细胞周期细胞凋亡操作步骤
简述细胞凋亡的过程
简述细胞凋亡的过程
细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式,通常是在细胞受到损伤、感染或疾病等因素诱导下发生的。
细胞凋亡的过程可以概括为以下几个步骤:
1. 细胞受到损伤或感染时,会出现一些信号分子,如DNA损伤调节蛋白(DNA 损伤蛋白)和细胞周期控制蛋白(CDK4/CDK6)等,向细胞内传递损伤信号,促使细
胞发生凋亡。
2. 细胞收到损伤信号后,会启动细胞内的凋亡程序,通过调节一系列基因和蛋白质的表达来诱导细胞凋亡。
其中,细胞凋亡激活因子(例如BCL-2和Bax)和
凋亡诱导蛋白(例如P75和PID)等蛋白会被激活,促进细胞凋亡的发生。
3. 凋亡的发生会导致细胞膜的破裂和细胞核的释放,从而导致细胞凋亡。
同时,细胞核内的DNA会被降解和释放出,从而导致细胞的死亡。
4. 细胞凋亡的过程可以受到多种因素的影响,如细胞内外的压力、化学物质、药物等。
这些因素可以抑制凋亡的发生或加强凋亡的效应。
细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式,对于维护细胞的正常功能和生物学特性具有重要意义。
研究细胞凋亡的过程和机制,对于治疗许多疾病和预防疾病的进展都具有重要的意义。
细胞周期细胞凋亡操作步骤
精品 Word 可修改 欢迎下载 1． 细胞周期a. 取生长状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化为单个细胞，用正常培养基重悬计数，接种于60mm 的皿，每个皿大约接种细胞1X10^6个。
37°C 5% CO2培养1-2天。
b. 当细胞融合度大约80%，细胞处于对数增长期时，用0.25%胰酶消化为单个细胞，1100转离心3分钟。
c. 去掉上清，DPBS 洗1次，每次6mL ，1100转离心3分钟。
d. 去掉上清，0.5mL 冰冷的DPBS 重悬成单个细胞后，逐滴加入70%冰乙醇6mL ，边加边晃动，4度冰箱过夜（乙醇固定作用比较慢，最好多放几天，最好一周内继续做下面的步骤）。
e. 1800转离心5分钟，弃上清，用6mL DPBS 清洗两次，1800转离心5分钟。
f. 用0.5mL PBS 重悬（如果细胞过多，可用更多PBS 重悬，然后取0.5mL ），加入2uL Rnase（100mg/mL ），终浓度为（400mg/mL ），室温作用30分钟。
g. 加入10uL PI ，避光孵育15分钟，可上流式细胞仪检测。
2． Annexin V - FITC/PI 测细胞凋亡。
a. 取生长状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化为单个细胞，用正常培养基重悬计数，接种于6孔板，每个孔大约接种细胞5X10^5个。
37°C 5% CO2培养1-2天。
b. 当融合度大约80%，细胞处于对数增长期时，用0.25%胰酶消化为单个细胞，每个孔用一个15ml 离心管单独收集，1000转离心3分钟。
c. 用2ml DPBS 重悬细胞， 1000转离心3分钟。
d. 用2ml 1 X Banding Buffer 重悬细胞， 并且计数，1000转离心3分钟。
e. 用1 X Banding Buffer 重悬细胞，使细胞密度为1X10^6个/ml 。
取100ul 到一个新的流式管中。
f. 选取正常的细胞三管为补偿管，①双阴性-正常细胞，不加入任何抗体。
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI法)
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI法)产品简介：Leagene细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一种采用经典的碘化丙啶染色(PI staining)方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种可以嵌合到双链DNA和RNA的碱基对中与直接和的荧光染料，无碱基特异性。
碘化丙啶与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。
细胞内的DNA被Propidium Iodide染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。
碘化丙啶染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组DNA片断在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。
细胞凋亡时，流式细胞检测可呈现亚二倍体核型的特征，根据光散射的特点，PI染色可以区分细胞凋亡和细胞坏死的细胞峰型。
细胞凋亡时，出现凋亡细胞皱缩、染色质浓缩、核碎裂，产生凋亡小体，使细胞的前向光散射低于正常。
在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对侧向光散射的能力增加或没有变化。
在细胞凋亡的晚期，前向和侧向光散射的信号均降低。
细胞坏死时细胞多表现为细胞肿胀，因此前向光散射高于正常，对侧向光散射高于正常。
Leagene Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit经常用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测，亦可用于区分细胞凋亡和细胞坏死。
细胞周期和细胞凋亡
性染料标记细胞的DNA和RNA ，通过观察这些
成分的含量变化来区分凋亡细胞。
PI染色后，由于凋亡细胞的DNA含量低于正
常的二倍体含量，会在二倍体峰前出现一个亚二
倍体峰（Sub-G1峰、凋亡峰、AP峰）。可根据
此峰的面积计算凋亡细胞的百分率。
区分细胞碎片和凋亡细胞
又称为程序性死亡
（programmed cell death, PCD）
一.细胞凋亡的特征
形态学特征： 细胞膜向外突起，细胞体积缩小 ↓ 染色质凝缩，然后断裂成碎片 ↓
形成数个大小不等的由膜包裹的凋亡小体
↓ 凋亡小体被邻近细胞吞噬
（2）细胞坏死（necrosis）
概念：细胞受到激烈的物理、化学刺激或 严重的病理性刺激后，引起的细胞损伤和 死亡。 特征：胞膜通透性增高，使细胞肿胀，细 胞器变形或肿大，细胞核破碎，最后细胞 溶解破裂，溶酶体泄漏，引起炎症反应。
凋亡细胞表面有 众多凋亡小体
3、流 式 细 胞 分 析 仪
（Flow Cytometry，FCM）
概念：
流式细胞仪是将流体喷射技术、激光技 术、空气计数、γ-射线能谱术及电子计算机 等技术与显微荧光光度计结合的一种大型的 精密仪器，它通过测量在一定波长的激光激 发快速流动的粒子（细胞或微粒）荧光和散 射激光来获得粒子的一些成分及其变化情况， 进行多参数的、快速的定量分析和分选的技 术。 FCM应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫 学等进入了细胞和分子水平的研究。
ER膜、mi膜上。
②促进细胞增殖的基因
如：c-myc、c-abl、ras相关基因
2.死亡基因
(1)促进细胞死亡的基因 caspase基因家族： Bax基因：Bax过度表达，可拮抗bcl-2的 促进细胞增殖作用及抑制程序性细胞死 亡。
细胞凋亡周期
3细胞凋亡之 caspase检测
• 背景知识
– 细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程 的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶） – Caspase 3是参与DNA维护和调控细胞的重要组分，即Caspase 3激活==细胞凋亡
细胞凋亡之 凋亡相关酶检测
名称
Caspase-1
品牌
CST CST
细胞凋亡之 caspase-3
Jurkat T-Cells
6 µM camptothecin for 4 h
untreated
细胞凋亡之 caspase-3
Jurkat T-Cells
Mouse Thymocytes
固定、破膜过程
细胞凋亡之 caspase-3
产品编号
9602S
原理：JC-1有有单体和多聚体两种存在形式，高浓度时多聚体，发红色荧光（FL2检测）， 低浓度时单体形式，发绿色荧光（FL-1检测）。 正常细胞：膜电位正常，JC-1靠线粒体膜极性进入线粒体内，随浓度升高多聚体，红光 凋亡细胞：线粒体膜电位去极化，JC-1从线粒体释放，浓度降低，转为单体，绿光 通过检测绿色和红色荧光：
细胞
检测方法
免疫荧光
TUNEL法 Annexin V/PI Caspase 通路 线粒体膜电位
核酸
细胞膜 胞内通路
线粒体
细胞生命活动之：细胞周期
2.1细胞周期
细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为 间期与分裂期两个阶段。
2.1.1细胞周期检测原理
利用特殊的荧光染料(PI等)与 细胞内DNA碱基结合，被这些 荧光染料染色的细胞在激光 照射下发射出荧光，荧光强 度与DNA含量成正比。流式细 胞仪通过测定细胞的荧光强 度推算出细胞的DNA含量。
细胞凋亡和细胞周期的调控和信号传导机制
细胞凋亡和细胞周期的调控和信号传导机制细胞是生命体系的基本单位。
在生物体的发育和维护过程中，细胞需要遵循一定的生长和分裂规律。
其中细胞周期和细胞凋亡是最为基本的两种细胞行为。
细胞周期是指细胞从分裂到再生一个新细胞的过程，而细胞凋亡则是细胞主动死亡的过程。
这两种过程的规律和机制的了解对于许多疾病的治疗和研究都具有非常重要的意义。
本文将对细胞周期和细胞凋亡的调控和信号传导机制进行介绍。
一、细胞周期调控和信号传导机制1. 细胞周期的四个阶段细胞周期分为四个阶段：G1期、S期、G2期和M期。
G1期是细胞末次分裂后到DNA复制开始的一个时期，这个时期是细胞可以共沉积配体吸收营养物质的一段生长发育期，由于细胞代谢和复制准备的过程，故G1阶段为整个细胞周期中的最长期。
S期是核内DNA复制的期间，G2期为S期到有丝分裂前的间隔期间，M期是细胞周期的有丝分裂期，完成有丝分裂，分裂成为两个相同的细胞。
2. 细胞周期调控细胞周期的进展是通过CDK蛋白激酶的活化和解除来控制的。
激酶能够与细胞周期蛋白进行特异性配对，并引起细胞周期蛋白的磷酸化。
当细胞周期蛋白与CDK激酶结合后，CDK激酶则会引起细胞周期蛋白的磷酸化和激活。
3. 细胞周期的信号传导生长因子信号和环境信号都可影响细胞周期的进展速度。
例如，生长因子与特定受体结合，可激活Ras信号转导路径，最终导致与细胞周期有关的蛋白激酶CDK的激活。
环境信号也能影响细胞周期的进展，例如，过量的辐射或一些化学物质都能引起细胞周期的停滞或抑制。
二、细胞凋亡调控和信号传导机制1. 细胞凋亡的三大途径细胞凋亡是程序性细胞死亡，凋亡的方式主要有三个途径：内质网应激途径、线粒体途径和死受体途径。
在内质网应激过程中，内质网早期蛋白（ER）的异常积聚可引起细胞周期阻滞和细胞凋亡。
线粒体途径包括线粒体膜潜在分裂和Bcl-2家族蛋白质表达调节。
死受体途径是通过受体-配体作用引起一系列生化反应，并最终激活真核酸酶，导致DNA降解和凋亡。
生物中的细胞周期与凋亡
生物中的细胞周期与凋亡细胞是生命的基本单位，而细胞周期和细胞凋亡是细胞生命中两个极为重要的过程。
细胞周期是指从一个细胞分裂到下一个细胞分裂的整个过程。
一个典型的细胞周期包括四个阶段：G1期、S期、G2期和M期。
在G1期，细胞正在增长，细胞器和分子正在进行复制。
在这个阶段，细胞需要决定是否进入下一个阶段，即S期。
如果细胞决定进入S期，它就会开始复制其DNA。
在S期，细胞复制其DNA，并准备进入下一个阶段，G2期。
在G2期，细胞再次增长并准备进入M期。
在M期，细胞进行有丝分裂或无丝分裂，将其DNA平均地分配到两个新细胞中，并最终分裂成两个新细胞。
细胞周期对生命的维持是极为重要的。
正常的细胞周期对我们的身体健康非常重要，因为它帮助我们的组织、器官和身体部位正常生长和更新。
不同类型的细胞不同的周期长度，例如皮肤细胞约为24小时，肠道上皮细胞约为2至3天，肝脏细胞长达1至2年。
在某些情况下，细胞周期可能发生异常，导致癌症等疾病的发生。
当细胞周期发生异常时，可能会导致细胞凋亡。
细胞凋亡是一个非常重要的生物学过程，它是一个自我毁灭过程，可帮助体内细胞维护平衡，并消除受损或不需要的细胞。
相比于细胞死亡，细胞凋亡是一种有序且可控的过程。
细胞凋亡可以通过两个不同的途径实现：外源性途径和内源性途径。
外源性凋亡途径在细胞的外部发生，由于细胞周围环境的变化，如细胞暴露于化学物质、辐射等有害物质，也可能引起细胞凋亡。
内源性凋亡途径可由细胞内部产生信号引起，这些信号是在细胞周期异常或细胞损伤或其他细胞病理学状况下产生的。
当这些内在信号引起细胞凋亡时，依赖的途径是线粒体途径。
线粒体途径的分子调控网络非常复杂，包括许多的蛋白质以及多种信号分子。
当细胞受到刺激时，这些信号分子会激活一系列的受体，在受体的介导下，信号转移到线粒体，使线粒体的膜通透性发生改变，释放出线粒体内部的多种信号物质，这些信号物质进一步引发一系列的下一步反应，最终导致细胞死亡。
细胞周期实验标准操作流程
细胞周期实验标准操作流程1.种板细胞个数：5mL含5×106个的细胞悬液种在75mL培养瓶中。
2.加药处理足够的时间后，终止反应；3.收集细胞（加药后细胞还需收集培养液中的细胞）；4.PBS洗2次，1000r/min离心10min；5.用1mL的PBS悬浮细胞后置入15mL离心管中，在漩涡振荡器上，边振荡边缓慢加入共9mL体积的70%的预冷冰乙醇。
盖上盖子；6.将固定好的细胞放入-20℃保存（可长期保存，但至少要过夜）；7.使用前，1000r/min离心10min弃去70%冰乙醇，用预冷的PBS洗涤2次；8.用0.5mL的50µg/mLRNase（用PBS配）悬浮细胞后，置37℃水浴中30min；9.最后加入25µL1mg/mLPI（用PBS配），避光染色30min；10.上流式细胞仪Ari aⅢ检测细胞周期。
注意事项：1.做早期凋亡（annexin V和PI双染）实验，需要准备一管未染色的细胞；细胞周期全部样品都需要加入PI染料；2.如果用试剂盒或者之前已经配好Rnase和PI浓度也不要紧。
原则是要求：Rnase和PI的终浓度都能达到50µg/mL。
雪 2011-12-8 9:26:21小莫，做细胞周期实验需要养细胞洪雪 2011-12-8 9:26:29把药物加到细胞里面洪雪 2011-12-8 9:26:38用细胞来测周期的洪雪 2011-12-8 9:27:12你让你老婆先了解一下大概的情况，要是真的想做，再联系我洪雪 2011-12-8 9:27:24我们仪器试运行到这个学期期末洪雪 2011-12-8 9:27:42试运行期间不收费洪雪 2011-12-8 9:28:21不收测试费，但是需要自己准备染料等其他的。
我们只帮测和分析数据缘 10:00:57好的，谢谢缘 10:01:07是你在测吗洪雪 10:03:08是的洪雪 10:03:20她有学生在养细胞吗？缘 10:03:27有啊洪雪 10:03:44在哪里养缘 10:03:48刘观艳在养缘 10:03:54在六楼洪雪 10:04:24那她要测的那几个化合物做过MTT吗？缘 10:04:37做过了10:04:53成功接收文件打开文件打开所在文件夹洪雪 10:04:55那你把这个给她缘 10:04:57好像是在中国药科大学做的洪雪 10:05:06让她按这个来准备做周期的样品洪雪 10:05:35但是她还没有RNA酶和PI呀，这个得买缘 10:05:47这个要多少钱洪雪 10:06:02看你要什么公司的了缘 10:06:10你们经常用的洪雪 10:06:24我们这边用的是SIGMA的洪雪 10:06:47但是这个要至少一个月才买得回来，有点久洪雪 10:07:03你想下其他的办法缘 10:07:06好的洪雪 10:07:18或者去和彭老师借一点洪雪 10:07:26阿远之前用过的洪雪 10:07:30她做过洪雪 10:07:36我之前配了好多洪雪 10:07:40在细胞房缘 10:07:47好的，那我问一下洪雪 10:07:52恩洪雪 10:08:11我们这边上班时间的下午开机。
人类细胞周期的调控和细胞凋亡的机制
人类细胞周期的调控和细胞凋亡的机制细胞是生物体的基本单位，每个细胞都具有自我复制的能力。
然而，细胞的复制必须受到精准的调节，否则就会导致细胞增殖失衡，形成肿瘤等异常现象。
因此，探究细胞周期的调控和细胞凋亡的机制显得尤为重要。
人类细胞周期的调控人类细胞周期被分为G1期、S期、G2期和M期四个阶段。
G1期为细胞增长期，细胞内基因复制的准备工作在这个阶段完成。
S期为DNA合成期，将细胞内的DNA复制一遍，使得在G2期时细胞拥有两分离子相同的DNA。
G2期是复制期，细胞在这个阶段准备分裂所需的物质。
M期为有丝分裂期，是细胞的细胞核分裂和细胞分裂的过程。
细胞周期的调控是由细胞的染色体和激酶等蛋白质调节分子共同完成的。
其中，CDK是一种被广泛应用于细胞周期调节的激酶，在G1/S、S和G2/M期的转换中发挥重要作用。
CDK合成的突变或过量表达会导致异常细胞周期，从而引起癌症等疾病。
细胞凋亡的机制细胞凋亡是细胞主动死亡的一种重要现象，可以有效地控制细胞增殖和维持组织的健康状态。
目前，以细胞凋亡途径最为知名的是线粒体调控的凋亡途径，该途径又称为内质网应激会上止于别的PG的途径。
在线粒体调控的凋亡途径中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）是一个关键调控分子。
线粒体在细胞凋亡过程中会释放细胞色素C和其他激活半胱氨酸蛋白酶的因子，这些因子进而能够切割一些重要的蛋白质，引发细胞凋亡的过程。
此外，Bcl-2家族蛋白资助供给不同的调控分子从而反向阻止线粒体释放激活因子的途径。
大部分Bcl-2家族蛋白通过某些机制来抑制Bax的活性或其上调，从而阻止线粒体释放激活因子。
小结可以看出，细胞周期的调控和细胞凋亡的机制都是细胞自我调节的必然过程，可以有效地控制细胞的增殖和维持组织的健康状态。
因此，深入研究细胞生物学特别是细胞分子生物学的现象，相信是细胞技术和临床医学取得进一步发展的关键。
分子生物学中的细胞周期和凋亡
分子生物学中的细胞周期和凋亡细胞周期和凋亡是分子生物学中两个非常重要的概念。
细胞周期指的是细胞从分裂到分裂的一个阶段，而细胞凋亡指的是受损或衰老的细胞主动死亡的过程。
两者都是细胞生命活动的重要组成部分，也是细胞命运的决定因素之一。
本文将深入探讨细胞周期和凋亡对生命体系的影响，以及分子生物学中的相关研究进展。
一、细胞周期的基本过程细胞周期由四个相（G1、S、G2、M期）组成。
其中，G1期是细胞从上一个分裂到DNA复制的阶段，S期是DNA复制的阶段，G2期是细胞从DNA复制到有丝分裂的阶段，M期是有丝分裂的阶段。
细胞周期的控制主要由细胞周期蛋白（cyclin）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）调节，这两者共同作用起到决定细胞进入不同相状态的作用。
在G1期，细胞通过调控细胞周期蛋白D（cyclin D）的表达来控制细胞周期的起始。
当细胞周期蛋白D与CDK4或CDK6结合后，就可以激活复制起始点（origin of replication，ORI）的启动酶，从而促进细胞复制。
当G1期缺失或CDK4/6被抑制时，细胞进入G0期或处于静止状态。
在S期，细胞周期蛋白E（cyclin E）与CDK2结合，形成复制复合物往外伸长。
同时，另一个细胞周期蛋白A（cyclin A）与CDK2结合，形成新的复制复合物往外伸长。
这样一来，细胞内就会有两个相同的DNA链，完成了DNA复制的任务。
在G2期，细胞周期蛋白A与CDK1结合起来，进一步调控细胞准备进行有丝分裂。
这个阶段的关键是让细胞从DNA复制中恢复过来，细胞周期蛋白A通过调控微管的聚合和动态重构促进细胞分裂。
M期是细胞周期的高潮，这个阶段细胞受到复杂的调节机制，从中央纺锤体运动到染色体涡轮状排列，最终完成有丝分裂。
二、细胞凋亡的基本过程细胞凋亡指的是一组精细的发生在细胞内的程序性死亡过程。
这个过程通常是由一系列特定的信号引导的，它们与细胞周围环境的变化直接相关。
在信号引导下，细胞启动了一系列程序性的生化反应，包括形态改变、膜片状体的分离和线粒体膜的异常增加等。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。
↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析——Flowjo 软件分析图片拷贝：直接Ctrl+CFCM-DNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S 、G2M 。
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of CellApoptosis)2010-05-25 20:06:41 来源：易生物实验浏览次数：197 网友评论0 条细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
关键词：细胞检测单染法细胞凋亡检测Annexin-V-FITCAssayCellApoptosis一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×）60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。
组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一--PI法
组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法schoman无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。
主要操作步骤如下：1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。
2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。
3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。
4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h。
5、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。
注意事项：1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。
如组织难以消化，可加入适量胶原酶。
另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。
2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。
3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。
4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。
其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。
在此不赘述。
yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA 结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。
应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。
偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。
细胞和分子生物学中的细胞周期和凋亡
细胞和分子生物学中的细胞周期和凋亡细胞周期和凋亡是基本的生物学过程，在许多方面都具有重要的作用。
细胞周期指的是细胞从分裂到分裂的一个连续的过程，不同的细胞具有不同的细胞周期，但大致上可以分为G1期、S期、G2期和M期四个阶段。
凋亡是指细胞自身调节性死亡的过程，凋亡在生命的发展中也具有重要的作用。
本文将对细胞周期和凋亡这两个生物学过程进行介绍。
一、细胞周期细胞周期包括四个连续的阶段，即G1期、S期、G2期和M期。
在G1期，细胞主要进行生长和代谢活动，并且为进入下一个阶段做好准备。
在S期，细胞进行DNA复制，这是细胞周期中最重要的阶段之一，因为DNA的复制是确保基因型的遗传的源泉。
在G2期，细胞进一步生长和为进入M期做好准备。
在M期，细胞进行有丝分裂或减数分裂，确保遗传物质的正常分配。
细胞周期具有重要的作用，细胞必须确保其DNA完整性和正确的复制，以保证细胞和其后代的生存和繁殖能力。
如果细胞在不正确的时机进行分裂，可能会导致肿瘤和其他疾病。
因此，理解细胞周期对生物学的进步和治疗疾病具有重要意义。
二、细胞凋亡细胞凋亡是细胞自身调节性死亡的过程。
这一过程在许多不同的生物学现象中都极为重要，如细胞分化、组织发育、损伤修复和免疫抗体。
在这些过程中，细胞凋亡对于分化和组织的识别和调解具有重要作用。
细胞凋亡的过程可以通过许多途径实现，但这些途径通向一个共同的“执行程序”，即细胞的死亡执行程序。
这个程序包含多种信号传导和效应机制，包括线粒体形态学和能量代谢的变化、炎症和凋亡信号通路的激活、凝集和染色质分解。
尽管这个程序是复杂的，但其总体结果是细胞死亡。
细胞凋亡在治疗疾病中也具有重要作用。
例如，在某些类型的癌症治疗中，化疗和放疗会诱导癌细胞发生凋亡。
此外，许多疾病如心血管疾病、神经退行性疾病和炎症性疾病都与细胞凋亡异常有关。
因此，对细胞凋亡和其机制的理解对于诊断和治疗疾病具有重要意义。
结论细胞周期和凋亡是基本的生物学过程，对于生物体的正常生存和繁殖具有重要意义。
细胞凋亡和细胞周期的调控机制
细胞凋亡和细胞周期的调控机制细胞是构成生物体的最基本单位，细胞的生长、分裂和死亡是维持生物体内稳定状态的关键过程。
在生物体内，细胞的数量是通过细胞周期和细胞凋亡这两个过程相互调控而得以维持的。
细胞周期调控细胞生长和分裂，而细胞凋亡则是一种主动的细胞死亡形式，能够消除受到损伤或发生异常的细胞。
本文将讨论细胞凋亡和细胞周期的调控机制。
一、细胞凋亡的诱导和执行过程细胞凋亡是由一系列信号分子的作用引起的，包括外源性和内源性信号分子。
外源性信号分子包括细胞因子、抗癌药物、放射线等，内源性信号分子包括细胞内的DNA损伤和细胞周期阻滞等。
这些信号分子能够通过激活细胞凋亡途径，诱导细胞执行凋亡程序。
细胞凋亡的执行过程可以分为两个主要部分：信号传导和凋亡效应。
信号传导包括细胞内生死信号的识别和转导等，凋亡效应包括线粒体途径（释放细胞色素c等激活caspase进行凋亡）、死亡受体途径（结合死亡受体激活caspase进行凋亡）、内质网应激途径（释放内质网钙离子等激活caspase进行凋亡）等。
这些凋亡效应可以通过细胞膜发生位置不同等特征进行区分，但不同的途径可能会彼此影响，从而出现复杂的凋亡效应。
二、细胞周期的调控机制细胞周期包括G1、S、G2和M四个阶段，不同阶段的细胞周期调控机制也不同。
下面将对各个阶段的调控机制进行介绍。
G1阶段：这是细胞周期开始的阶段，也是细胞周期最长的阶段。
在这个阶段，细胞会检查自身是否适合进行DNA复制。
如果细胞内存在DNA损伤或者细胞内信号不足，那么细胞将在G1阶段停滞。
G1阶段的细胞周期调控主要是由p53这个关键基因调控的。
S阶段：在G1阶段结束后，细胞将进入S阶段。
在这个阶段，细胞会复制DNA，并检查自身是否拥有足够的DNA复制物质。
如果没有足够的DNA复制物质，那么细胞将无法进入S期。
S阶段的细胞周期调控主要是由Rb这个关键基因调控的。
G2阶段：在S阶段结束后，细胞将进入G2阶段。
生命科学中的细胞周期与细胞死亡
生命科学中的细胞周期与细胞死亡细胞是生命的基本单位，而细胞周期与细胞死亡则是细胞生命历程中极为重要的两个环节。
细胞周期是细胞自身的生命周期，包括G1期、S期、G2期和M期，在不断重复中维持着细胞自身的内稳态。
而细胞死亡则是指细胞从活性向不可逆状态的转变。
在生命科学中，细胞周期和细胞死亡是两个十分重要的研究领域。
本文将从细胞周期和细胞死亡两个方面进行探讨。
第一部分：细胞周期细胞周期，就是一个细胞自我复制和再生的过程。
这个过程分为四个步骤：G1期、S期、G2期和M期。
其中，G1、S和G2这三个步骤合起来就是细胞前期（interphase），M期则是细胞的分裂期。
在细胞周期的各个阶段，细胞经历了不同的生命历程，如DNA复制、蛋白合成等。
在细胞周期中最为重要的过程是M期，这是细胞的分裂期，包括有精细的染色体重排、分裂纺锤体形成、染色体倍增和细胞核分裂等过程。
通过细胞分裂，细胞机体可以向后代细胞传承有关其物理性状和遗传特征的遗传信息。
在细胞周期的各个阶段，许多关键因子参与了其中，特别是细胞周期调控系统，调节着细胞周期的每个阶段。
第二部分：细胞死亡细胞死亡是细胞从能动到静止的过程，是自然生命历程中不可避免的终结。
细胞死亡分为凋亡和坏死两种形式。
凋亡是一种有条理地进行的程序化了的死亡，是一种自觉的消滅死亡方式。
而坏死则是非程序性的死亡，是细胞在一些不正常的情况下引发的细胞死亡。
在凋亡的过程中，细胞首先会分裂成一系列小的凋亡体，接着凋亡体会消除掉细胞内部的DNA，最后凋亡体会消化成最终的碎片，被细胞食物包囊或其他细胞所吞噬进入到身体里面，不会对身体造成任何影响。
而在坏死的细胞死亡中，细胞会被炎症因子所包围，细胞内物质泄漏，导致身体受到破坏，严重时会引发严重的疾病。
结语细胞周期和细胞死亡对于生命科学来说都具有重要的意义。
通过深入学习细胞周期和细胞死亡，在未来的研究工作中，科学家们可以进一步探讨生命的源起、发展与消逝，解析真正的生命奥秘。
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡Annexin V检测细胞凋亡Annexin V (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的断裂片段分析 (7)DNA实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)BrdU Flow Kits检测细胞增殖BrdU Flow (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)Active Caspase-3检测细胞凋亡Active (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)A n n e x i n V检测细胞凋亡实验原理Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。
实验用品1. 一次性12×75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。
3. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
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1．细胞周期
a.取生长状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化为单个细胞，用正常培养基重悬计数，
接种于60mm的皿，每个皿大约接种细胞1X10^6个。
37°C 5% CO2培养1-2天。
b.当细胞融合度大约80%，细胞处于对数增长期时，用0.25%胰酶消化为单个细胞，
1100转离心3分钟。
c.去掉上清，DPBS洗1次，每次6mL，1100转离心3分钟。
d.去掉上清，0.5mL冰冷的DPBS重悬成单个细胞后，逐滴加入70%冰乙醇6mL，边加
边晃动，4度冰箱过夜（乙醇固定作用比较慢，最好多放几天，最好一周内继续做下面的步骤）。
e.1800转离心5分钟，弃上清，用6mL DPBS清洗两次，1800转离心5分钟。
f.用0.5mL PBS重悬（如果细胞过多，可用更多PBS重悬，然后取0.5mL），加入2uL Rnase
（100mg/mL），终浓度为（400mg/mL），室温作用30分钟。
g.加入10uL PI，避光孵育15分钟，可上流式细胞仪检测。
2．Annexin V- FITC/PI测细胞凋亡。
a.取生长状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化为单个细胞，用正常培养基重悬计数，
接种于6孔板，每个孔大约接种细胞5X10^5个。
37°C 5% CO2培养1-2天。
b.当融合度大约80%，细胞处于对数增长期时，用0.25%胰酶消化为单个细胞，每个
孔用一个15ml离心管单独收集，1000转离心3分钟。
c.用2ml DPBS重悬细胞，1000转离心3分钟。
d.用2ml 1 X Banding Buffer重悬细胞，并且计数，1000转离心3分钟。
e.用1 X Banding Buffer重悬细胞，使细胞密度为1X10^6个/ml。
取100ul到一个新的
流式管中。
f.选取正常的细胞三管为补偿管，①双阴性-正常细胞，不加入任何抗体。
②Annexin V-
FITC补偿管，加入Annexin V- FITC抗体5ul。
③PI补偿管，加入PI抗体5ul。
g.样本管为处理过的细胞，对照组为正常细胞，分别加入Annexin V-FITC抗体5ul和
PI抗体5ul。
避光室温15min。
h.加入400ul 1 X Binding Buffer。
尽快上流式细胞仪检测。