原代细胞分离纯化SOP

原代肝细胞分离纯化SOP

1、实验目的

分离和纯化原代干细胞，体外研究药物对原代肝脏细胞的毒性

2、实验方法

实验材料：ICR小鼠（20-30g）

实验试剂：20%乌拉坦或水合氯醛

0.1%肝素钠（Glucose 0.2g，0.125mM EDTA 8Ml,肝素钠

0.2g，1Mm HEPS 4.6Ml）

0.025%胶原酶（胶原酶12.5mg，L-15无血清培养基50Ml）

Pecoll分离液：9份Pecoll+1份10×D-PBS（PH7.4）制

成分离液。

3、实验步骤：

1．ICR小鼠禁食过夜。

2．取ICR小鼠，用20%乌拉坦或水合氯醛0.2-0.3ml腹腔麻醉。3．10-15min后固定小鼠，75%酒精消毒腹部后正中切开打开腹腔并更换器械。

4．显露肝门静脉并游离2-3cm；显露游离肝下腔静脉2-3cm，置一结扎线，暂不结扎。

5．穿刺针插入肝下腔静脉后立即结扎固定，尽快接通硅胶管并启动蠕动泵（无泵，输液器亦可）同时剪断肝门静脉远端。

6．从门静脉入肝素，使小鼠全身肝素化，并持续灌注至肝脏呈米黄色。

7．换肝素钠为胶原酶消化液（37℃预热）循环灌注消化，至肝质变软，压之凹陷不易恢复。

8．停止灌注，小心剪取个肝叶置入消毒平皿内，加入约20mlDMEM 培养基（含血清，4℃预冷）祛除纤维结缔组织，制成混合肝脏细胞悬液。

9．200目筛网过滤入15ml离心管，100rpm离心5min。去上清，沉淀加入DMEM培养基（含血清，4℃预冷）7ml重悬。

10．取等体积肝细胞悬液悬浮于Pecoll分离液，颠倒混匀。11．4℃1000rpm离心10min，弃上清液，用PBS清洗肝细胞2次，4℃1000rpm离心10min。

12．肝细胞沉淀加入（含血清）重悬为3ml，取适量计数并用台盼蓝（3：1）判断活率。

13．活率在90%以上的肝细胞按2×103细胞密度接种于96孔板，每孔加入100ul DMEM培养基，于37℃ 5% CO2条件下培养24h。14．将化合物用DMSO稀释到所需浓度，每孔加药1ul（化合物终浓度通常为1000uM起始，10×梯度稀释，6个梯度），空白对照加入1ulDMSO。

15．细胞于37℃ 5% CO2条件下培养24h后，加入100ulATP检测试剂，震荡孵育10min。

16．于酶标仪上读取每孔荧光值。

17．计算各药物处理组细胞存活率。