植物组培外植体消毒详解
请介绍初代培养时,外植体灭菌的一般操作流程
请介绍初代培养时,外植体灭菌的一般操作流程请介绍初代培养时，外植体灭菌的一般操作流程植物组织培养是一种重要的研究手段，可以用于植物生长发育、基因转化、基因功能研究、药用植物繁殖等方面。
其中，外植体灭菌是非常重要的一步，它可以有效地消除外植体表面的细菌、真菌等微生物，保证培养过程的纯净性。
本文将介绍初代培养时，外植体灭菌的一般操作流程。
一、实验室准备1.1 器材准备灭菌器、无菌工作台、移液器、吸头、无菌超声波清洗器、电子天平、无菌手套、无菌培养皿、无菌离心管、无菌注射器、无菌玻璃棒、无菌滤纸、无菌酒精灯等。
1.2 试剂准备70%乙醇、84消毒液、无菌蒸馏水等。
二、外植体处理2.1 采集外植体采集适合培养的植物外植体，如茎尖、叶片、花器官等，根据不同的外植体类型选择不同的处理方法。
2.2 去皮、消毒去掉外植体表面的皮、毛等杂质，然后将外植体放入无菌离心管中，加入70%乙醇或84消毒液，用移液器充分淋洗，消毒时间不少于3min。
2.3 洗涤将消毒液倒掉，加入无菌蒸馏水，用移液器充分淋洗，洗涤时间不少于3次。
2.4 剪切将外植体剪成适当大小，以便于培养时的生长和观察。
三、培养基处理3.1 培养基配制根据所需的外植体类型、培养目的等不同因素，选择适当的培养基配方，如MS培养基、B5培养基等。
将培养基配制好，并调节pH 值至适宜范围。
3.2 过滤用无菌滤纸将培养基过滤，以去除其中的微生物。
四、外植体接种4.1 灭菌台消毒打开灭菌台，用酒精灯对其进行消毒。
4.2 工具消毒将需要使用的工具放入灭菌器中进行消毒，如无菌注射器、无菌玻璃棒等。
4.3 培养皿消毒将需要使用的培养皿放入灭菌器中进行消毒，消毒时间不少于30min。
4.4 外植体接种将消毒好的外植体取出，用无菌注射器或无菌玻璃棒将其接种到培养皿中，然后加入适量的培养基。
五、培养过程5.1 培养条件将接种好的培养皿放入无菌培养箱中，保持适宜的温度、光照和湿度等条件。
最新植物组培外植体消毒详解
植物组培外植体消毒详解外植体的消毒植物组织培养用的外植体大部分取自田间，表面上附着大量的微生物，这是组织培养的一大障碍。
因此在材料接种培养前必须要消毒处理，消毒一方面要求把材料表面上的各种微生物杀灭，同时又不能损伤或只轻微损伤组织材料而不影响其生长。
因此，外植体的消毒处理是植物组织培养工作中的重要一环。
（1）常用的消毒剂常用的消毒剂如下表所示。
理想的消毒剂应具有消毒效果好，易被无菌水冲洗掉或能自行分解，对材料损伤小，对人体及其他生物无害，来源广泛，价格低廉。
常用消毒剂的使用方法及效果①酒精酒精是最常用的表面消毒剂，以70%~75%酒精杀菌效果最好，95%或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固，形成一层干燥膜，阻止了酒精的继续渗入，杀菌效果大大降低。
酒精具有较强的穿透力，使菌体蛋白质变性，杀菌效果好。
同时它还具有较强的湿润作用，可排除材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入。
但酒精对植物材料的杀伤作用也很大，浸泡时间过长，植物材料的生长将会受到影响，甚至被酒精杀死，使用时应严格控制时间。
但酒精不能彻底消毒，一般不单独使用，多与其他消毒剂配合使用。
②升汞又称氯化汞，Hg2+可以与带负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，从而杀死菌体。
升汞的消毒效果极佳，但易在植物材料上残留，消毒后需用无菌水反复多次冲洗。
升汞对环境危害大，对人畜的毒性极强，使用后应做好回收工作。
③次氯酸钠次氯酸钠是一种较好的消毒剂，它可以释放出活性氯离子，从而杀死菌体。
其消毒能力很强，不易残留，对环境无害。
但次氯酸钠溶液碱性很强，对植物材料也有一定的破坏作用。
④漂白粉漂白粉的有效成分是次氯酸钙[Ca(ClO)2]，消毒效果很好，对环境无害。
它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。
⑤过氧化氢也称双氧水，消毒效果好，易清除，又不会损伤外植体，常用于叶片的消毒。
⑥新洁尔灭这是一种广普表面活性消毒剂，对绝大多数植物外植体伤害很小，杀菌效果好。
（2）消毒方法①茎尖、茎段及叶片等的消毒消毒前先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，然后用自来水冲洗。
植物组织培养消毒方法
植物组织培养消毒方法
植物组织培养是一种重要的生物技术，可以用于植物繁殖、基因转化等方面。
在进行植物组织培养时，消毒是非常重要的一步，可以有效地避免外源性污染，保证培养物的纯度和质量。
下面是植物组织培养消毒的方法：
1. 表面消毒法
表面消毒法是最常用的植物组织培养消毒方法之一。
首先，将植物材料用水冲洗干净，去除表面的泥沙和杂质。
然后，将植物材料放入含有70%乙醇的烧杯中，用力摇晃，使其充分接触乙醇。
接着，将植物材料转移到含有10%次氯酸钠的烧杯中，同样用力摇晃，使其充分接触次氯酸钠。
最后，将植物材料转移到含有无菌水的烧杯中，反复冲洗数次，去除次氯酸钠的残留物。
2. 氯气消毒法
氯气消毒法是一种高效的植物组织培养消毒方法。
首先，将植物材料放入密闭的容器中，加入适量的水，然后向容器中通入氯气，使其充分接触植物材料。
通气时间一般为30分钟至1小时。
接着，将容器打开，用无菌水反复冲洗植物材料，去除氯气的残留物。
3. 紫外线消毒法
紫外线消毒法是一种无化学残留的植物组织培养消毒方法。
首先，将植物材料放入无菌室中，然后将紫外线灯照射在植物材料上，照射时间一般为30分钟至1小时。
紫外线能够破坏细菌、病毒等微生物的DNA，从而达到消毒的效果。
但是，紫外线消毒法对于一些耐药菌和孢子并不十分有效。
以上是植物组织培养消毒的三种常用方法，不同的消毒方法适用于不同的植物材料和实验要求。
在进行植物组织培养时，应选择合适的消毒方法，并严格按照操作规程进行操作，以保证培养物的纯度和质量。
一种组织培养中外植体消毒的方法与流程
一种组织培养中外植体消毒的方法与流程本发明涉及组织培养技术领域，更具体地说，涉及一种组织培养中外植体消毒的方法。
背景技术：植物组织培养用的外植体材料大部分取自田间，但因为在植物表面上附着大量的微生物。
因此在植物材料接种前必须要进行消毒处理，目的是既要求把材料表面上的各种微生物杀灭，同时又不能损伤或只轻微损伤植物材料而不至于影响其生长。
因此，外植体的消毒处理是植物组织培养工作中的重要的一环。
目前在组织培养中常用的外植体消毒过程中主要存在以下突出问题：外植体处理不当，导致外植体成活率低或外植体消毒不彻底，导致污染率高，影响了组培繁殖的效率和产量。
技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种组织培养中外植体消毒方法，该消毒方法对外植体消毒彻底，且损伤率降低。
一种组织培养中外植体消毒的方法，包括：清洗干净外植体表面，得到清洗后外植体；将所述清洗后外植体浸泡在70％的酒精中，在第一设定温度条件下超声波震荡第一预设时间，得到第一预处理外植体；将所述第一预处理外植体浸泡在5％-10％的NaClO溶液中，在所述第一设定温度条件下超声波震荡第二预设时间，得到第二预处理外植体；将所述第二预处理外植体浸泡在无菌水中，在所述第一设定温度条件下超声波震荡第二预设时间，得到第三预处理外植体；冲洗所述第三预处理外植体，得到消毒后外植体。
优选地，清洗干净外植体表面实现为：将外植体用自来水冲洗5-7次，再将所述外植体材料切成段或块或片状，自来水清洗外植体表面达到10-15min。
优选地，在第一设定温度条件下超声波震荡第一预设时间实现为：升温至40℃，并在40℃条件下，同时利用120W的超声波震荡10-20s。
优选地，在所述第一设定温度条件下超声波震荡第二预设时间实现为：升温至40℃，并在40℃条件下，同时利用120W的超声波震荡5-10min。
优选地，冲洗所述第三预处理外植体包括：利用无菌水冲洗所述第三预处理外植体材料10-15min。
组培苗生产技术—外植体的选择、处理与接种(植物组织培养课件)
3、蔬菜（龙牙百合） 龙牙百合特征:鳞茎，无皮，广卵形，外部鳞片长,将整个鳞茎 包裹，直径5~15厘米，白色，茎高90厘米左右，直立茎上叶 多而散生，披针形，叶色从浓绿，光滑。花单生茎顶。花朵 呈喇叭状长筒形，白色，有清香。
不能损伤组织材料，保持外植体的生活力，使外 植体在良好的培养条件下很快恢复生机，正常 生长和繁殖.
• 消毒剂的要求 • 要求：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物的
组织细胞，又易被无菌水冲洗掉，不影响消毒后 外植体的生长和分化.
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂 使用浓度（%） 清除的难易 消毒时间 效 果
2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） 3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； 4、花球和花蕾 5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。
（二）实例分析 1、花卉（非洲菊） • 常用茎尖、嫩叶、花托进行非洲菊的组织培养，也有利用
种子进行组织培养的。 • 茎尖培养操作麻烦，但对于脱毒苗的生产是最有效的。 • 花托培养可直接成苗， 既可保持种性，又易行、 耗时短，是首选的外植体。
• 首先要选择花大、花色艳丽、市场流行的品种，然后再选 择无病虫害、植株生长健壮、花色纯正的优良品种单株进 行取材。
• 一旦选出优株后，应进行挂牌标记，并一直在其上采取花 蕾。作为外植体的花蕾要选取直径在1㎝左右，而且未露 心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能获得满意的效果 。
2、水果（草莓）
（1）选择结果性优良的草莓母株上新抽出的匍匐茎作外植体，以每年6～7 月份最为适宜。
龙牙百合的许多器官、组织都可作为外植体， 如鳞片、花梗、叶片、茎尖、腋芽、花瓣、花托 、花丝、花药、胚、子房、根尖等，其中采用鳞 片作外植体的较多。
实验二 外植体消毒和接种
实验三的准备工作
• 另外，任一组帮忙配：配YEB培养基 500mL(固体)
• 配方：牛肉浸膏 5.0 g/L
•
酵母浸膏 1.0 g/L
•
蛋白胨 5.0 g/L
•
蔗糖 5.0 g/L
•
MgSO4.7H2O 0.002 mol/L
•
pH7.0
• 分装至菌种培养瓶
实验三的准备工作
• 每组需另准备： • 无菌水 8瓶 • 空瓶 2个，其中一个
重新消毒后才能使用。 • 6、不要用手直接接触无菌的物品。
在超静工作台上接种植物材料
注意坐姿？不要说话？ 无菌操作？ 避免交叉感染？
标签格式(例)
材料名称:烟草(叶)，其它（待定） 培养基名称:例如：MS+NAA2mg/L+6-BA1mg/L 接种日期:2010.4.26 姓名:xxx
其它图案标志等少用，如三角形，脸谱， 卡通图
动等进行增效。
不同外植体的消毒方法：
• 茎尖，叶片及茎段等的消毒：取材—自来水冲洗（肥 皂水）---75%EtOH浸泡10-30秒---无菌水冲洗----2%或 10% NaClO或0.1%HgCl2浸泡10-15 min—无菌水冲洗34次----接种。（升汞浓度与消毒时间的关系）
• 种子消毒，与此类同。 • 根及地下部器官的消毒： • 根（来自土壤，水冲洗充分）---0.1%升汞或NaClO浸
• 颜色 • 质地 ➢ 诱导率(%)=形成愈伤组织的材料数/接种总材料数×100
如污染严重或没有诱导出愈伤组织,则需重做实验!
请大家“给力”，精心呵护你的“宝贝”（被培养材料）
其它实验内容
• 为第三周发根农杆菌遗传转化作准备
实验三,毛状根的诱导和培养 的准备工作
外植体消毒方法比较
外植体消毒方法比较组培实验室是生命科学及相关学科实验室建设中必备的实验室。
组培实验室的消毒是实验室日常管理工作的重要环节，直接关系着组培实验的成功与否和组培幼苗的质量高低。
组培实验室的消毒一般又可分为环境消毒、培养基消毒和外植体的消毒。
培养基的消毒主要是在高压灭菌锅中进行，在此不再赘述。
环境消毒和外植体的消毒则有多种方法，这些方法各有优劣，使用不当时还会对人体产生伤害，为此，笔者特对这些典型方法进行分析比较，为组培实验室的科学管理提供一些参考。
1 组培实验室的环境消毒保持组培实验室的空气清洁度是减少组培污染的重要条件，用于实验室消毒的常规消毒方法包括紫外线照射法、甲醛熏蒸法、新洁尔灭(苯扎溴铵溶液)法等，比较新的方法有中草药消毒法。
1.1 紫外线照射法紫外线是波长在10-400 nm之间辐射光的总称，能引起细菌、病毒等微生物遗传物质的结构发生变化，从而影响DNA复制、RNA转录和蛋白质的翻译，导致病菌或病毒死亡。
此外，紫外线辐射所产生的臭氧和各种自由基可损伤蛋白质和酶分子，导致功能改变。
紫外线消毒具有广谱性，可杀灭细菌、病毒、真菌、支原体等各种微生物。
紫外消毒具有较高的杀菌效率，且由于未使用化学药剂，消毒过程中不会产生对人体和环境有害的副产物。
该技术运行维护简单，费用较低。
采用室内悬吊式紫外线消毒时，室内安装紫外消毒灯的数量为每平方不少于1. 5 W，照射时间不少于30 min。
但需要指出的是，过量的紫外线照射对人体有一定的危害乃至致癌作用。
紫外线作用于中枢神经系统，可出现头痛、头晕、体温升高等症状。
过量辐射会诱发皮肤癌。
紫外辐射对眼睛的损伤特别明显，严重时可能诱发白内障。
因此，当组培实验室在用紫外消毒期间，工作人员不要呆在正消毒的空间内，切忌用眼睛注视紫外灯。
特别的，如超净工作台内的紫外灯打开消毒时，应避免将手长时间暴漏于紫外灯下。
一般在接种室用紫外线消毒后，不要立即进入接种室，此时室内充满高浓度的臭氧，会对人体，尤其是呼吸系统造成伤害。
《外植体及消毒》课件讲义
灭菌(Sterilization)
1、培养基灭菌
➢ 高压湿热灭菌 ➢ 某些激素、维生素 采用过滤灭菌
灭菌(Sterilization) 过滤灭菌
灭菌(Sterilization)
2、玻璃器皿灭菌
干热灭菌：160-180℃,1.5-2.0h 湿热灭菌：121℃, 15-20min 接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌
Detail is the Key of Success
无菌操作: 细节决定成败
➢ 养成“双手不从开盖瓶口等开放处划过”、“超净工 作台内动作轻、缓”等良好习惯。
➢ 在无菌操作时，最应该引起警惕的是“双重传递污 染”，即接种器械被手或其它物品污染后双浸染培养 基或试管苗等。
接种工具每用一次即需要彻底高温灭菌一次， 准备多套接种器械，轮换使用。
接种工具每用一次即需要彻底高温灭菌一次， 准备多套接种器械，轮换使用，以减少“交叉 污染”。
培养物污染的预防措施
2、外植体灭菌时不彻底
经表面消菌的材料，并不一定完全将微生物杀死， 有相当多的材料仍是带菌的，这些个体在培养三 天左右就开始长菌，需要及时进行检查和淘汰， 否则还会传染其他个体。
选择适宜的灭菌剂； 筛选恰当的灭菌时间； 增加前处理； 加入表面活性剂； 几种消毒剂配合使用； 二次灭菌； 培养基中加入抗生素。
第二节、外植体的消毒
灭菌on)：用物理或化学方法，杀死物 体表面和孔隙内一切微生物或生物体，即所有 生命的物质全部杀死。
消毒(Sanitization)：杀死、消除或抑制部分微生 物，使之不发生作用。
灭菌(Sterilization)
I. 湿热灭菌法 II. 干热灭菌法 III. 除菌滤过法 IV. 辐射灭菌法 V. 环氧乙烷灭菌法
植物组培外植体消毒详解
植物组培外植体消毒详解外植体的消毒植物组织培养用的外植体大部分取自田间，表面上附着大量的微生物，这是组织培养的一大障碍。
因此在材料接种培养前必须要消毒处理，消毒一方面要求把材料表面上的各种微生物杀灭，同时又不能损伤或只轻微损伤组织材料而不影响其生长。
因此，外植体的消毒处理是植物组织培养工作中的重要一环。
（1）常用的消毒剂常用的消毒剂如下表所示。
理想的消毒剂应具有消毒效果好，易被无菌水冲洗掉或能自行分解，对材料损伤小，对人体及其他生物无害，来源广泛，价格低廉。
常用消毒剂的使用方法及效果①酒精酒精是最常用的表面消毒剂，以70%~75%酒精杀菌效果最好，95%或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固，形成一层干燥膜，阻止了酒精的继续渗入，杀菌效果大大降低。
酒精具有较强的穿透力，使菌体蛋白质变性，杀菌效果好。
同时它还具有较强的湿润作用，可排除材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入。
但酒精对植物材料的杀伤作用也很大，浸泡时间过长，植物材料的生长将会受到影响，甚至被酒精杀死，使用时应严格控制时间。
但酒精不能彻底消毒，一般不单独使用，多与其他消毒剂配合使用。
②升汞又称氯化汞，Hg2+可以与带负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，从而杀死菌体。
升汞的消毒效果极佳，但易在植物材料上残留，消毒后需用无菌水反复多次冲洗。
升汞对环境危害大，对人畜的毒性极强，使用后应做好回收工作。
③次氯酸钠次氯酸钠是一种较好的消毒剂，它可以释放出活性氯离子，从而杀死菌体。
其消毒能力很强，不易残留，对环境无害。
但次氯酸钠溶液碱性很强，对植物材料也有一定的破坏作用。
④漂白粉漂白粉的有效成分是次氯酸钙[Ca(ClO)2]，消毒效果很好，对环境无害。
它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。
⑤过氧化氢也称双氧水，消毒效果好，易清除，又不会损伤外植体，常用于叶片的消毒。
⑥新洁尔灭这是一种广普表面活性消毒剂，对绝大多数植物外植体伤害很小，杀菌效果好。
（2）消毒方法①茎尖、茎段及叶片等的消毒消毒前先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，然后用自来水冲洗。
植物外植体消毒、接种及愈伤组织(芽)诱导
常用消毒剂的区别：
植物细胞工程原理与技术实验
仪器、器具、试剂等：
超净工作台、养基、无菌水、镊子、培养皿、大烧杯、一块脱脂棉、酒 精灯、喷壶、火柴、2%次氯酸钠、75%乙醇、95%乙醇,无菌滤纸等
植物细胞工程原理与技术实验
操作步骤：
1 培养基、用具灭菌（实验一已完成） 2 将所用物品放出超净台中（除实验材料外），打开超净工作台的紫外灯，照射
实验二 植物外植体消毒、接种及愈伤组织（芽）诱导
• 实验目的： • 通过亲自操作掌握外植体接种的无菌操作技术。 • 领会无菌培养对实验材料消毒、接种的要求。 • 学习观察记载的方法。
植物细胞工程原理与技术实验
实验原理：
外植体消毒：外植体接种前要保证外植体处于无菌状态，因此，对于带菌的植物 材料，要进行植物外植体表面消毒。消毒既要使材料表面细菌除去，又要保证植 物材料的活性，这是取得组织培养成功的最基本的前提和重要保证。 接种：已消毒的外植体经无菌操作，接到培养基上，这一过程叫做接种。
愈伤组织诱导：根据植物细胞的全能性，即分化细胞保留着全部的基因组，具有生 长发育所需的全部遗传信息，具有在适宜条件下发育成完整个体的潜能。
外植体在合适的培养基上，通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构的 功能的细胞团------愈伤组织。
影响外植体形成愈伤组织和愈伤组织分化的重要因素是植物生长调节剂。
实验中的注意事项 ：
75%乙醇30s
植物细胞工程原理与技术实验
实验中的注意事项 ：
次氯酸钠10min
旋转
无菌水洗4-5次
取出成熟胚
打开培养基
植物细胞工程原理与技术实验
接种
封口并标记
观察记录：
外植体消毒的一般步骤
外植体消毒的一般步骤在植物组织培养中，外植体消毒是非常重要的一步，它关系到实验的成败。
以下是外植体消毒的一般步骤：1.剪取外植体在消毒前，需要选取健康、无病虫害的外植体。
剪取时要保证无菌操作，避免污染。
一般选取植物的新鲜、幼嫩的部分作为外植体。
2.清洗外植体剪取后的外植体需要用无菌水或酒精进行清洗。
要多次清洗，以去除表面的杂质和细菌。
在清洗时，应注意不要损伤外植体。
3.切除两端为了防止两端感染，在外植体两端用火焰消毒或75%酒精浸泡2-3分钟。
然后切除两端，减小接触面积，避免污染。
4.浸泡在酒精中将外植体完全浸泡在75%酒精中，取出后用无菌水冲洗。
这样可使外植体表面的细菌和病毒失去活性，提高消毒效果。
5.取出并用无菌水冲洗将外植体从酒精中取出，用无菌水冲洗干净。
在冲洗时，要确保每个外植体都冲洗到位，以避免残留物影响培养效果。
6.消毒剂处理在外植体上涂抹一层消毒剂，进行进一步的杀菌处理。
涂抹时要适量，避免过度使用导致外植体损伤。
7.无菌水冲洗用无菌水冲洗外植体，重复多次，确保外植体表面没有消毒剂残留。
在冲洗时，要注意更换无菌水，以确保冲洗效果。
8.滤纸吸干表面水分在外植体表面用滤纸吸干水分，确保外植体保持干燥。
这一步可以有效避免培养过程中出现水分过多导致霉变的情况。
9.接种到培养基中将外植体轻轻插入培养基中，注意不要损坏外植体和培养基。
接种时需要保证无菌操作，避免带入新的污染源。
以上就是外植体消毒的一般步骤，希望能对你有所帮助。
在进行实验时，一定要注意无菌操作，确保每个步骤都符合要求，以获得良好的实验效果。
植物组织培养实务--外植体的选择与消毒
植物组织培养实务--外植体的选择与消毒1、外植体的选择外植体是指植物组织培养中的各种接种材料。
从理论上讲，植物细胞都具有全能性，能够再生新植株，任何器官、任何组织、单个细胞和原生质体都可以作为外植体。
但实际上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大差异，培养的难易程度不同。
为保证植物组织培养获得成功，选择合适的外植体是非常重要的。
（1）选择优良的种质及母株无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质、特殊的基因型和生长健壮的无病虫害植株。
尤其是进行离体快繁，只有选取优良的种质和基因型，离体快繁出来的种苗才有意义，才能转化成商品；生长健壮无病虫害的植株及器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后容易成功。
（2）选择适当的时期组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。
若在生长末期或已进入休眠期时采样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。
花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。
百合在春夏季采集的鳞茎、片，在不加生长素的培养基中，可自由地生长、分化；而其他季节则不能。
叶子花的腋芽培养，如果在1月至翌年2月间采集，则腋芽萌发非常迟缓；而在3-8月间采集，萌发的数目多，萌发速度快。
（3）选取适宜的大小培养材料的大小根据植物种类、器官和目的来确定。
通常情况下，快速繁殖时叶片、花瓣等面积为5mm2，其他培养材料的大小为0.5~1.0cm。
如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。
材料太大，不易彻底消毒，污染率高；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难以成活。
（4）外植体来源要丰富为了建立一个高效而稳定的植物组织离体培养体系，往往需要反复实验，并要求实验结果具有可重复性。
因此，就需要外植体材料丰富并容易获得。
（5）外植体要易于消毒在选择外植体时，应尽量选择带杂菌少的器官或组织，降低初代培养时的污染率。
植物组培外植体消毒详解
植物组培外植体消毒详解Modified by JACK on the afternoon of December 26, 2020植物组培外植体消毒详解外植体的消毒植物组织培养用的外植体大部分取自田间，表面上附着大量的微生物，这是组织培养的一大障碍。
因此在材料接种培养前必须要消毒处理，消毒一方面要求把材料表面上的各种微生物杀灭，同时又不能损伤或只轻微损伤组织材料而不影响其生长。
因此，外植体的消毒处理是植物组织培养工作中的重要一环。
（1）常用的消毒剂常用的消毒剂如下表所示。
理想的消毒剂应具有消毒效果好，易被无菌水冲洗掉或能自行分解，对材料损伤小，对人体及其他生物无害，来源广泛，价格低廉。
常用消毒剂的使用方法及效果①酒精酒精是最常用的表面消毒剂，以70%~75%酒精杀菌效果最好，95%或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固，形成一层干燥膜，阻止了酒精的继续渗入，杀菌效果大大降低。
酒精具有较强的穿透力，使菌体蛋白质变性，杀菌效果好。
同时它还具有较强的湿润作用，可排除材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入。
但酒精对植物材料的杀伤作用也很大，浸泡时间过长，植物材料的生长将会受到影响，甚至被酒精杀死，使用时应严格控制时间。
但酒精不能彻底消毒，一般不单独使用，多与其他消毒剂配合使用。
②升汞又称氯化汞，Hg2+可以与带负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，从而杀死菌体。
升汞的消毒效果极佳，但易在植物材料上残留，消毒后需用无菌水反复多次冲洗。
升汞对环境危害大，对人畜的毒性极强，使用后应做好回收工作。
③次氯酸钠次氯酸钠是一种较好的消毒剂，它可以释放出活性氯离子，从而杀死菌体。
其消毒能力很强，不易残留，对环境无害。
但次氯酸钠溶液碱性很强，对植物材料也有一定的破坏作用。
④漂白粉漂白粉的有效成分是次氯酸钙[Ca(ClO)2]，消毒效果很好，对环境无害。
它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。
⑤过氧化氢也称双氧水，消毒效果好，易清除，又不会损伤外植体，常用于叶片的消毒。
植物组织培养植物组织培养技术灭菌方法无菌操作技术 PPT
材料吸干后,一手拿镊子,一手拿剪子或解剖刀,对材料进行适当的切割。 如叶片切成0、5cm见方的小块;茎切成含有一个节的小段。在接种过程中要 经常灼烧接种器械,防止交叉污染。
3、 接种:
用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。接种后, 将管口在火焰上再灼烧数秒钟,盖上瓶盖。
(7)接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外灯灭菌30min。
注:接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等; 若连续接种,每5天要大强度灭菌一次。
(二)接种技术 (实验课)
1、 消毒:
将初步洗涤及切割的材料放人烧杯,带入超净台上,用消毒剂灭菌,再用无 菌水冲洗,最后沥去水分,取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上。
具体操作过程是:先解开包口纸,将试管几乎水平拿着,使试管囗靠近酒精 灯火焰,并将管口在火焰上方转动,使管口里外灼烧数秒钟。然后用镊子夹取 一块切好的外植体送入试管内,轻轻插入培养基。若是叶片直截了当附在培 养基上,以放1—3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上) 外,其他尚无统一要求。
低全部去掉细胞分裂素,并加入适量的生 长素(NAA、IBA等)。
3、培养过程中常出现的 问题及解决方法
(第四章 植物组织培养中常见问题及解决方法)
A、培养外植体的污染
B、初代培养外植体的褐变培养的环境条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度 等各种环境条件,培养基组成、pH值、渗 透压等各种化学环境条件都会影响组织 培养育苗的生长和发育。
的。
pH值对琼脂的影响:
一般来说当pH值高于6、5时,培养基全变硬; 低于5时,琼脂不能特别好地凝固。
pH值在培养基制作中的变化:
高温灭菌会降低pH值(约0、2—0、8个pH值) pH值大小调整可用0、1M的NaOH和0、IM的HCI来 调整。lml的NaOH可使pH值升高0、2单位,lml的HCl 可使pH值降低0、2单位。调节时一定要充分搅拌均 匀。
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植物组培外植体消毒详解
外植体的消毒
植物组织培养用的外植体大部分取自田间，表面上附着大量的微生物，这是组织培养的一大障碍。
因此在材料接种培养前必须要消毒处理，消毒一方面要求把材料表面上的各种微生物杀灭，同时又不能损伤或只轻微损伤组织材料而不影响其生长。
因此，外植体的消毒处理是植物组织培养工作中的重要一环。
（1）常用的消毒剂
常用的消毒剂如下表所示。
理想的消毒剂应具有消毒效果好，易被无菌水冲洗掉或能自行分解，对材料损伤小，对人体及其他生物无害，来源广泛，价格低廉。
常用消毒剂的使用方法及效果
①酒精
酒精是最常用的表面消毒剂，以70%~75% 酒精杀菌效果最好，95%或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固，形成一层干燥膜，阻止了酒精的继续渗入，杀菌效果大大降低。
酒精具有较强的穿透力，使菌体蛋白质变性，杀菌效果好。
同时它还具有较强的湿润作用，可排除材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入。
但酒精对植物材料的杀伤作用也很大，浸泡时间过长，植物材料的生长将会受到影响，甚至被酒精杀死，使用时应严格控制时间。
但酒精不能彻底消毒，一般不单独使用，多与其他消毒剂配合使用。
②升汞
又称氯化汞，Hg2+可以与带负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，从而杀死菌体。
升汞的消毒效果极佳，但易在植物材料上残留，消毒后需用无菌水反复多次冲洗。
升汞对环境危害大，对人畜的毒性极强，使用后应做好回收工作。
③次氯酸钠
次氯酸钠是一种较好的消毒剂，它可以释放出活性氯离子，从而杀死菌体。
其消毒能力很强，不易残留，对环境无害。
但次氯酸钠溶液碱性很强，对植物材料也有一定的破坏作用。
④漂白粉
漂白粉的有效成分是次氯酸钙[Ca（ClO）2] ，消毒效果很好，对环境无害。
它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。
⑤过氧化氢也称双氧水，消毒效果好，易清除，又不会损伤外植体，常用于叶片的
消毒。
⑥新洁尔灭
这是一种广普表面活性消毒剂，对绝大多数植物外植体伤害很小，杀菌效果好。
（2）消毒方法
①茎尖、茎段及叶片等的消毒
消毒前先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，然后用自来水冲洗。
对于一些表面不光滑或长有绒毛的材料，可用洗涤剂清洗，必要时用毛刷充分刷洗，硬质材料可用刀刮。
消毒时在超净台上操作，先用70%酒精浸泡10~30s ,以无菌水冲洗2~3次, 然后按材料的老、嫩和枝条的坚实程度，分别采用2%次氯酸钠浸泡10~15mi n
或用0.1%升汞浸5~10min。
消毒时要不断搅动，使植物材料与消毒剂充分地接触。
若材料有绒毛，最好在消毒液中加入几滴Tween-20 ,最后用无菌水冲洗3~5 次。
②果实及种子的消毒
先用自来水冲洗10~20min，再用酒精迅速漂洗一下。
果实用2%次氯酸钠浸
10min，后用无菌水冲洗2~3次。
种子则先用10%次氯酸钠浸泡20~30min，难以消毒的可用0.1%升汞消毒5~10min。
对于种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮，再用4%次氯酸钠浸泡8~10min。
③花药的消毒
用于组织培养的花药多未成熟，其外面有花萼、花瓣或颖片保护，处于无菌状态。
消毒时将整个花蕾或幼穗用70%酒精浸泡数秒钟，然后用无菌水冲洗2~3 次，再在漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗2~3次。
④根及底下部器官的消毒
由于这类材料生长于土壤中，表面带菌量大，消毒较为困难。
可先用自来水冲洗，软毛刷刷洗，用刀切去损伤及污染严重部位，再用酒精漂洗后，置于0.1% 升汞中浸
5~10min或2%次氯酸钠中浸10~15min，最后用无菌水冲洗3次。
在操作时要根据材料的大小、幼嫩、质地等差异做出判断后，再选择适宜的消毒剂种类、浓度和消毒时间，切不可生搬硬套。
消毒的最佳效果应以最大限度地杀死材料上的微生物，而又对材料的损伤最小为好。