能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，溶液颜色的深浅与所含的甲躜量成正比。
用酶标仪在5 7 0nm波长处测定其吸光度OD值(A570nm)，可间接反映活细胞数。
MTT法简单快速、准确，广泛用于新药筛选、细胞毒性试验及肿瘤放射敏感性等实验中。
它与前述细胞计数法等方法相关性良好，也可用MTT法测定细胞生长曲线。
三、实验器材仪器二氧化碳培养箱、酶标仪、9 6孔细胞培养板、可调微量移液器、微孔板振荡器等。
试剂MTT溶液：MTT溶于pH7.4的0。
0 1mol／L PBS液中，磁场搅拌3 0分钟，过滤除菌，配制成2m9／ml的MTT液，4℃冰箱贮存。
二甲亚砜(DMSO)分析纯。
细胞培养基。
材料对数生长期的KB细胞或其他贴壁培养传代细胞。
四、实验步骤接种细胞取对数生长期细胞，0.2 5％胰酶消化，加含血清培养基终止消化并吹打成单细胞悬液(悬浮细胞则不需消化)，台盼蓝染色计数(取5 0l细胞悬液，加等量的0.4％台盼蓝染液，正置或倒置显微镜下用血细胞计数板计数活细胞，不着色者为活细胞)后稀释,以6000--40000个细胞／孔接种于96孔培养板(应根据细胞体积及生长速度确定接种浓度，使实验结束时吸光度与活细胞数呈线性关系，吸光度在0．2,--1．5之间)，每孔接种体积为l00>1，另外设空白对照孔，只加完全培养基。
在37℃、含5％CO2、饱和湿度的培养箱内常规培养一段时间(根据实验目的决定培养时间长短。
如果是药物处理需要在培养24小时后换成含不同度实验药物的培养液和对照药或培养基对照，每孔l00μ1，每组设4个复孔，继续培养48h)。
细胞活力检测方法
细胞活力检测方法细胞活力是指细胞在一定条件下维持其生理功能和代谢活动的能力。
细胞活力的检测对于细胞生物学研究和药物筛选具有重要意义。
在科研实验和临床诊断中，常常需要对细胞活力进行检测，以评估细胞的生理状态和药物对细胞的影响。
本文将介绍几种常用的细胞活力检测方法。
一、MTT法。
MTT法是一种常用的细胞活力检测方法。
其原理是将细胞悬液加入含有MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）的培养基中，MTT会被还原为紫色的甲苯胺盐晶体，细胞内的线粒体活性与MTT的还原能力成正比。
通过洗涤、去除培养基、加入溶解剂等步骤，最终可以测定细胞内甲苯胺盐晶体的光密度，从而间接反映细胞活力。
二、CCK-8法。
CCK-8法是一种快速、灵敏的细胞活力检测方法。
CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一种含有WST-8的生化试剂，WST-8在细胞内受还原后形成橙黄色的水溶性甲醛盐类产物。
细胞活力与WST-8的还原能力成正比。
CCK-8法操作简便，结果稳定可靠，适用于高通量筛选和细胞毒性测试。
三、荧光素酶标记法。
荧光素酶标记法是一种用于检测细胞活力的生物学方法。
该方法通过将荧光素酶基因转染到目标细胞中，当细胞活力较高时，荧光素酶基因表达水平较高，从而产生强荧光信号。
通过检测荧光信号的强弱，可以间接评估细胞的活力状态。
四、细胞膜透漏性检测法。
细胞膜透漏性检测法是一种直接测定细胞膜完整性的方法。
该方法利用细胞膜透漏性与细胞活力之间的关系，通过测定细胞内外液中特定物质的浓度变化，来评估细胞的活力状态。
常用的指标包括细胞内酶的释放、荧光染料的渗透等。
综上所述，细胞活力检测是细胞生物学和药物研发中的重要内容。
不同的检测方法各有特点，选择合适的方法需要根据实验的具体要求和条件来确定。
在进行细胞活力检测时，需要严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文介绍的内容能对细胞活力检测方法有所帮助。
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