慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠

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慢病毒载体法制备转基因动物研究进展

慢病毒属于逆转录病毒科。慢病毒感染宿主细
是最常用的转基因方法，而慢病毒载体技术属于逆转录病毒载体法。２显微原核注射法和逆转录病毒载体法显微原核注射法是最常用的转基因方法，实在
胞后，病毒ＲＮＡ反转录为ＤＮＡ后可以整合到宿主细胞的染色体上并长期稳定表达。与其他逆转录病
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动物医学进展。０８２（）６ —７２０，９２：４６
ＰｒｇｅｓｉｅｅｉｒｅｉｉｏｒｓｎＶｔｒｎａｙＭｄｃｎｅ
慢病毒载体法制备转基因动物研究进展
刘吉宏。李峰。郝子悦，，，。李碧春陈学进。，
（．州大学动物科学与技术学院．１扬江苏扬州２５０；．国科学院上海生命科学研究院生物化学与２０９２中
细胞生物学研究所．海２０３；．海交通大学医学院．海２０９）上００ｌ３上上００２
年美国科学家Ｐｌｔｒａｍｉ等将大鼠生长激素（ｅＧＨ）基因导人小鼠受精卵雄性原核中获得超级转基因鼠。
这种将外源性基因用试验方法插人动物生殖细胞的
基因组而获得具有插人基因特性，能正常繁衍的并
动物称为转基因动物（ｔａｓｅｉａｉｌ）ｒｎｇｎｃｎｍａｓ。转基因技术已渗透到生物学、医学、牧兽医学等领域，畜

小动物活体成像技术原理及常见问题分析

小动物活体成像技术原理及常见问题分析活体成像技术是指应用影像学方法，在不损伤动物的前提下，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。

通过这项技术可以非侵入式、直观地观测活体动物体内肿瘤的生长，转移、疾病的发展过程、基因的表达变化等生物学过程。

与传统剥瘤称重测量的方法相比，活体成像能够对同一种实验对象在不同时间点进行观察，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)，数据更加真实可信，成本更低，灵敏度更高。

目前活体成像技术主要采用生物发光（Bioluminescence）与荧光（Fluorescence）两种技术，生物发光技术是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或者DNA，而荧光技术则是应用荧光蛋白（如GFP,RFP,Mcherry等）标记细胞或是蛋白等研究对象。

其中生物发光技术因其操作简单，反应灵敏，在肿瘤，分子互作及信号传导等研究中得到了广泛应用。

LUC荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是来自北美萤火虫（Photinus pyralis）体内的荧光素酶。

萤火虫荧光素酶属于加氧酶（oxygenase），其发光反应需要O2和Mg2+参与；有辅酶A（CoA）存在时能提高反应效率，增加发光时间。

萤火虫荧光素酶无需翻译后修饰，即可表现出荧光素酶活性。

将萤火虫荧光素酶的基因插入慢病毒介导的载体中，通过CAG启动子过表达从而作为报告基因，在细胞中表达。

常用于细胞标记后小动物细胞移植活体成像追踪，从而评估移植后细胞的归巢以及治疗效果等。

GFP绿色荧光蛋白1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。

其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。

这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子（Ca2+）可产生交互作用。

将绿色荧光蛋白的基因插入慢病毒介导的载体中，通过flap-Ub启动子过表达从而作为报告基因，在细胞中表达。

慢病毒载体介导的转人ahsp基因的β654地中海贫血小鼠的制备

［ｂｔａｔＡｓｃ］Ｏｂｅｔｅｏｏｔｎｈｍｎｃｈｍｇｏｉｔｉｚｇｐｏｅ（ｓ）ｔｎｇｎｃ１ｔａｓｅｉｍｉ．Ｍｅｈｄ：ｒｊｃｉ：Ｔｂａｕａ￣ｅｏｌｂｎｓｂｌｉｒｔｉａｐｒｓｅｉ３ｈｌｓｍａｃｖｉ－ａｉｎｎｈａ￣－ａｅｔｏｓ
通讯生技术ＬＩＮＢＩＴＮＯＬＥｒ１ＲＳＩＯＥＣＨＴＩＥＯＧＹＶｌ１ｌ．ｏ．０８ｏ９Ｎ。６Ｎ。・０・、・ｏ０Ｖ，ｖ，２，、Ｈ
…
．
８３３
文章编号：Ｏ—０２Ｏ８６０３一３１９０Ｏ（０） —８３Ｏ０２０
研究报告
慢病毒载体介导的转人ａｓ因的Ｉｈｐ基３地中海贫血小鼠的制备
王宝斌，或聃，歆冰，兆瑞，方郭任张敬之
上海交通大学医学遗传研究所，生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与分子生物学重点实验室，卫ｏＢｎＡＮＧｕＤａ，ＧＵＯＸｉ－ｉｇＹ－ｎｎＢｎ，ＲＥＺａ－ｉＨＡＮＧＪｎ－ｈＮｈｏＲｕ，ＺｉｇＺｉ
ＩｓｉｔｆＭｅｉａｎｔｓｈｎｈｉＪａｔｎｉｅｓｔ；ＫｙＬｂｒｔｒｆＥｒｏＭｏｅｕａｉｌｇｆｔｅＭｉｉｔｆｎｔｕｅｏｄｃｌＧｅｅｉ，ＳａｇａｉｏｏｇＵｎｖｒｉｔｃｙｅａｏａｏｙｏｍｂｙｌｃｌｒＢｏｏｙｏｈｎｓｒｏｙ
ｉｔｅｔｉａｅｔｒｔｃｎｔｃｔｓｕｏｖｒｓＴｅｈｍａｈｐｒｎｇｎｃｍｉｅｗｅｅｓｂｅｕｎｌｅｅａｅｙｉ — ｎｏａｌｎｉｒｌｖｃｏｏｏｓｕｔｉｐｅｄｉｕ．ｈｕｎａｓｔｓｅｉｃｒｕｓｑｅｔｇｎｒｔｄｂｎｖｒｓａｙ

慢病毒载体在制备转基因动物中的最新进展

慢病毒载体在制备转基因动物中的最新进展
谭碧君
【期刊名称】《上海畜牧兽医通讯》
【年(卷),期】2010(000)001
【摘要】@@ 慢病毒 (Lentivirus)属于逆转录病毒科(Retrovidae),为RNA病毒,由于这类病毒的一个重要特点是毒粒中含有依赖 RNA的多聚酶即逆转录酶 ,故现名为逆转录病毒[1].慢病毒载体(Lentivirus vectors)与简单的逆转录病毒载体相比,具有可感染分裂细胞及非分裂细胞,转移基因片段容量较大,目的基因表达时间长,不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前制备转基因动物的载体之一.性.近些年发展的慢病毒载体不论从理论上还是实践中都具有广阔的应用前景.
【总页数】2页(P18-19)
【作者】谭碧君
【作者单位】长沙理工大学化学与生物工程学院,湖南,长沙,410077
【正文语种】中文
【相关文献】
1.慢病毒载体在转基因动物研制中的应用 [J], 刘茵
2.慢病毒载体法制备转基因动物研究进展 [J], 黄黎珍;刘光泽;顾为望
3.慢病毒载体法制备转基因动物研究进展 [J], 刘吉宏;李峰;郝子悦;李碧春;陈学进
4.转基因动物中慢病毒载体包装的优化 [J], 谭碧君
5.用慢病毒载体制备转基因动物的研究进展 [J], 邓继先;沈伟
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红色荧光和绿色荧光转基因小鼠模型的建立

红色荧光和绿色荧光转基因小鼠模型的建立冯娟*，高苒*，全雄志，邸冉，董伟，马春梅，黄澜，刘亚莉，曹兴水，秦川**，张连峰**（中国医学科学院实验动物研究所中国协和医学院比较医学中心，北京100021）【摘要】目的建立红色荧光和绿色荧光转基因小鼠，为活体荧光影像系统建立重要的实验动物模型。

方法把DsRed-Express和EGFP基因插入chickenβ-actin 强启动子下游构建转基因载体，建立红色荧光和绿色荧光转基因C57BL/6J小鼠。

PCR鉴定红色荧光和绿色荧光转基因小鼠的基因表型，活体荧光影像系统分析红色荧光和绿色荧光转基因小鼠，荧光显微镜检测红色荧光和绿色荧光转基因小鼠全身组织器官的病理改变。

结果分别建立了3个系的红色荧光和3个系的绿色荧光转基因小鼠。

活体荧光影像系统分析转基因小鼠分别呈现红色荧光和绿色荧光。

经荧光显微镜观察，DsRed-Express转基因小鼠的红色荧光蛋白在多个组织器官中才表达，尤其在胰腺、肝脏、肾脏和脾脏等器官表达量较高。

EGFP转基因小鼠绿色荧光蛋白在全身各个组织器官中表达，尤其在胰腺、心脏、小肠、外周血细胞和脑组织等器官组织中表达量较高。

结论DsRed-Express和EGFP基因在转基因小鼠中系统性高表达，成功建立了红色荧光和绿色荧光转基因小鼠。

DsRed-Express和EGFP转基因小鼠将成为活体荧光影像系统的重要实验动物模型。

【关键词】RFP；GFP；转基因；动物模型T he establishment of the Red Fluorescenceand Green Fluorescence Transgenic Mouse ModelsFeng Juan*,Gao Ran*,Quan Xiongzhi,Di Ran,Dong Wei,Ma Chunmei,Huang Lan,[基金项目]北京市转基因平台建设项目TC2006-02（Z0006303041231）[作者简介]*共同第一作者；冯娟（1978-），博士研究生，研究方向：分子病理学。

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达【摘要】本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统，并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。

应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道（PPT）元件、泛醌启动子（PUB）和绿色荧光蛋白基因（GFP）连接至pLO134载体，构建成pTK153载体。

之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统（包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV G）共转染293T细胞，12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞，在荧光显微镜下和应用流式细胞仪（FACS）观察感染情况。

结果表明：慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，FACS分析转染效率为（63.04±7.24）%，病毒滴度测定为（3.09±0.61）×106 U/ml。

感染小鼠T淋巴细胞后，荧光显微镜下观察到GFP的表达，FACS分析转导效率为（37.98±6.26）%。

结论：成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体，对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。

【关键词】慢病毒载体 T淋巴细胞绿色荧光蛋白基因Expression of Green Fluorescent Protein Gene in Mouse T Lymphocytes Mediated by Lentiviral VectorKey words lentiviral vector; mouse T lymphocytes; green fluorescent protein geneJ Exp Hematol 2007; 15(1):125-128逆转录病毒载体（retroviral vector， RV）系统已被广泛应用于临床前及临床的基因转移研究，虽然对其复制以及转导外源目的基因至细胞的相关机理研究得较为深入，但是逆转录病毒载体不能有效转导非分裂期细胞，因而其应用于临床基因治疗受到了一定的限制［1］。

鼠VEGF红色荧光慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

鼠VEGF红色荧光慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达王东洋;贾路;陈翀;李艳杰;曾令宇【期刊名称】《四川大学学报：医学版》【年(卷),期】2010(41)2【摘要】目的构建含鼠血管内皮细胞生长因子(mVEGF)红色荧光慢病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达。

方法构建含mVEGF和红色荧光蛋白(DsRed)基因双顺反子重组慢病毒质粒;采用脂染法将慢病毒系统三质粒共转染293T细胞,转染后24 h和48 h荧光显微镜下观察DsRed表达,收集48 h和72 h病毒上清并感染靶细胞239T,荧光显微镜下观察DsRed表达情况,并行Western blot分析培养上清和胞浆内mVEGF表达。

结果成功构建慢病毒表达质粒pTK208-mVEGF-IRES-DsRed,重组慢病毒滴度达5×106PFU/mL,并获得蛋白DsRed和mVEGF的表达。

结论含mVEGF红色荧光慢病毒质粒成功介导mVEGF蛋白的表达,该载体有望为研究VEGF的病理生理学机制及基因靶向治疗提供有效的工具。

【总页数】5页(P199-202)【关键词】慢病毒载体;血管内皮细胞生长因子;红色荧光蛋白;293T细胞【作者】王东洋;贾路;陈翀;李艳杰;曾令宇【作者单位】徐州医学院移植免疫实验室;徐州医学院附属医院血液科实验室【正文语种】中文【中图分类】R392.4【相关文献】1.人骨诱导因子和绿色荧光蛋白基因共表达慢病毒载体的构建和鉴定及在HT-29细胞中的表达 [J], 霍永旭;李宇;刘雁军;郭元彪;杨春蕾;赵聪2.大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶1重组慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达[J], 蔡德丰;范建高;陆元善;刘兰;蔡小波3.小鼠骨生成诱导因子基因逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达 [J], 郑翠侠;张晓娜;韩兵;宋怀东;马勤耘4.人IL-17F重组逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的稳定表达 [J], 谢宇锋;盛伟华;缪竞诚;杨吉成5.人釉原蛋白基因重组慢病毒载体的构建及在293T细胞中的表达 [J], 程岚;束蓉;宋忠臣;张秀丽;薛京伦;陈金中;田聆;黄璐因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠

慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠贾俊双;孙妍;姚开泰;肖东;肖高芳;林晓琳;张晟;姚志芳;杜文婷;申红芬;刘科;饶子亮【摘要】目的利用慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(mRFP)转基因小鼠,并建立转基因小鼠的技术平台.方法将携带mRFP基因的慢病毒注入ICR鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔代鼠,然后应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等鉴定并获得mRFP转基因鼠.结果移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎40枚给2只假孕母鼠,共获得仔鼠6只;利用体视荧光显微镜检测mRFP表达,在蛋白水平证实6只F0代中,2只 (R3和 R4) 鼠耳高表达mRFP,其余的弱表达mRFP(R1、R2和R5)或荧光强度(R6)与野生型ICR鼠无明显差别,而DNA水平检测证实,6只F0代中,5只(R1、R2、R3、R4和 R5)基因组中整合有外源转基因hUb-mRFP,预示基因型鉴定结果很好验证了体视荧光显微镜鉴定结果.此外,mRFP转基因首建鼠基因组中整合的mRFP基因可稳定遗传和表达.结论建立了慢病毒法快速制备转基因小鼠的技术平台,这为针对不同基因建立相应转基因小鼠以实现恒定或条件性的转基因过表达或RNA干涉 (RNAi),并进而在体内解析相应基因功能和建立人类疾病模型等奠定了坚实基础.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2010(020)002【总页数】6页(P12-16,后插1)【关键词】红色荧光蛋白;慢病毒载体法;转基因小鼠【作者】贾俊双;孙妍;姚开泰;肖东;肖高芳;林晓琳;张晟;姚志芳;杜文婷;申红芬;刘科;饶子亮【作者单位】南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,肿瘤研究所南方医科大学,比较医学研究所暨实验动物中心,广州,510515;南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,比较医学研究所暨实验动物中心,广州,510515;南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,广东省医学实验动物中心,广州,528248;南方医科大学,广东省医学实验动物中心,广州,528248【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q812转基因小鼠已成为研究基因功能、开展发育生物学研究、建造人类疾病动物模型及研究人类疾病发病机制等的最重要的和最佳的模式实验动物［1］。

慢病毒载体的构建及其应用于转基因动物的研究进展

慢病毒载体的构建及其应用于转基因动物的研究进展孙克宁;朱化彬;林峰;王栋;郝海生;杜卫华;赵学明【摘要】为提高慢病毒载体构建水平,提高转基因整体效率,作者综述了慢病毒载体结构及围绕改善生物安全性、提高目标基因装载量、扩大宿主范围而进行的慢病毒载体改造研究发展历程,指出新型慢病毒载体去除了病毒所有辅助基因,引入了外源调控序列,替换了包膜蛋白,大大提高了慢病毒载体的安全性、基因转移效率和表达效率,使宿主细胞类型更广范,而下游表达载体转染方法的研究又为转基因方法的集成与优化奠定了基础.慢病毒载体制备与多种转基因技术的优化集成,将有助于发展简便、高效、经济的转基因新技术,提高转基因技术的整体水平.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)008【总页数】5页(P116-120)【关键词】转基因;慢病毒载体;载体构建策略【作者】孙克宁;朱化彬;林峰;王栋;郝海生;杜卫华;赵学明【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;河南农业大学牧医工程学院,郑州,450002;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;河南农业大学牧医工程学院,郑州,450002;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193【正文语种】中文【中图分类】S813.3转基因技术使人类根据主观意愿定向改变生物体的性状表型成为可能,而载体种类和质量直接关系到后续转基因的效率,所以表达载体构建成为转基因研究的关键环节之一。

相比较而言,质粒载体、噬菌体DNA载体和人工染色体载体需要借助于昂贵的显微操作仪,并因极低的整合率影响了转基因的效率。

转座子载体虽有较好的应用前景并大量应用于低等动物转基因,但由于受构建哺乳动物高效转座子技术瓶颈的限制,近期内很难在高等动物中取得进展。

慢病毒载体的研究进展及应用

慢病毒载体的研究进展及应用张蕊;龚道清【摘要】慢病毒载体是近年来受到广泛关注的一种逆转录病毒载体,具有更安全、转移效率高、可将目的基因整合入宿主基因组和可感染非分裂期细胞等优点,因此有望成为理想的基因转移载体,并在临床和生产实践中广泛应用.作者主要以HIV-1为代表对慢病毒载体的构建及其在基因治疗和转基因动物生产中的应用作一综述.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)006【总页数】5页(P227-231)【关键词】慢病毒;慢病毒载体;基因治疗;转基因动物【作者】张蕊;龚道清【作者单位】扬州大学动物科学与技术学院,扬州,225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬州,225009【正文语种】中文【中图分类】S852.65慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒科(Retroviridae),为RNA病毒,由于这类病毒的一个重要特点是病毒粒子中含有依赖RNA的多聚酶即逆转录酶,故现名为逆转录病毒。

慢病毒已经从绵羊(绵羊脱髓鞘性脑白质炎/慢性进行性肺炎病毒)、山羊(羊关节炎脑炎病毒)、牛(牛免疫缺损病毒)、马(马传染性贫血病病毒)、猫(猫免疫缺损病毒)、猴(猴免疫缺陷病毒)和人(人免疫缺陷病毒)中分离得到(Robl等,2007)。

慢病毒在宿主细胞内,能以病毒RNA为模板在自身反转录酶的作用下合成cDNA,再以此cDNA为模板合成双链DNA,经环化后通过病毒整合酶作用整合在宿主细胞的染色体上并长期表达(李跃萍等,2006)。

慢病毒以其基因组为基础去除部分基因代之以所需的目的基因和标记物,构建而成的慢病毒载体(Lentiviral vector)具有转移效率高、可整合入宿主细胞基因组、包装后更安全并可转染非分裂期细胞等优点,在基因治疗和转基因动物生产中得以广泛的使用。

1 慢病毒载体1.1 慢病毒的基本结构慢病毒载体种类很多,其中对HIV-1的结构和生物学特征的研究较多,而HIV-1型已成为目前较为常用的慢病毒载体系统。

红色荧光蛋白和荧光素酶双报告基因转基因小鼠的建立

《中国癌症杂志》2012年第22卷第5期CHINA ONCOLOGY 2012 Vol.22 No.5321 CHINA ONCOLOGY红色荧光蛋白和荧光素酶双报告基因转基因小鼠的建立张余琴　林晓琳　贾俊双　谢饶英　樊全荣　赵尊兰　杨升　高飞　姚开泰　肖东△南方医科大学肿瘤研究所，△比较医学研究所暨实验动物中心，广东广州 510515 ［摘要］　背景与目的：活体动物体内光学成像(optical in vivo imaging)主要采用生物发光与荧光两种技术。

生物发光是用荧光素酶(luciferase，Luc)基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)进行标记，利用一套非常灵敏的光学检测仪器，能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为，生物发光成像具有高的灵敏度和特异性，同时生物发光信号可用于精确定量，而荧光成像具有方便、便宜、直观、标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点。

本研究基于慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)和Luc双报告基因转基因小鼠(即RL转基因小鼠)，将这两种技术融为一体。

方法：制备携带RFP和Luc基因(简写RL基因)的慢病毒，然后将携带RL基因的慢病毒注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵，胚胎移植进假孕母鼠以获得仔鼠，应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定，并获得RL转基因小鼠。

结果：移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎125枚给6只假孕母鼠，其中4只假孕母鼠怀孕，共生仔鼠20只；利用小动物活体成像仪检测RFP和Luc表达，在蛋白水平证实20只F0代中，3只高表达RFP和Luc；DNA水平检测证实，3只RFP和Luc阳性的小鼠基因组中确实整合有外源转基因RL，预示基因型鉴定结果很好验证了小动物活体成像仪筛选和鉴定结果。

此外，RL转基因首建鼠基因组中整合的RL转基因可稳定遗传至下一代，并能正常表达。

Gateway技术构建小鼠血管生成素-1慢病毒表达载体及其病毒包装

定病毒滴度为５ × １０ＴＵ／ｍｌ。结论
成功构建Ａｎｇ一１慢病毒表达载体，并包装出具高效感染力的慢病毒颗粒，为进一步研究
，腼见群杂杏，２０１３，８６６－８７０］
Ａｎｇ－１基因功能及基因治疗提供实验基础。关键词：血管生成素一１；慢病毒；载体；Ｇａｔｅｗａｙ技术
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８６６・
临床儿科杂志第３１卷第９期２０１３年９月ＪＣｌｉｎＰｅｄｉａｔｒＶｏ１．３１Ｎｏ．９Ｓｅｐ．２０１３
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００ — ３６０６．２０１３．０９．０１７
ｇｉｎｇＬ１Ｑｉｕｐｉｎｇ，ＭＡＸｉｎｎａ，ＺＨＡＮＧＸｉａｏｙｉｎｇ，ＸＵｄｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＳｈｅｎ，ＷＮＡＧＣｈｕｎｚｈｉ，ＦＥＮＧＺｈｉｅｈｕｎ（ＢａｙｉＣｈｉｌｄｒｅｎ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌＡｉｌｆｉａｔｅｄｗｉｔｈＢｅｉｊｉｎｇＭｉｌｉｔａｒｙＲｅｇｉｏｎＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｊｉｉｎｇ１００７００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｃａｒｒｙｉｎｇａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ一』ｎｇ－１）ａｎｄＤｓＲｅｄｇｅｎｅ，ａｎｄｔｏｐａｃｋａｇｅ

制备转基因模型小鼠的基础：人白细胞抗原A＊0206基因慢病毒载体构建及鉴定

制备转基因模型小鼠的基础：人白细胞抗原A＊0206基因慢病毒载体构建及鉴定张修彦;詹纯列;张晓玉【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(019)024【摘要】背景：有研究表明人白细胞抗原-A＊0206亚型与鼻咽癌的发生正相关，但目前还没有相应的转基因动物模型，以用于从整体水平评价HLA-A＊0206与鼻咽癌的关系及进一步研究免疫和基因疗法。

目的：构建 pLVX-CMV-人白细胞抗原-A＊0206-HA-mCMV-ZsGreen 载体，并进行病毒包装，以用于HLA-A＊0206转基因小鼠制作。

方法：合成HLA-A＊0206序列，利用聚合酶链式反应在5’端引入Eco RⅠ酶切位点，在3’端引入Bam HⅠ酶切位点和流感病毒血凝素标签，Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切目的片段及pLVX-CMV-mCMV-ZsGreen质粒，连接酶切产物，转化到大肠杆菌JM109感受态细胞，双酶切及测序鉴定阳性重组质粒，阳性重组质粒与四质粒包装系统共转染表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系293T细胞，产生含目的基因的慢病毒。

结果与结论：凝胶电泳及测序证实人白细胞抗原A＊0206基因成功导入pLVX-CMV-mCMV-ZsGreen骨架质粒，转染293T细胞48 h后的转染率为92%。

荧光法测定病毒滴度，获得病毒滴度约为5×108。

结果证实，实验成功构建了含巨细胞病毒启动子、HLA-A＊0206、流感病毒血凝素标签以及ZsGreen报告基因的慢病毒。

【总页数】5页(P3813-3817)【作者】张修彦;詹纯列;张晓玉【作者单位】广州军区广州总医院动物实验中心,广东省广州市510010【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.Cre重组酶调控的OVA-HBsAg转基因乙肝模型小鼠的制备及鉴定 [J], 李秀梅;刘光泽;陈媚娟;谢勇;孔祥平2.慢病毒载体法在制备转基因小鼠模型中的应用 [J], 于莉娜;张庆玲;丁彦青3.乙肝病毒基因组高效复制与表达转基因小鼠模型的制备与鉴定 [J], 吴金明;林菊生;等4.制备转基因模型小鼠的基础：人白细胞抗原A*0206基因慢病毒载体构建及鉴定[J], 张修彦;詹纯列;张晓玉5.Wip1过表达转基因小鼠模型的制备与鉴定 [J], 高倩;胡言青;唐懿挺;牟玉莲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

慢病毒载体介导红色荧光蛋白基因转染人脑胶质瘤干细胞的实验研究

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用慢病毒载体制备转基因动物的研究进展

用慢病毒载体制备转基因动物的研究进展*邓继先1**沈伟1,2(1军事医学科学院生物工程研究所北京 100071 2西北农业大学动物科技学院杨凌 712100)摘要慢病毒是逆转录病毒的一种,具有逆转录病毒的基本结构,但也有不同于逆转录病毒的组份和特性,作为基因治疗载体发展起来,最近已用于转基因动物制备。

慢病毒像其它逆转录病毒一样,其基因组经逆转录后能整合在宿主DNA 上;由于病毒载体经改构后,不在宿主细胞增殖,不会导致寄主细胞的死亡,被它感染的或转化的动物细胞能够连续传代;这种载体的最大优势是能感染静止细胞和不产生嵌合体动物。

详细介绍了慢病毒载体构建原理、近年慢病毒载体在转基因动物制备方法和应用研究的新进展。

关键词慢病毒载体转基因动物逆转录病毒收稿日期:2004 04 05 修回日期:2004 05 11*国家 863 计划资助项目(2002AA206621)**电子信箱:dengj x@.慢病毒(Lentivirus )属于逆转录病毒科(Retrovidae),为RNA 病毒,由于这类病毒的一个重要特点是毒粒中含有依赖RNA 的多聚酶即逆转录酶,故现名为逆转录病毒。

在这一科里还包括一些RNA 肿瘤病毒(RNA tumorviruses),白血病病毒(Leukoviruses)和致瘤RNA 病毒(Oncobaviruses)等。

慢病毒是一类重要病毒,如人免疫缺陷病毒(HIV)和猴免疫缺陷病毒(SI V)等。

慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag 、pol 和env 3个基本基因结构外,还包含4个辅助基因,vif 、vpr 、ne f 、vpu 和2个调节基因tat 和rev 。

慢病毒载体(Lentiviral vector,LV)作为外源基因载体,已广泛地用于体外细胞的转染和基因治疗的研究[1,2]。

1 非慢病毒的逆转录病毒载体法的发展以前人们将逆转录病毒载体注入小鼠囊胚腔或用高滴度的逆转录病毒载体颗粒感染着床前或着床后胚胎,或直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共育以达到感染目的。

一种慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711270567.0(22)申请日 2017.12.05(71)申请人深圳先进技术研究院地址 518055 广东省深圳市南山区西丽大学城学苑大道1068号(72)发明人詹阳　龚根承　吕泽中　(74)专利代理机构北京品源专利代理有限公司11332代理人巩克栋(51)Int.Cl.C12N 15/867(2006.01)C12N 7/00(2006.01)C12N 15/65(2006.01)C12Q 1/02(2006.01)(54)发明名称一种慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用(57)摘要本发明提供了一种慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述慢病毒载体包括基因元件组成的基因片段，所述基因元件按以下顺序顺次连接：TMEM119启动子、iCre基因、Cx3cr1启动子、loxP位点、DsRed基因和EGFP基因。

本发明的慢病毒可以特异性活体标记小胶质细胞，准确地实时区分小胶质细胞与其他细胞，在研究小胶质细胞的发育、行为和功能等方面具有重要意义。

权利要求书1页说明书6页序列表3页附图2页CN 109868286 A 2019.06.11C N 109868286A1.一种慢病毒载体，其特征在于，包括基因元件组成的基因片段，所述基因元件按以下顺序顺次连接：TMEM119启动子、iCre基因、Cx3cr1启动子、loxP位点、DsRed基因和EGFP基因。

2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体的基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒包括如权利要求1或2所述的慢病毒载体。

4.根据权利要求3所述的慢病毒，其特征在于，所述慢病毒转入小胶质细胞中，TMEM119启动子阳性，启动iCre基因表达，loxP位点重组，Cx3cr1启动子阳性，启动EGFP基因表达，小胶质细胞被标记绿色荧光；优选地，所述慢病毒转入血液循环系统来源的巨噬细胞中，TMEM119启动子阴性，不启动iCre基因表达，loxP位点不重组，Cx3cr1启动子阳性，启动DsRed基因表达，巨噬细胞被标记红色荧光；优选地，所述慢病毒转入不包括小胶质细胞的中枢神经系统的细胞中，TMEM119启动子阴性，不启动iCre基因表达，loxP位点不重组，Cx3cr1启动子阴性，不启动DsRed基因表达，细胞无荧光。

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对不同基因建立相应转基因小鼠以实现恒定或条件性的转基因过表达或ＲＡ干涉（Ｎｉ，进而在体内解析相ＮＲＡ）并应基因功能和建立人类疾病模型等奠定了坚实基础。
【关键词】红色荧光蛋白；慢病毒载体法；转基因小鼠【中图分类号】Ｑ８Ｑ１７．８２【文献标识码】Ａ【文章编号】１７ — ５（０００－１－５６１７６２１）２０２０８０
【ｓｒｃ】０ｂｅｔｅＴｓｂｉｅｈｏｇｌｔｒｏｇｎｒｔｇｔｎｇｎｃｍｃｙｌｔｉｓｄａｄＡｂｔａｔｊｃｉｏｅｔｌｈａｔｃｎｌｉｐａｏｍｆｅｅａｎｒｓｅｉｉｂｎｉｒ・ｉｅｖａｓｏｃｆｒｉａｅｅｖｕｍｅｔ
２１００年２月
中国比较医学杂志
ＣＮＥＳＯＵＲＮＡＬＯＦＣＯＭＰＨＩＥＪＡＲＡＴＩＤＩＩＶＥＭＥＣＮＥ
Ｆｂｕｒｅｒａｙ，２１００Ｖｏ．ＯＮｏ２Ｉ２．
第２Ｏ卷
第２期
慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠
ｍＲＦＰａｓｅｉｉｅＧｅｒｔｄｂｙＬｅｔｖｒｓＭｅａｅｎｌｅｙＴｒｎｇｎｃＭｃｎｅａｅｎｉｉｕ－ｄｉｔｄＧｅｅＤｅｉｒｖ
ＪＡＪｎｓｕｎＩｕ．ｈａｇ，ＸＩａ．ａｇ，ＬＮＸｉｏｌＡＯＧｏｆｎＩａ — ｎ，ＺＨＡｈｎ，ＹＡＯＺｉａｇｉＮＧＳｅｇｈ — ｎ，ＤＵＷｅ — ｎ，ｆｎｔｇｉ
贾俊双，肖高芳，晓琳张晟姚志芳杜文婷申红芬刘科林，，，，，，
饶子亮，孙பைடு நூலகம் 妍，姚开泰，东肖
（方医科大学１南．肿瘤研究所，．比较医学研究所暨实验动物中心，州２广３．广东省医学实验动物中心，州广５８４）２２８５０１；１５５
【要】目的摘
利用慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白（Ｆ）基因小鼠，建立转基因小鼠的ｍＲＰ转并
技术平台。方法将携带ｍＲＰ基因的慢病毒注入ＩＲ鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵，胎移植进假孕母ＦＣ胚
ｄｌｅｆｏｅｇｅｅ（）ｉｔｚｇｔｓｅｉｒｏｒｉｎｇｎＳｎｏｙｏｅ．ＭｅｈｄＭｏｏｒｅｕｒｓｅｔｐｏｅｎ（ｖｙｆｔｏｓｎｍｅｉｒｄｆｏｅｃｎｒｔｉｍＲＦｃｌＰ）ｔｎｇｎｃｍｉｅｗｅｅｒｓｅｉａｃｒｇｎｒｔｄｂｕｚｎｌｉｊｃｉｎｏｅｔｉｓｈｒｏｉｇｍＲＦｅｅｉｔｉｇｅｃｅｔｉｅｇｓｏＣｍｉｅｔｎｅｔｅｅａｅｙｓｂｏａｎｅｔｆｌｎｉｒａｂｒｏｖｕｎＰｇｎｎｏｓｎｌ・ｄｌｆｒｉｚｄｅｇｆＩＲｃｏｉｆｃｌ
鼠以获得仔代鼠，后应用小动物活体成像仪、视荧光显微镜和ＰＲ等鉴定并获得ｍＲＰ转基因鼠。结果移然体ＣＦ
植卵周隙注射有慢病毒的胚胎４０枚给２只假孕母鼠，获得仔鼠６只；用体视荧光显微镜检测ｍＦ共利ＲＰ表达，蛋在白水平证实６只Ｆ０代中，２只（３和Ｒ）鼠耳高表达ｍＦ，余的弱表达ｍＦ（１ＲＲ４ＲＰ其ＲＰＲ、２和Ｒ）荧光强度５或（６与野生型ＩＲ鼠无明显差别，ＤＡ水平检测证实，Ｒ）Ｃ而Ｎ６只Ｆ０代中，５只（１Ｒ、３ＲＲ、２Ｒ、４和Ｒ）因组中整合５基有外源转基因ｈｂｍＲＰ，示基因型鉴定结果很好验证了体视荧光显微镜鉴定结果。此外，ＲＰ转基因首建鼠Ｕ— Ｆ预ｍＦ基因组中整合的ｍＲＰ基因可稳定遗传和表达。结论Ｆ建立了慢病毒法快速制备转基因小鼠的技术平台，为针这