红细胞内源性硫化氢的测定_赵晶

A ssay of endogenous hydrogen sulfid e from erythrocytes
ZHAO Jing1, 2, FANG L i ping1, XU G e yang2, TANG Chao shu1, 2, GENG B in1, 2 ( 1. Institute o f Ca rdiovascular R esearch, Pek ing U n iversity F irst H ospita ,l Be ijing, 100034, China; 2. Departm ent o f Physio logy and Pa thophy sio logy, P ek ing U n ive rsity Schoo l o f Basic M edical Sciences)
北 京大学学报 (医学版 ) JOURN AL O F PEK ING UN IVERS ITY ( HEALTH SC IENCES ) V o.l 39 N o. 5 O ct. 2007
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科研快报
红细胞内源性硫化氢的测定
赵 晶 1, 2, 房立平 1, 许戈阳 2, 唐朝枢 1, 2, 耿 彬 1, 2
AB STRACT Objective: T o construct a detect ion m ethod of endogenous hydrogen sulfide ( H 2S) from e rythrocytes. M ethod s: P repared rat ery throcy te ( 106 cell) w as added in 4 m L 2 am ino 2 m ethy l 1, 3 propaned id ( 225 mm o l/L, pH = 9. 55) and transon ically lysed fo r 3 tim es. T he erythrocyte lysis w as tran fered into a 25 mL E rlenm eyer flask and m ercaptopyruvate w as added for f inal concentration of 2 mmo l /L. C ryov ial test tubes ( 2 mL ) w ere used as the cen tre w e lls each conta ined 0. 5 m L o f 1% zinc acetate as trapping so lu tion and a filter paper of 2. 0 2. 5 cm2 to increase the a ir/ liquid contacting sur face. T he flasks conta in ing reaction m ix ture and centre w ells w ere f lushed w ith N2 before being sealed w ith a double layer of P arafilm. R eaction w as in itiated by transferring the flasks from ice to a 37 sha k ing w ater bath. A fter incubation at 37 for 60 m in, 0. 5 mL of 50% trichloroacetic acid w as added in to the reaction m ix ture to stop the reaction. The flasks w ere sealed aga in and incubated at 37 for an other 60 m in to ensure a comp lete trapp ing o f the H2 S re leased from the m ix ture. Re leased H 2 S is ab sorbed by zinc acetate and generation zinc sulfide. T he zinc sulfide form ed is dissolved in a hydroch loric acid so lut ion of pam inod im ethy laniline ( N, N dim ethyl p phenylened iam ine ) , and m ethy lene b lue is form ed w ith in 10 m in at room tem perature in the presence o f ferric ch loride. The b lue co lor o f m ethy lene blue is m easured at 670 or 650 nm on spectropho tom eter. Resu lts: W e first dem onstrated the key en zym es of endogenous H2 S generation 3 m ercaptopyruvate sulfurtransferase ( M PST ) gene expression by RT PCR. EndogenousH 2 S production from rat erythrocy tesw as 22. 76 1. 53 m o l/m in / 108 ce lls, a bout 4 folds as compared w ith to the liver and kidney tissues. H ow ever, the endogenous H2 S production from erythrocyte by L cysteine pathw ay w as little detected. Conc lusion: Endogenous H2 S re leased from erythrocytes depended m ain ly onM PST pathw ay. Our m ethod is effect ive to detect the erythrocyt ic endog enous H2 S. K EY W ORDS H ydrogen su lfide; E ry throcy tes; Su lfurtransferases
1 材பைடு நூலகம்与方法
1. 1 材料 Sprague Daw ley ( SD ) 大鼠, 体重 200~ 250 g,
由北京大学医学部实验动物中心提供; 按照中华人 民共和国卫生部医学实验动物管理实施细则 (编号 19890503) 和北京大学第一医院动物管理条例执行。 L Cys、磷酸 吡多 醛、 m ercaptopy ruvate 购自 S igm a 公司, 2 am ino 2 m ethy l 1, 3 propanedid购自 F luka公 司。 T rizol 和 dNTP 购 自 普 利 莱 基 因 技 术 公 司, MM LV 逆转录酶、T aq酶、RNA sin、O ligo( dT ) 15 P rim er 为 P rom ega 公 司 产 品。 MPST 上 游 引 物 ( 5 GGCTCAGTAAACATCCCATTC 3 ) 和 MPST 下游 引 物 ( 5 TGTCCTTCACAGGGTCTTCC 3 ), GAPDH 上 游 引 物 ( 5 GCAAGTTCAACGGCACAG 3 ) 和 GAPDH 下游引物 ( 5 GCCAGTAGACTCCACGACAT 3 )由北京擎科生物技术有限公司合成, 其余试剂均 为市售分析纯试剂。 1. 2 RT PCR 检测红细胞 M PST mRNA 的表达 [ 7 ]
基金项目: 国家重点基础研究发展规划项目基金 ( 2006CB503807) 及国家自然科学基金 ( 30400151 ) 资助 Supported by th eM ajor S tate Basic R esearch D evelopm en t Program of the People s R epub l ic of Ch ina ( 2006CB503807) , and N at iona lN atural Science Foundat ion of Peop le s R epub lic Ch i na ( 30400151)
是新发现的气体信号分子 [ 2] , 有重要的心血管系统 的生理功能和病理生理调节作用 [ 3, 4] 。哺乳动物细 胞胞浆内以 L 半胱氨酸 ( L C yste ine, L C ys) 为底物, 在胱硫醚 合酶 ( cysta th ionine synthase, CBS) 和 胱硫醚 裂解 酶 ( cystath ion ine lyase, CSE ) 的作 用下产生 H2 S; 在线粒体内, 则以 巯基丙酮酸为底 物, 在巯基丙酮酸转硫酶 ( sulphurtransferase, M PST ) 的作用下产生 H 2 S[ 5] 。红细胞内富含 MPST, 与硫氰 酸生成酶 ( rhodanase) 有相似的结构域, 具有解除氰 化物毒性的功能 [ 6] 。本研究根据 MPST 酶解产生硫 化氢的原理, 构建 了红细 胞内源性 H2 S 测 定的方 法, 以便用于探讨红细胞内源性 H 2 S的生理和病理 生理意义的实验研究。
( 北京大学 1. 第一医院心血管研究所, 北京 100034; 2. 基础医学院生理学与病理生理学系 )
[ 摘 要 ] 目的: 建立测定红细胞内源性硫化氢 ( hydrogen su lfide, H 2 S)的方法。方法: 根据红 细胞硫化 氢生成酶的 理化特性, 给予酶的底物 巯基丙酮酸, 并根据亚甲基 蓝法测定释放硫化氢的量。结 果: 应 用 RT PCR 方法检测到 红细胞内存在巯基丙 酮酸转硫酶 ( 3 m ercaptopy ruv ate su lfurtransferase, M PST )的 表达; 红细 胞内源 性硫化氢 的产率 高达每 108 个 细 胞 ( 22. 76 1. 53 ) m o l/m in, 约 是 肝和 肾 组 织 内 硫 化 氢 生 成 率 的 5 倍。 而 检 测 L 半 胱 氢 酸 ( L cyste ine, L cys)途径内源性硫化氢的产 率, 并以肝和肾作为 阳性对 照组织, 发现 红细胞 内几乎 检测不到 硫化氢 的产生。结论: 红细胞内源性硫化氢的产生主要依赖 M P ST 途径, 本研究构建的方法可应用于红细胞生成硫化氢的 检测。 [ 关键词 ] 硫化氢; 红细胞; 硫基转移酶类 [ 中图分类号 ] R 331 141 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 1671 167X ( 2007) 05 0449 04
C orresponding au thor s e m ai,l b ingeng@ b jmu. edu. cn
北 京大学学报 (医学版 )
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JOURNA L OF PEK IN G U N IV ER S ITY ( HEA LTH SC IEN CES) V o.l 39 N o. 5 O ct. 2007
红细胞主要参与机体氧气的运输, 近年的研究 也表明红细胞可以分泌一氧化氮 ( NO )、环氧二十碳 三烯 酸 ( epoxyeicosatrieno ic acid, EET ) 、前 列 腺素 E2等多种活性物质, 参与血流动力学、止血作用及
血栓形成等的生理调节。红细胞分泌的生物活性分 子的紊乱在高血压、缺血性心脏疾病以及动脉粥样 硬化等心血管疾病的病理生理进程中有重要的调节 意 义 [ 1] 。内 源 性 硫 化 氢 ( hydrogen sulfide, H 2 S )