【CN109557065A】一种检测土壤中-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法【专利】
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(51)Int .Cl . G01N 21/64(2006 .01)
(10)申请公布号 CN 109557065 A (43)申请公布日 2019.04.02
( 54 )发明 名称 一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分
析方法 ( 57 )摘要
本发明公开了一种检测土壤中β-D-葡萄糖 苷酶活性的分析方法 ，属于酶活性检测技术领 域。该装置包括如下步骤 ：酶活性＝[( RS-BU )* ( SA-SC )/( QS-SC )]-( NC-BU )]*b*2*3000/( 0 .3* W*200 )，其中，SC为上清液+50μl的醋酸缓冲液 所测荧光强度值，QS为上清液+50μl的标样液所 测荧光强度值，SA为上清液+50μl的4-甲基伞形 酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液所测荧光强度值，BU 为200μl的醋酸缓冲液+50μl醋酸缓冲液所测 荧光强度值，RS为200μl的醋酸缓冲液+50μl的 标准品溶液所测荧光强度值，NC为200μl的醋酸 缓冲液+50μl的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷 底物溶液所测荧光强度值。本发明可以减小背景 值 ，能排除 样品 与荧光基团互 作的 背景值 ，排除 缓冲液对标准品的背景值，提高测量结果的准确 性，样品及药品用量少。
( 19 Baidu Nhomakorabea中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910035291 .0
(22)申请日 2019 .01 .08
(71)申请人 吉林省农业科学院 地址 130033 吉林省长春市生态大街1363 号
(72)发明人 孟凡钢 张伟 闫晓艳 赵婧 邱强 张鸣浩 于德斌 饶德民 闫日红 丛博韬 颜秀娟 李明姝 王新风
2
CN 109557065 A
说 明 书
1/3 页
一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法
技术领域 [0001] 本发明涉及酶活性检测技术领域，特别涉及一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性 的分析方法。
背景技术 [0002] 土壤胞外酶在生态系统中扮演着重要角色，其活性高低反映土壤微生物新陈代谢 状况，对于保持土壤肥力和植物生产力极其重。β-D-葡萄糖苷酶，一种更准确检测土壤中βD-葡萄糖苷酶活性的分析方法是目前研究最广泛的一种土壤酶，深度参与土壤有机质的转 化过程 ，主要是由以 纤维素为底物的 微生物分泌 ，水解纤维二糖 和其他水溶性的纤维 糊精 产生形成葡萄糖 ，供微生物自 身生长利 用，能 够指示以 土壤中有机或无机碳为底物的 异养 型呼吸强度，在有机质分解中起重要作用。总的说来，土壤β-D-葡萄糖苷酶的活性反映了土 壤形成的生物气候及生态学条件、土壤生物化学过程的强度及土壤肥力水平。在进行土壤 肥力评价时 ，常常需要测定在不同条件下的β-D-葡萄糖苷酶活性进行说明 ，因此 ，建立一种 相对快速准确的β-D-葡萄糖苷酶活性的检测方法具有很重要的意义。 [0003] 目前在酶检测领域发展成熟的一种方法是以伞形酮作为底物的内置荧光团结合 β-消除反应的检测法，伞形酮又称7-羟基香豆素，是一种强荧光染料，以伞形酮标记底物作 为探针 ，在酶催化作 用下产物发生分子内β- 消除 反应而使底物上的 伞形酮脱落 ，通过荧光 强度的变化反映酶活。该方法被广泛应用于检测多种酶。 [0004] 由于当前多功能酶标仪对荧光强度的检测具有很高的灵敏度，因此缓冲液、土壤、 底物以 及荧光基团 与他 们之间 相互影响的 背景值 ，对与检 测结果的 准 确性具有很大影响。 现今广泛运 用的酶活荧光检 测技术 ，仅仅通过无土对照和无底物对照 ，排除 了土壤及底物 的 背景值 ，对于荧光检 测这种相当灵敏的 检测方法 ，任何的 背景干扰对于结果的 准 确性都 具有相当影响。
权利要求书1页 说明书3页
CN 109557065 A
CN 109557065 A
权 利 要 求 书
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1 .一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法，其特征在于，包括如下步骤： 配制50mM醋酸缓冲液，取4 .1g醋酸钠、161μl冰醋酸和无菌去离子水水定容至1000ml并 调节PH至5 .5； 配制200μM的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液，称取6 .762mg的4-甲基伞形酮和 30μl二甲基亚砜溶解溶解，加无菌去离子水稀释定容至100ml； 配制10μM标准品溶液，称取1 .762mg的4-甲基伞形酮和30μl二甲基亚砜溶解，再定容至 1000ml，制得10μM标准品溶液； 将标准品溶液用蒸馏水分别稀释成浓度为0、0 .025μM、0 .05μM、0 .125μM、0 .25 .0μM、0 .5 μM的标准溶液 ，制得标样液 ，分别用移液枪吸取50μl至96孔板中 ，后分别加入200μl醋酸缓 冲液，再分别加入20μl的1M NaOH溶液，然后进行荧光检测，如此重复制作3条标准曲线； 称取2份0 .3g的土壤鲜样于5ml离心管中，其中1份用于烘干测土壤含水量W，另1份加入 3mL醋酸缓冲液均质混匀，在涡旋仪上高速震荡5分钟，再4℃低温4000R离心5分钟； 吸取3份容量为200μl的经离心后的土壤鲜样与醋酸缓冲液混合物的上清液至96黑孔 板中，其中一份再加50μl醋酸缓冲液，一份加50μl的10μM的标样液，另一份加50μl的4-甲基 伞形酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液； 在37℃培养2h后向黑孔板中每孔加入20μl的1M的NaOH溶液，终止反应； 在荧光检测仪读板温度37℃、酶标板震荡时间1min、激发波长350nm、发射波长450nm的 条件下，测定每孔的荧光强度值； 以标样液浓度和测定的吸光值A制作标准曲线，得到斜率b； 通过如下公式计算得酶活性： 酶活性＝[(RS-BU)*(SA-SC)/(QS-SC)]-(NC-BU)]*b*2*3000/(0 .3*W*200)， 其中 ，SC为上清液+50μl的醋酸缓冲液所 测荧光强度值 ，QS为上清液+50μl的标样液所 测荧光强 度值 ，SA为上清液+50μl的 4-甲 基伞形酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液所 测荧光强 度 值，BU为200μl的醋酸缓冲液+50μl醋酸缓冲液所测荧光强度值，RS为200μl的醋酸缓冲液+ 50μl的标准品溶液所测荧光强度值，NC为200μl的醋酸缓冲液+50μl的4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖苷底物溶液所测荧光强度值。 2 .如权利要求1所述的一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法，其特征在于， 1M的NaOH溶液通过20gNaOH+蒸馏水定容至50ml制得。
(10)申请公布号 CN 109557065 A (43)申请公布日 2019.04.02
( 54 )发明 名称 一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分
析方法 ( 57 )摘要
本发明公开了一种检测土壤中β-D-葡萄糖 苷酶活性的分析方法 ，属于酶活性检测技术领 域。该装置包括如下步骤 ：酶活性＝[( RS-BU )* ( SA-SC )/( QS-SC )]-( NC-BU )]*b*2*3000/( 0 .3* W*200 )，其中，SC为上清液+50μl的醋酸缓冲液 所测荧光强度值，QS为上清液+50μl的标样液所 测荧光强度值，SA为上清液+50μl的4-甲基伞形 酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液所测荧光强度值，BU 为200μl的醋酸缓冲液+50μl醋酸缓冲液所测 荧光强度值，RS为200μl的醋酸缓冲液+50μl的 标准品溶液所测荧光强度值，NC为200μl的醋酸 缓冲液+50μl的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷 底物溶液所测荧光强度值。本发明可以减小背景 值 ，能排除 样品 与荧光基团互 作的 背景值 ，排除 缓冲液对标准品的背景值，提高测量结果的准确 性，样品及药品用量少。
( 19 Baidu Nhomakorabea中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910035291 .0
(22)申请日 2019 .01 .08
(71)申请人 吉林省农业科学院 地址 130033 吉林省长春市生态大街1363 号
(72)发明人 孟凡钢 张伟 闫晓艳 赵婧 邱强 张鸣浩 于德斌 饶德民 闫日红 丛博韬 颜秀娟 李明姝 王新风
2
CN 109557065 A
说 明 书
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一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法
技术领域 [0001] 本发明涉及酶活性检测技术领域，特别涉及一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性 的分析方法。
背景技术 [0002] 土壤胞外酶在生态系统中扮演着重要角色，其活性高低反映土壤微生物新陈代谢 状况，对于保持土壤肥力和植物生产力极其重。β-D-葡萄糖苷酶，一种更准确检测土壤中βD-葡萄糖苷酶活性的分析方法是目前研究最广泛的一种土壤酶，深度参与土壤有机质的转 化过程 ，主要是由以 纤维素为底物的 微生物分泌 ，水解纤维二糖 和其他水溶性的纤维 糊精 产生形成葡萄糖 ，供微生物自 身生长利 用，能 够指示以 土壤中有机或无机碳为底物的 异养 型呼吸强度，在有机质分解中起重要作用。总的说来，土壤β-D-葡萄糖苷酶的活性反映了土 壤形成的生物气候及生态学条件、土壤生物化学过程的强度及土壤肥力水平。在进行土壤 肥力评价时 ，常常需要测定在不同条件下的β-D-葡萄糖苷酶活性进行说明 ，因此 ，建立一种 相对快速准确的β-D-葡萄糖苷酶活性的检测方法具有很重要的意义。 [0003] 目前在酶检测领域发展成熟的一种方法是以伞形酮作为底物的内置荧光团结合 β-消除反应的检测法，伞形酮又称7-羟基香豆素，是一种强荧光染料，以伞形酮标记底物作 为探针 ，在酶催化作 用下产物发生分子内β- 消除 反应而使底物上的 伞形酮脱落 ，通过荧光 强度的变化反映酶活。该方法被广泛应用于检测多种酶。 [0004] 由于当前多功能酶标仪对荧光强度的检测具有很高的灵敏度，因此缓冲液、土壤、 底物以 及荧光基团 与他 们之间 相互影响的 背景值 ，对与检 测结果的 准 确性具有很大影响。 现今广泛运 用的酶活荧光检 测技术 ，仅仅通过无土对照和无底物对照 ，排除 了土壤及底物 的 背景值 ，对于荧光检 测这种相当灵敏的 检测方法 ，任何的 背景干扰对于结果的 准 确性都 具有相当影响。
权利要求书1页 说明书3页
CN 109557065 A
CN 109557065 A
权 利 要 求 书
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1 .一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法，其特征在于，包括如下步骤： 配制50mM醋酸缓冲液，取4 .1g醋酸钠、161μl冰醋酸和无菌去离子水水定容至1000ml并 调节PH至5 .5； 配制200μM的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液，称取6 .762mg的4-甲基伞形酮和 30μl二甲基亚砜溶解溶解，加无菌去离子水稀释定容至100ml； 配制10μM标准品溶液，称取1 .762mg的4-甲基伞形酮和30μl二甲基亚砜溶解，再定容至 1000ml，制得10μM标准品溶液； 将标准品溶液用蒸馏水分别稀释成浓度为0、0 .025μM、0 .05μM、0 .125μM、0 .25 .0μM、0 .5 μM的标准溶液 ，制得标样液 ，分别用移液枪吸取50μl至96孔板中 ，后分别加入200μl醋酸缓 冲液，再分别加入20μl的1M NaOH溶液，然后进行荧光检测，如此重复制作3条标准曲线； 称取2份0 .3g的土壤鲜样于5ml离心管中，其中1份用于烘干测土壤含水量W，另1份加入 3mL醋酸缓冲液均质混匀，在涡旋仪上高速震荡5分钟，再4℃低温4000R离心5分钟； 吸取3份容量为200μl的经离心后的土壤鲜样与醋酸缓冲液混合物的上清液至96黑孔 板中，其中一份再加50μl醋酸缓冲液，一份加50μl的10μM的标样液，另一份加50μl的4-甲基 伞形酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液； 在37℃培养2h后向黑孔板中每孔加入20μl的1M的NaOH溶液，终止反应； 在荧光检测仪读板温度37℃、酶标板震荡时间1min、激发波长350nm、发射波长450nm的 条件下，测定每孔的荧光强度值； 以标样液浓度和测定的吸光值A制作标准曲线，得到斜率b； 通过如下公式计算得酶活性： 酶活性＝[(RS-BU)*(SA-SC)/(QS-SC)]-(NC-BU)]*b*2*3000/(0 .3*W*200)， 其中 ，SC为上清液+50μl的醋酸缓冲液所 测荧光强度值 ，QS为上清液+50μl的标样液所 测荧光强 度值 ，SA为上清液+50μl的 4-甲 基伞形酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液所 测荧光强 度 值，BU为200μl的醋酸缓冲液+50μl醋酸缓冲液所测荧光强度值，RS为200μl的醋酸缓冲液+ 50μl的标准品溶液所测荧光强度值，NC为200μl的醋酸缓冲液+50μl的4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖苷底物溶液所测荧光强度值。 2 .如权利要求1所述的一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法，其特征在于， 1M的NaOH溶液通过20gNaOH+蒸馏水定容至50ml制得。