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革兰染色试剂，系列生化基质和指示剂（包括甘露醇、山梨醇、菊糖、 精氨酸试剂、七叶苷水解试剂）。
变异链球菌ATCC25175悬液。
MS琼脂、BHI琼脂培养基、巯基乙醇酸盐转送液，0.2mol/L、pH 7.0～ 的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)等。
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
实验方法：
菌斑 采集 和处 理
染色
漱口、隔湿→ 刮取牙面菌斑
可摘式取菌器或灭菌纸尖 吸取龈沟或牙周袋菌斑
立即置转送液中密闭
震荡、分散菌斑团块
主要实验设备和器材、试剂等：
厌氧培养装置如简易厌氧袋、厌氧罐、厌氧培养箱或厌氧手套箱均可； 普通孵箱，旋涡混合器，微量振荡器，和普通光学显微镜。
可调式移液器、加样头，小试管，三角形推棒，接种环、酒精灯，载玻 片，无菌棉签，96孔反应板，EP管；口腔检查用口镜，镊子，检查盘， 无菌纱球，无菌探针和龈上锄形洁治器。
； 弯曲杆菌：菌细胞呈新月形或弯曲状； 螺旋体：菌细胞宽0.2μm～0.5μm，长约10μm～20μm，螺旋形，
包括大、中、小三种螺旋体。
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
实验结果与分析：
龈上菌斑涂片刚果 红负性染色结果
注意事项：
1.染色操作中，用浓盐酸熏蒸涂片时要小心。 2.该法不能检测细菌的活动性，但染色涂片可长期保存。
取出反应板，加入指 示剂，观察记录结果
振摇混合30秒后，37 ℃孵育4小时-24小时
分别加入100 μl不同的 生化基质，各加2孔
甘露醇 山梨醇
菊糖
精氨酸 试剂
待检菌
阴性对照
阳性对照
七叶苷 水解试 剂
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
生化鉴定——反应板微量快速生化实验名称、试剂及结果：
实验结果及结果评价
表型鉴定——（1）菌落特征观察
初代培养的菌落观察要点：
形态：如水滴状、圆形、丝状、不规则状、根状、梭形等。 大小：菌落直径一般以mm计，注意大小的一致性。 厚薄：扁平、丘状、凸、半球状、瘤状(中央凸)。 颜色：无色、白、黄、红、绿、黑或棕色。 边缘：如整齐、锯齿状、波状等。 透明度：透明、半透明、不透明。 菌落型：光滑、粗糙、黏液样。 溶血型：α、β、γ（限血平板）。
实验原理：
变异链球菌能发酵蔗糖等多种碳水化合物，而其他口腔链球菌不发 酵山梨醇和甘露醇；根据其菌落形态、染色特点及耐氧情况，以其 特殊的生化反应可以分离和鉴定变异链球菌。
实验内容：
菌斑标 本的采 集
处 理
转 送
接种 和培 养
观 察
细菌 表型 鉴定
次代 培养
生化 鉴定
第二节 口腔生物化学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
置浓盐酸 上熏至变 红色
推片置 显微镜 下观察
Listgarten的分类标准：
球菌：菌细胞直径0.5μm～1.0μm，包括少量球杆菌； 直杆菌：菌细胞宽0.5μm～1.5μm，长1.0μm～1.9μm，包括部分
分支杆菌； 丝状菌：菌细胞宽0.5μm～1.5μm，长与宽之比大于6∶1，菌细胞
多为不规则的长丝状杆菌； 梭状菌：菌细胞直径0.3μm～1.0μm，长约10μm，其末端呈梭状
革兰染色特征：阳性、阴性染色,染色均匀性。
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
实验结果及结果评价
生源自文库鉴定：
革兰染色鉴定次代培养 为纯培养后，收集琼脂 表面的菌苔，用PBS稀 释成2×109/ml菌量
取待测的细菌悬 液100μl，加入10 个反应板微孔中
同时加PBS为阴性对照，加 变异链球菌ATCC25175为 阳性对照
涂片
革兰负性染色
观察
观察细菌形态
分类
分类
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
①龈沟内采集法
②牙周袋内采集法
龈沟或牙周袋的龈下菌斑采集法
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
刚果红负性染色方法：
载玻片一端 滴一滴2%刚 果红染液
加入待见 样本混合 后推片
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
革兰染色步骤：
细菌涂片加热固定
加革兰（碱性结晶紫）甲液、 乙液各一滴，混匀后初染30秒
水洗
革兰碘液媒染30秒
水洗
丙酮-乙醇混合脱色 剂脱色5～10秒
水洗
石炭酸复红复染5秒
水洗
干燥后1000倍显微 镜油镜下观察
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
在5%～10%CO2、90%～95%的N2，或80% N2、 10%CO2和10%H2的大气环境下37℃孵育48小时
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
实验结果及结果评价
表型鉴定——（2）菌细胞形态和染色特征观察
菌细胞形态：球形、杆形、球杆形、弯曲状、梭状、菌细胞末 端形状、细胞内有无颗粒、肿胀等。
实验方法：变异链球菌群细菌的分离和表型鉴定
菌斑标本
置转送液中运送
分散、稀释
接种到MS或TS琼脂上
微氧孵育（37℃、5%～10% CO2 48小时）或厌氧孵育（37℃48 小时、90%N2+ 10%CO2或 80%N2+10%CO2+10%H2）
菌落、菌细胞形态检查 次代培养纯化、富集
生化鉴定,确定菌种
实验（缩写） 糖、醇发酵 产生吲哚(IND)
思考题：
刚果红负性染色有何优点？菌斑采集时应该注意什么？
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
实验二 变异链球菌的分离和鉴定
实验目的和要求：
通过对菌落特点和菌细胞形态及革兰染色特征的观察，初步掌握菌 斑标本中变异链球菌的分离、培养和表型鉴定的主要程序和方法， 熟悉牙菌斑中常见细菌的菌落特点、菌细胞形态及革兰染色特点。
口腔生物学实验教程
提要：口腔生物学实验教程是针对口腔生物学理论 课设计的实验指导内容。其教学目的是让学生通过 实验，掌握基本的口腔生物学研究技术和方法，加 深对理论课所学知识的理解，培养学生对口腔医学 基础研究的兴趣，了解基本的科研设计思路，启发 学生的科研思维。
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
变异链球菌ATCC25175悬液。
MS琼脂、BHI琼脂培养基、巯基乙醇酸盐转送液，0.2mol/L、pH 7.0～ 的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)等。
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
实验方法：
菌斑 采集 和处 理
染色
漱口、隔湿→ 刮取牙面菌斑
可摘式取菌器或灭菌纸尖 吸取龈沟或牙周袋菌斑
立即置转送液中密闭
震荡、分散菌斑团块
主要实验设备和器材、试剂等：
厌氧培养装置如简易厌氧袋、厌氧罐、厌氧培养箱或厌氧手套箱均可； 普通孵箱，旋涡混合器，微量振荡器，和普通光学显微镜。
可调式移液器、加样头，小试管，三角形推棒，接种环、酒精灯，载玻 片，无菌棉签，96孔反应板，EP管；口腔检查用口镜，镊子，检查盘， 无菌纱球，无菌探针和龈上锄形洁治器。
； 弯曲杆菌：菌细胞呈新月形或弯曲状； 螺旋体：菌细胞宽0.2μm～0.5μm，长约10μm～20μm，螺旋形，
包括大、中、小三种螺旋体。
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
实验结果与分析：
龈上菌斑涂片刚果 红负性染色结果
注意事项：
1.染色操作中，用浓盐酸熏蒸涂片时要小心。 2.该法不能检测细菌的活动性，但染色涂片可长期保存。
取出反应板，加入指 示剂，观察记录结果
振摇混合30秒后，37 ℃孵育4小时-24小时
分别加入100 μl不同的 生化基质，各加2孔
甘露醇 山梨醇
菊糖
精氨酸 试剂
待检菌
阴性对照
阳性对照
七叶苷 水解试 剂
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
生化鉴定——反应板微量快速生化实验名称、试剂及结果：
实验结果及结果评价
表型鉴定——（1）菌落特征观察
初代培养的菌落观察要点：
形态：如水滴状、圆形、丝状、不规则状、根状、梭形等。 大小：菌落直径一般以mm计，注意大小的一致性。 厚薄：扁平、丘状、凸、半球状、瘤状(中央凸)。 颜色：无色、白、黄、红、绿、黑或棕色。 边缘：如整齐、锯齿状、波状等。 透明度：透明、半透明、不透明。 菌落型：光滑、粗糙、黏液样。 溶血型：α、β、γ（限血平板）。
实验原理：
变异链球菌能发酵蔗糖等多种碳水化合物，而其他口腔链球菌不发 酵山梨醇和甘露醇；根据其菌落形态、染色特点及耐氧情况，以其 特殊的生化反应可以分离和鉴定变异链球菌。
实验内容：
菌斑标 本的采 集
处 理
转 送
接种 和培 养
观 察
细菌 表型 鉴定
次代 培养
生化 鉴定
第二节 口腔生物化学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
置浓盐酸 上熏至变 红色
推片置 显微镜 下观察
Listgarten的分类标准：
球菌：菌细胞直径0.5μm～1.0μm，包括少量球杆菌； 直杆菌：菌细胞宽0.5μm～1.5μm，长1.0μm～1.9μm，包括部分
分支杆菌； 丝状菌：菌细胞宽0.5μm～1.5μm，长与宽之比大于6∶1，菌细胞
多为不规则的长丝状杆菌； 梭状菌：菌细胞直径0.3μm～1.0μm，长约10μm，其末端呈梭状
革兰染色特征：阳性、阴性染色,染色均匀性。
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
实验结果及结果评价
生源自文库鉴定：
革兰染色鉴定次代培养 为纯培养后，收集琼脂 表面的菌苔，用PBS稀 释成2×109/ml菌量
取待测的细菌悬 液100μl，加入10 个反应板微孔中
同时加PBS为阴性对照，加 变异链球菌ATCC25175为 阳性对照
涂片
革兰负性染色
观察
观察细菌形态
分类
分类
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
①龈沟内采集法
②牙周袋内采集法
龈沟或牙周袋的龈下菌斑采集法
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
刚果红负性染色方法：
载玻片一端 滴一滴2%刚 果红染液
加入待见 样本混合 后推片
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
革兰染色步骤：
细菌涂片加热固定
加革兰（碱性结晶紫）甲液、 乙液各一滴，混匀后初染30秒
水洗
革兰碘液媒染30秒
水洗
丙酮-乙醇混合脱色 剂脱色5～10秒
水洗
石炭酸复红复染5秒
水洗
干燥后1000倍显微 镜油镜下观察
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
在5%～10%CO2、90%～95%的N2，或80% N2、 10%CO2和10%H2的大气环境下37℃孵育48小时
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
实验结果及结果评价
表型鉴定——（2）菌细胞形态和染色特征观察
菌细胞形态：球形、杆形、球杆形、弯曲状、梭状、菌细胞末 端形状、细胞内有无颗粒、肿胀等。
实验方法：变异链球菌群细菌的分离和表型鉴定
菌斑标本
置转送液中运送
分散、稀释
接种到MS或TS琼脂上
微氧孵育（37℃、5%～10% CO2 48小时）或厌氧孵育（37℃48 小时、90%N2+ 10%CO2或 80%N2+10%CO2+10%H2）
菌落、菌细胞形态检查 次代培养纯化、富集
生化鉴定,确定菌种
实验（缩写） 糖、醇发酵 产生吲哚(IND)
思考题：
刚果红负性染色有何优点？菌斑采集时应该注意什么？
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
实验二 变异链球菌的分离和鉴定
实验目的和要求：
通过对菌落特点和菌细胞形态及革兰染色特征的观察，初步掌握菌 斑标本中变异链球菌的分离、培养和表型鉴定的主要程序和方法， 熟悉牙菌斑中常见细菌的菌落特点、菌细胞形态及革兰染色特点。
口腔生物学实验教程
提要：口腔生物学实验教程是针对口腔生物学理论 课设计的实验指导内容。其教学目的是让学生通过 实验，掌握基本的口腔生物学研究技术和方法，加 深对理论课所学知识的理解，培养学生对口腔医学 基础研究的兴趣，了解基本的科研设计思路，启发 学生的科研思维。
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版