药物代谢动力学研究中的生物样品分析

药物代谢动力学研究中的生物样品分析

王宁生

主题词：@生物样品/分析；@生物样品分析/药代动力学

分类号：R912.1；R927.2

文献标识码：A

无论在临床药理、药物作用机理研究或新药开发研究，药物代谢动力学越来越显示出其重要性和必要性。药物代谢动力学研究获得的资料最终能否用于临床实践或药物研究结果的说明和解释，取决于研究方案和生物样品分析方法的设计和实施。

应用于化学药品及天然药物有效成分(包括中药和中药复方)分离、检测的方法和技术已有大量文献资料和研究报导，尤其是一些新技术、新方法的应用，使分析和检测手段越来越快捷、准确。然而应用于药物代谢动力学研究的生物样品分析方法，除正确设计和精心实施外，尚应包括了解该方法的特性及其限制因素。方法的特性包括被测物在体液中的稳定性，分析测试方法的灵敏度，选择性，萃取过程的回收率，定量计算的线性关系，工作曲线，以及方法的精密度和准确度。

1 方法学验证

1.1 稳定性

从生物样品(体液)的收集到样品的分析完成，样品中的待测药物(有效成分)必须是稳定的。否则将导致易变的回收率并降低测定的准确度和精密度。在分析方法建立的过程中，应了解待测成分(药物)在不同的pH、光照等情况下的稳定性，同时也应了解、考察生物样品及分析操作过程中待测成分的稳定性。这一点对中药药代动力学的研究来说应特别注意，因为除待测的有效活性成分外，中药中尚有许多未知成分，在不同的环境和条件下，这些成分与待测成分的相互作用，可能导致待测成分“量”和/或“质”的改变。

体液中药物稳定性的考察应包括在室温和储藏温度(-20℃或-80℃)两种情况的研究。如发现有明显的降解，则应采取特殊措施来防止。(如尿液中加甲苯以抑制细菌生长，含三硝基甘油血清中添加少量硝酸银抑制三硝基甘油的降低等)。如要了解较长时间的储藏对药物稳定性的影响，一般是制备与分析样品含有相同药物(成分)和代谢物的对照样品，两者作平行处理，从对照样品的分析结果可判断药物稳定性的情况。

1.2 灵敏度

分析方法灵敏度的要求取决于药代动力学研究时所用药物的剂量，给药次数及药物在体内的吸收、分布、代谢和消除等特征。临床前或临床(药理)资料有助于分析方法的选择和确定。一般来说，分析方法应有一定的浓度范围。但在药代动力学研究中，药物或代谢物的浓度不是一成不变的，此时可采用一些简便的方法(如样品的稀释)，使样品中待测成分的浓度落在测定的浓度范围内。虽然在同一研究中可用不同的分析方法，但应尽量避免，以利于研究结

果的统计分析。

1.3 选择性

选择性是涉及分析方法在内的特异性(能力)。色谱分析中方法的选择性是指待测药物的色谱峰与其他组分的色谱峰间的基线分离。在分析方法建立过?#程?#中，应注意了解

某些成分对分析的干扰，如内源性物质、药物的代谢物、食物及可能的合并用药，特别是中药中某些未知成分对分析的干扰。

空白样品的分析可以了解内源性物质的干扰，空白样品中加入可能来自合并用药等成分的分析，可以了解外来成分的干扰。然而这种方法不能解决药物的代谢物，或中药中共存的未知成分带来的干扰，此时可用特殊的分析手段如气相-质谱(GC-MS)或高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析方法，它们有着绝对的专一性。吸收度比，光电二极管矩阵检测，蒸发光散射检测，或双检测器(紫外、荧光)的应用也是一些特殊的方法。在缺乏上述技术时，应仔细比较各色谱峰的峰型和保留时间。

采用某一种分析方法对Ⅰ期临床(Phase Ⅰ)的健康志愿者药代动力研究可能是合适的，但对Ⅱ、Ⅲ期临床(PhaseⅡ、Ⅲ)的药代动力学研究不一定合适，因为Ⅱ、Ⅲ期临床研究的对象是病人而不是健康志愿者，病人年龄的差异和/或肝肾功能不全可能影响药物的代谢和清除，过多的合并用药也可能产生新的干扰。因此，在整个研究过程中，分析方法的选择性必须仔细考察。

1.4 回收率

回收率应包括整个研究浓度范围内的回收率。理想的回收率是100%，但这是不可能的。一般要求回收率高于(75%±10%)(±s)，而且低浓度和高浓度的回收率在统计学上比较不存在差异。应该注意疏水性药物易被玻璃器皿表面吸附而降低回收率的现象，高浓度时由于吸附作用点被饱和，这种现象表现不显著，但在低浓度时表现得较为明显，此时易造成工作曲线由线性变为非线性，使一些在低浓度测得的药代动力学参数(如消除半衰期)产生较大的偏差。

回收率低或不恒定，则应改进样品的制备萃取技术。对于某些回收率不稳定的分析方法可以用内标加以修正。但应注意，不准确的内标回收率则会导致额外的分析误差和更大的资料偏离。

1.5 线性关系

由于生物样品中药物浓度变化的差异较大，因此分析方法的线性范围应该足够大(如两个数量级范围)，来适合于样品的变化。对线性范围大的分析方法应检查其是否属方差齐性。如是方差不齐，则需用加权回归法。一般来说，浓度范围大的工作曲线最好用加权线性回归处理。

1.6 工作曲线的精确度和准确度

如果求得的相关系数接近1 ，认为在一定的浓度范围内方法是属线性的，有时这种推断不一定正确。在非加权最小二乘法中，最高浓度有最大权重，而所有偏差是靠最低浓度时将它们减至最小。低浓度时，当线性范围增加 1.7 个对数单位以上时，可产生100% 的相对误差。相对误差可用回归参数对计算标准进行逆运算决定。以逆运算的结果和实测的相对误差，再进行统计学和线性关系的评价。对分析样品而言，工作曲线的精密度和准确度以及相对误差应不超过10% ，如达不到此要求，应考虑用加权回归分析。通常制作工作曲线时，同一浓度需要制备3～5 个样品，这种因变量有重复的直线回归可用加权直线回归。权重是每组重复数ni(i=1，2，……，k)。如各组的方差相同，或各组的估计方差Si2(i=1，2，……k)无显著性差别，仍可用最小二乘法作简单直线回归，如各组因变量有不同的方差，即：S12，S22，……Sk2间有显著性差别，则需用加权直线回归，这时每组因变量平均权重Wi=n1/Si2，即权重与重复数ni成正比，与估计方差Si2成反比。加权回归直线同样可利用最小二乘法。即要求

∑wi(yi-a-b。xi)2=minimum

根据求极小值方法，回归直线y=a+b。

其中a=-b。

加权回归直线斜率b的标准误：

斜率b的近似95% 可信限为b=±2Sb

与非加权回归分析比较，相关系数可能减小，但由于精密度和准确度的改善，可明显增加方法的适用范围。

1.7 方法的精密度

在整个计算范围内，应评价系统和方法的精密度。系统的精密度指所使用的仪器的可变化性。方法的精密度指样品制备和附加步骤的可变化性。在药代动力学的研究中，方法内与方法间的精密度的相对误差应在±10%之内。

1.8 方法的准确度

方法内和方法间的准确度可用对照样品中的实验浓度代替检测器的响应代入进行测试。从实测浓度和理论浓度间的差别可求得相对误差。同时应注意回归分析对准确度的影响，特别是在低浓度时。在整个计算范围内，相对误差应小于10%。

1.9 常规样品分析

常规样品与对照样品应作平行操作分析。只有当对照样品分析结果与先前预分析的结果一致时(±10%的相对误差)，则研究样品的分析结果才可认为是有效的。否则应对未知的误差来源加以确定和修正，再进行样品重新分析。