生物药物白细胞介素-2

白细胞介素-2（别名：T细胞生长因子,TCGF；IL2）
刘璇璇制药1403 1160214309
一、简单介绍
白细胞介素-2是趋化因子家族的一种细胞因子。

它是由多细胞来源（主要由活化T细胞产生），又具有多向性作用的细胞因子（主要促进淋巴细胞生长、增殖、分化）；对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用，能刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的T细胞增殖；能活化T细胞，促进细胞因子产生；刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；促进B 细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞。

可用于临床研究和肿瘤治疗。

类型：糖蛋白；来源：主要由T细胞产生；作用方式：以自分泌和旁分泌方式发挥效应；名词领域：免疫学
它的一般性质为：1．IL-2的产生细胞IL-2主要由T细胞（特别是CD4+T细胞）有受抗原或丝裂原刺激后合成；B细胞、NK细胞及单核－巨噬细胞亦能产生IL-2。

2．IL-2分子IL-2分子量为15KD，是含有113个氨基酸残基的糖蛋白，在人类由第4号染色体上的一个基因编码。

IL-2具有一定的种属特异性，人类细胞只对灵长类来源的IL-2起反应，而几乎所有种属动物的细胞均对人的IL-2敏感。

3．IL-2受体（IL-2R）IL-2的靶细胞包括T细胞、NK细胞、B细胞及单核－巨噬细胞等。

这些细胞表面均可表达IL-2R。

IL-2R包含3条多肽链：1条为α链，分子量55KD；1条为β链，分子量75KD；另1条为γ链，分子量64KD。

α链的胞内区较短，不能向细胞内传递信号，而β链和γ链的胞内区较长，具有传递信号的能力。

3种肽链单独与IL-2结合亲和力较低，只有同时表达才能产生高度亲和力。

二、生产工艺
材料和方法
1.制备粗制IL2无菌采血，肝素抗凝，用RPMI1640按1∶1将血液稀释，然后重层于菲可液面上，以1500r/min离心30min，取白细胞层，用RPMI1640洗2次，按1~3×10细胞/ml浓度加入10%胎牛血清RPMI1640，注入一装有磁棒的大瓶中，置37℃搅拌培养4天，取出，分装于50ml离心管中，1500r/min离心20min，弃上清液，将细胞悬浮于1%胎牛血清RPMI1640培养液中，使细胞浓度为106细胞/ml。

同时加入纯质PHA1~2μg/ml以及多种B淋巴母细胞株，使其浓度为106细胞/ml，37℃搅拌培养18~24h后，取出以1500r/min离心30min，取上清，用045μg滤膜过滤除菌，滤液即为粗制IL2。

制备精品IL-2
1、硫酸铵沉淀与真空浓缩透析：在4℃下将硫酸铵粉末按50%饱和量加入上述粗制IL2中，搅拌2h，12000g离心30min，取上清液，再加入80%饱和硫酸铵，4℃过夜，次日以12000g离心30min，弃上清液，将沉淀溶于01%PEG6000的1∶2PBS溶液（pH值73）中，置真空负压浓缩透析器中透析浓缩至所需容量。

2、SephadexG100凝胶过滤：用2×180cm的过滤柱及PBS（同上），以80ml/h
流速过滤。

将各管洗脱液用紫外分光光度计280nm检测其OD值。

同时将几种不同分子量的标准蛋白也用相同条件过滤及检测其OD值，绘出IL2及标准蛋白OD值的曲线。

将各管洗脱液过滤除菌后，作白细胞生物活性试验，按试验结果绘出曲线，找出具有最高IL2活性的几管洗脱液，混合后，作下一步精制。

3、BlueSepharose层析：将上述混合后的洗脱液加入BlueSepharose柱中，流速约15ml/h，按每管10ml收集流出液，当样品全部流出柱中以后，用上述PBS洗涤样品柱，再用梯度NaCl溶液（从0075mol/L至06mol/LNaCl的PBS溶液）洗脱，按2ml/管收集洗脱液。

NaCl溶液梯度及流速均由梯度混合器调节控制。

洗脱完毕后，作各管OD值及NaCl浓度的测定。

各管洗脱液过滤除菌后，作出生物活性测定。

将峰值前后的数管洗脱液混合，即为精制的IL2。

置-20℃冰箱保存。

检定
1、活性测定用10%胎牛血清RPMI1640将上述IL2稀释为50%、25%、125%、625%，而后再将每个百分浓度以及100%浓度的IL2倍比稀释，自1∶2至1∶128，将每个稀释度分别加入多孔板的孔中，每孔01ml。

然后取CT6细胞株（小鼠的IL2依赖性T细胞株），调整浓度为106细胞/ml，每孔加入01ml，同时用培养基代替IL2作对照。

将多孔板培养24h后，取出按每孔1μci的浓度加H3标记胸腺嘧啶核苷继续培养4h。

取出后用MESHⅡ细胞收集器过滤洗涤细胞，用β计数器测定各孔细胞的cpm。

必要时按此结果绘出曲线，确定活性单位。

2、蛋白含量测定采用分光光度计，分别测得OD280及OD260，然后按下式计算：蛋白含量（mg/ml）=（144×OD280-075×OD260）×稀释倍数。

3、毒性试验及细菌检查参考胸腺肽制备部分。

三、技术状况
IL-2分泌水平的高低与多种疾病有密切关系。

IL-2在机体免疫调节网络中的核心作用，与其他细胞因子的协同和拮抗作用，共同完成机体免疫机能的平衡调节作用；免疫佐剂是一类能促进、延长或增强抗原免疫原性和免疫保护效果的物质。

IL-2作为一种免疫增强剂，显示出极为广泛的应用前景。

hIL-2是研究最多的细胞因子免疫佐剂之一，其在艾滋病的免疫治疗和乙型肝炎病毒作为免疫佐剂的应用上取得了良好的效果。

IL-2蛋白和狂犬病灭活苗联合使用，可以明显提高疫苗的免疫效果(保护率至少提高25倍)。

1.用于肿瘤和感染性疾病的治疗
2.用于自身免疫性疾病的治疗
3.白细胞介素-2与精神分裂症：早期研究提示精神分裂症患者有细胞免疫功能的紊乱，且认为这种免疫学功能改变可能与精神分裂症病因有内在联系。

近十年来，国内外许多学者对精神分裂症血清和脑脊液进行了白细胞介素-2和可溶性白介素-2受体检测，较倾向于认为精神分裂症中存在浓度异常，但改变的方向和程度不完全一样Ganguli(1989)等认为精神分裂症血清IL-2水平低于正常人群，这种异常可能与患者的发病年龄、病期、疾病的严重程度、
临床表现及药物疗效等有密切关系。

精神分裂症病人IL-2水平与临床状况(复发或增加复发危险性)的关系，一致认为脑脊液中IL-2平与精神病复发相关，无论在药物治疗或停用后，精神病复发倾向的病人脑脊液中IL-2水平较复发者明显增加，而末梢中IL-2水平不受影响，这种变化排除了DA与5-HT影响，具有较高特异性，由此提出可将脑脊液中IL-2水平变化作为预测精神疾病复发的一个重要指标。

近几年，有关抗精神病药在精神分裂症的治疗中对IL-2及SIL-2R的
影响研究逐渐增多，由于精神分裂症免疫改变各异，和作者取样对象、药物种类等的不同，抗精神病药对IL-2及SIL-2R的改变的差异性很大，检测结果亦显混乱而复杂，另一方面，药物在IL-2／SIL-2R的改变可以帮助认识某些抗精神病药的副反应如氯氨平的发热和粒细胞下降，而且以IL-2为主的细胞因子可能直接介导中枢神经系统的抗精神病作用。

由此研究抗精神病药对IL-2等浓度影响显得尤为重要。

总之，精神分裂症IL-2／SIL-2R在机体内浓度存在异常，且可能与该病年龄、病期、疾病的严重程度、临床表现、药物种类和剂量，以及疗效等有关，各种检测差异很大，反映了精神分裂症病因学的异质性，亦说明了精神分裂症的IL-2的状态检测以及抗精神病药物作用需作全面系统的评价。

4. 白细胞介素-2的基因工程研究：Taniiguchi于1983年首次成功克隆了hIL-2的cDNA
，使IL-2的大量生产和研究成为可能。

90年代初IL-2在美国问世，1991年，中国科学院海生化研究所和军医医学科学院承接了“八五”重点攻关课题一基因重组白细胞介素-2。

成功构建了表达IL-2的pL Y-4质粒，表达水平可达50％，经纯化后蛋白的比活性可达到1.6~2.2
×107，此课题于1994年获一类新药证书，是我国继干扰素后第二个正式进入市场的基因工程药物。

此后，利用基因重组技术，分别在大肠杆菌、酵母、猴COS 细胞和昆虫细胞中表达了有活性IL-2，目前人IL-2已经全部采用基因工程的方法生产。

IL-2应用广泛，但其毒副作用比较大。

IL-2能产生寒战、发热和乏力的全身性副作用。

其对心血管系统的心脏毒性表现为心律失常、心肌缺血、心肌炎和收缩力下降等症状。

血流动力学的改变是IL-2治疗的最严重副作用。

表现症状为全身血管阻力下降，心率增快，心输出量增加，平均动脉压下降。

因此在临床使用中一般采用低剂量静脉注射以维持低水平、低毒性的有效浓度。

另外，基因工程IL-2半衰期太短（约2h），影响疗效。

如何提高其半衰期是研究者比较关注的一个问题。

研究者发现对IL-2进行氨基酸残基突变能有效的提高与IL-2R的结合效率，以延长IL-2的半衰期，这是从分子机制上延长半衰期的方法。

从制剂的角度出发同样能缓解这个问题。

目前大量开展了“缓释制剂"的研究，如采用脂质体包裹或M-PEG连接等均可延缓IL-2
的半衰期。

IL-2融合蛋白已经成为IL-2研究的热门方向。

采用基因重组融合蛋白的方式获得IL-2的融合蛋白同样也能延缓IL-2的半衰期而减少用药量，同时减少了毒副作用。

如抗体-IL-2融合蛋白比IL-2单独应用的生物活性更好，其抗体部分带引融合蛋白靶向性结合肿瘤细胞，在肿瘤细胞周围形成高浓度区，从而减少了用药剂量，也相应减少了IL-2引发的副作用。

其融合蛋白还可以激活LAK 细胞共同杀伤肿瘤细胞等，并且效果更强。

国内外都有相关报道。

Belmont等人构建表达的可溶性TCR/IL-2融合蛋白能有效的抑制肿瘤细胞的增殖分化，延长IL-2在体内的半衰期，最小限度的减少了药物毒性，其抗癌活性远远超过单独使用人IL-2的效果。

融合IL-2蛋白具有活性高、毒性小等优点，已经成为IL-2研究的一条重要研究途径。

四、市场发展概况
1.肾癌、恶性黑色素瘤、结肠癌等。

2.与LAK、手术、放疗、化疗相结合用于小脑星形细胞瘤、舌癌、喉癌、鼻咽癌、肝癌、肺癌和胃癌手术转移的患者。

3.癌性胸腹水。

因癌症患者IL-2的产生能力低下，注入IL-2可激活体内免疫活性细胞而产生抗癌作用。

且给IL-2的途径不同所产生的抗癌效果也不同。

迄今临床应用表明，对于中、晚期恶性肿瘤病人，经常规手术、化疗、放疗无效或现仍缺乏有效疗法者，采用IL-2和LAK治疗，可获一定客观疗效。

IL-2在畜禽业中的应用前景
由于鸡的IL-2的研究不但在研究鸡免疫系统的发生及免疫调节机理中具有重要作用，而且在人类和哺乳动物的比较免疫学、生物发育和进化的研究中具有重要意义，因此，国内外学者对鸡的IL-2进行了不懈的研究，某些方面已取得了突破性的进展。

传染性法氏囊病(IBD)是目前危害世界养禽业的三大传染病之一，该病的病原传染性法氏囊病病毒(IBDV)主要侵害雏鸡的中枢免疫器官法氏囊中的B淋巴细胞，导致免疫抑制。

近年来，由于变异株和超强毒株的流行，经常导致免疫失败。

基因免疫的发现为传染性法氏囊病的防治提供了一条新思路。

目前常用将抗原基因与细胞因子质粒联合注射或融合共表达的方法来增强DNA疫苗的免疫效果，其中以IL-2的应用最为广泛，哺乳动物的IL-2已被广泛用作DNA疫苗的免疫增强剂。

从最近结果来看，鸡的IL-2能增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫原性。

这为研制新一代禽类疫苗免疫增强剂奠定了基础。

马立克氏病(MD)是由B群疱疹病毒引起的、具有高度接触传染性的肿瘤性疾病。

MD主要危害鸡、火鸡和雉，是世界瞩目的禽病之一，对养禽业有着巨大的威胁。

近年来，科学家们又从分子免疫学变化来探讨MD的发病机理。

研究发现：1日
龄雏鸡人工感染vMDV后，脾脏T淋巴细胞IL-2诱生活性比健康对照雏鸡显著降低(P<0.05)胸腺淋巴细胞IL-2诱生活性虽见降低，但无统计学显著性差异(P>0．05)，脾脏和胸腺T淋巴细胞IL-2R诱导表达显著减少(P<0．01，P<0．05)。

同时也有研究发现：雏鸡经MD三价疫苗免疫后，脾脏和胸腺T淋巴细胞IL-2诱导活性比未免疫健康对照雏鸡和火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗免疫雏鸡显著升高(P<0．01，P<0．01和P<0．01，P<0．01)。

因此，IL-2在MD免疫中发挥了一定作用，这同样也为新型细胞因子家禽疫苗免疫佐剂的研制奠定了理论基础。

IL-2在其他抗感染免疫中同样也发挥作用。

刚孵化出的小鸡的T淋巴细胞未发育成熟，在抗原的刺激下，不能分化增殖和分泌IL-2，因此在小鸡两周龄注射IL-2可以提供一定的保护力。

作为免疫治疗剂，IL-2还可以克服免疫抑制以及预防某些疾病感染，合理的使用IL-2还可以克服饲料中的霉菌毒素等原因引起的免疫抑制。

这些为探讨禽类新型重组基因疫苗研制奠定了一些基础。

综上所述，IL一2的研究在畜禽业中有着非常广阔的前景。

人们对IL-2的研究已经有30多年的历史了，但IL-2仍然是目前研究最多的细胞因子之一，它在免疫系统中的作用还有待于继续研究。

IL-2能有效增强免疫能力，提高机体免疫水平，广泛的生物学作用使其在临床上具有较大的应用价值。

随着不断的研究开发，IL-2的应用必定还会得到进一步发展。

五、生产厂家
长春长生基因药业股份有限公司
上海康达科技医药有限公司
北京四环生物制药有限公司
沈阳三生制药有限责任公司
上海中信国健药业
杭州九源基因工程
长春生物制品
江苏豪森药业
北京双鹭药业
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