显微切割
显微切割技术的原理和应用
显微切割技术的原理和应用1. 前言显微切割技术是一种精密的材料加工方法，通过显微镜和尖锐工具的组合使用，可以对微小物体进行切割、雕刻和加工。
本文将介绍显微切割技术的原理和应用。
2. 基本原理显微切割技术的基本原理是通过显微镜观察待切割物体，并使用尖锐工具进行精确的切割。
其具体步骤如下：1.选材：选择一种适合显微切割的物体，如纤维、生物样品、微电子元件等。
2.制备样品：将需要切割的物体进行固定和制备工作，如研磨、抛光等。
3.显微观察：使用显微镜观察待切割物体，调整显微镜的焦距和光源亮度，以获得清晰的视野。
4.定位：确认需要切割的位置，并进行标记。
5.切割：使用尖锐的工具，如显微刀、显微剪等，按照标记的位置进行精确的切割。
6.清洁：清洁切割后的样品，以便进行后续的使用或观察。
3. 应用领域显微切割技术在许多领域具有广泛的应用，主要包括以下几个方面：3.1 生物学显微切割技术在生物学研究中起着重要的作用。
例如，在组织学研究中，显微切割技术可以用来制作组织切片，以便观察和分析细胞结构和功能。
另外，在遗传学和分子生物学研究中，显微切割技术也可以用来切割和处理微小的生物样品，以进行基因测序和分析等工作。
3.2 材料科学显微切割技术在材料科学领域有广泛的应用。
例如，在纤维材料研究中，显微切割技术可以用来切割和处理纤维样品，以进行纤维结构和性能的分析。
另外，在微电子元件研制中，显微切割技术可以用来切割和加工微小的电子元件，以提高其性能和稳定性。
3.3 纳米技术显微切割技术在纳米技术领域也有重要的应用。
由于显微切割技术具有高精度和高灵活性的特点，可以用来对纳米材料进行精确的加工和切割。
这对于纳米器件的制备和研究具有重要意义。
3.4 医学显微切割技术在医学领域主要应用于病理学和微创手术等方面。
例如，在病理学中，显微切割技术可以用来制作病理切片，以进行疾病诊断和治疗。
另外，在微创手术中，显微切割技术可以用来进行精确的外科手术和组织修复。
显微操作技术名词解释
显微操作技术名词解释
显微操作技术是一种通过使用显微镜进行微小尺度物质操作的技术。
以下是几种常见的显微操作技术：
1.显微注射：显微注射是一种利用显微镜实现的微小容器内液滴注射技术。
通过操纵显微镜下的注射器，可以将液体精确地注入到微小容器内，例如细胞或微流体芯片中。
2.显微切割：显微切割是一种通过显微镜引导下的切割工具实现的微小组织或细胞切割技术。
此技术常用于细胞分离、胚胎操作等领域。
3.显微组装：显微组装是利用显微镜下的操作工具将微小物体进行精确组装的技术。
该技术常用于微芯片制造、纳米材料组装等研究领域。
4.显微绘图：显微绘图是一种通过显微镜下的操作工具进行微小尺度图案绘制的技术。
该技术常用于纳米器件的设计和制造等领域。
此外，还有其他一些显微操作技术，如显微操纵、显微测量、显微刻蚀等。
这些技术在微纳米领域的研究中起到了重要的作用。
拓展中的显微操作技术正在不断发展，如通过扫描探针显微镜实现的原子力显微镜操作、通过液力控制的微流体操作等，这些技术提供了更高分辨率和更精确的微小尺度物质操作能力。
激光捕捉显微切割技术操作流程
激光捕捉显微切割技术操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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Leica AS LMD激光显微切割系统
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各种 固定剂 固定
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染色 或不 染色
免疫细胞 化 学染色
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以 上 为本科 室激 光 显 微 切 割 系 统 完成 样 品
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充分 显 示 出该技 术准确性 高
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与形 态 学紧密结合
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保 证 分 子 结 构 完整 等优越 性
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目前 国 际 上 很 多 重 要 的 研 究
其材料 的获取都利用
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组 织 切 片 (包 括
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新鲜冷冻组 织
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为 实验 提 供 科 学依 据
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不 会 产 生 高热 和 高能量 影 响样 品
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形 态 观 察更 清 晰
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应 用 软件 控 制 可 采 集微 切 割 前 后 组 织 图像
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在 显 微镜 下 可 观 察 回 收 的细胞
。
，
整
个切 割过 程 可 在 计 算机 屏 幕 上 实 时观 察
显微切割技术章
第七章显微切割技术人体组织是由相互作用的不同的细胞群体组成的，这些细胞群体彼此组成复杂的三维结构，每种细胞均有自己的独特的mRNA与蛋白质表达（表现型）。
因此在复杂的组织中取得同质性的样本是相当困难的。
尤其在肿瘤的病理学研究中，样本的同质性是经常遇到的问题。
例如，霍奇金病的肿瘤细胞——Reed-Sternberg细胞和Hodgkin细胞（R-S/H细胞），通常单个分散在大量的反应性细胞（如淋巴细胞、组织细胞、嗜酸性粒细胞和浆细胞）组成的背景之中，给R-S/H细胞起源的研究带来很大的困难。
随着分子病理学研究的深入，需要分离的样本越来越小，从大块的组织精确到单个的细胞，甚至细胞器或者染色体。
常规的研究方法对此无能为力，而显微切割技术的出现解决了上述难题。
在显微切割技术（microdissection technique）发展之前，进行原位的细胞表型的研究方法是免疫组化和原位杂交。
但是免疫组化和原位杂交方法一般只能局限于一种或是几种基因表达的分析，而且难以进行DNA、mRNA和蛋白质的定量分析（如突变、缺失）。
显微切割技术能够对于组织病理学上确定的细胞群（甚至精确到一个特定的细胞，或特定的细胞器或特定的染色体）进行分子病理学研究，达到高度敏感性和高度特异性的统一。
尤其是在需研究的细胞只占样本中细胞的少数时，以及需研究的细胞呈散在分布时，显微切割的重要性尤为明显。
加之现在的免疫组织化学和原位杂交等技术可以在切片上特异性定位所需的细胞，因此显微切割技术在最近几年中得到了迅速地发展。
由于和高通量（high-throughput）基因分析（基因芯片）以及蛋白分析技术结合，显微切割技术显示出良好的发展前景（图7-1）。
图7-1一、显微切割技术发展的回顾组织显微切割的概念尤为简单，即直接在光学显微镜下从异质性的组织样本中选取某一特定的细胞群。
实际上，要达到这一目的在技术上经历了以下几个阶段：早期是从冰冻组织切片上在肉眼下用解剖刀刮去不需要的部分，剩下感兴趣的组织。
空间蛋白质组 华大 显微切割
空间蛋白质组华大显微切割华大显微切割技术是一种应用于空间蛋白质组研究的先进技术。
本文将介绍华大显微切割技术的原理和应用，并探讨其在空间蛋白质组研究中的重要性和前景。
华大显微切割技术是华大基因公司开发的一项领先的细胞切割技术，通过精确的激光切割和高效的细胞收集系统，实现对细胞的快速、准确和无损切割。
该技术可以应用于多种细胞类型，包括悬浮细胞和贴壁细胞。
华大显微切割技术的原理基于激光切割和光学显微镜的结合。
首先，利用激光器产生高能量的激光束，然后通过光学镜头将激光束聚焦到微米级别的细胞表面。
接下来，激光束在细胞表面形成一个焦点，并产生高能量密度，从而引起细胞表面的局部热损伤。
最后，利用激光切割系统的移动控制，将焦点沿着细胞表面移动，实现对细胞的切割。
华大显微切割技术的一个重要应用领域是空间蛋白质组研究。
空间蛋白质组是指在细胞内不同亚细胞结构和细胞器中存在的蛋白质组成。
研究空间蛋白质组可以揭示细胞内蛋白质的分布和功能，对于理解细胞的结构和功能具有重要意义。
传统的蛋白质组学研究方法往往无法准确地确定蛋白质的定位和分布，因为细胞内蛋白质的定位通常是高度动态和空间异质的。
然而，华大显微切割技术的出现改变了这一局面。
通过利用显微切割技术，可以将细胞切割成不同的区域，并收集每个区域中的蛋白质样品。
通过进一步的质谱分析和蛋白质鉴定，可以确定每个区域中的蛋白质组成和定位。
华大显微切割技术在空间蛋白质组研究中的应用具有多个优势。
首先，它可以实现对细胞的高分辨率切割，从而获得更准确的蛋白质定位信息。
其次，该技术具有高通量的特点，可以同时处理多个细胞，大大提高了研究效率。
此外，显微切割技术还可以实现对特定亚细胞结构的切割，如细胞核、线粒体等，从而更加精确地研究相应的蛋白质组成和功能。
空间蛋白质组研究是当今蛋白质组学领域的一个重要研究方向。
通过揭示细胞内蛋白质的空间分布和相互作用，可以深入理解细胞的功能和调控机制。
华大显微切割技术的出现为空间蛋白质组研究提供了一种强大的工具，将进一步推动该领域的发展。
MMI CellCutPlus 激光显微切割系统 用户培训手册说明书
基因有限公司技术支持部 二零一九年 八 月MMI CellCut®Plus 激光显微切割系统培训手册目录一、CellCut®激光显微切割系统技术特点二、系统安装条件三、培训所需试剂设备及样品四、安装及调试安排五、培训程序及时间安排六、仪器及试剂系统介绍七、仪器使用培训八、维护保养九、常见问题处理十、常用快捷方式十一、注意事项附录一、CellCut®激光显微切割系统技术特点CellCut®激光显微切割（荧光）系统，是通过紫外激光切割需要分离的组织，然后通过有黏性的Eppendorf管盖进行收集，这样就可以将特定类型的细胞从组织切片上分离下来。
它主要应用于石蜡、冰冻切片，细胞培养片，以及细胞涂片等各种样本的特定类型细胞的分离。
它的应用涉及：通过细胞形态及基因分析对肿瘤的深入研究基因表达与疾病类型之间关系的研究肿瘤发生的特异的基因表达，基因组研究微卫星序列不稳定性基因定量，单细胞PCR蛋白质研究HGP，生物化学与分子生物学核酸研究，蛋白质研究生物芯片（DNA芯片，基因芯片，蛋白芯片）定量PCR，细胞生物学研究肿瘤学研究，病理学研究比较基因组杂交等众多研究领域二、系统安装条件1.稳定水平的操作平台放置设备，远离热源，避免阳光直射2.空间及载重要求：操作平台尺寸（长×宽×高）：150m×90m×71m以上3.温度要求：5℃-40℃4.湿度要求：50%（40℃）-80%（31℃）电源：220V AC，推荐配置不间断电源（UPS）。
5.其它：通用插头接线板（至少5个插孔）三、培训所需试剂及样品1.组织切片：进行显微切割需使用mmi膜片，这种膜片的一侧铺有一层PET膜，该膜为惰性材料，且几乎无自发荧光。
制片时，将样品平铺在膜片平整的一面，并且处于金属框内。
为了增加PET膜的黏性，同时清洁膜，可以使用紫外光照射PET膜15-30min，照射的时间不要超过30min，否则会破坏膜。
显微切割技术
显微切割技术中国医科大学科学实验中心显微切割技术( 显微切割技术(Microdissection) Microdissection)：是在显微 状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲 选取的材料（组织,细胞群，细胞，细胞内组 分或染色体区带等）进行切割分离并收集用 于后续研究的技术。
显微切割技术实际上属 于在微观领域对研究材料的分离收集技术， 因此应用此技术往往是许多要深入的研究工 作中起始的重要一步。
是一种有效的细胞纯化技术， 是一种有效的细胞纯化技术 ， 可在基本不损伤细 胞内DNA 胞内DNA、 DNA 、RNA和蛋白质并保持组织细胞结构完整的条件 RNA 和蛋白质并保持组织细胞结构完整的条件 下，从组织中分离出同质细胞群 从组织中分离出同质细胞群、 同质细胞群、单个细胞甚至亚细胞 结构。
结构。
技术的必要性： 技术的必要性： 研究对象的异质性 研究对象的异质性 研究材料日趋微小 研究材料日趋微小基于流式细胞术 流式细胞术的荧光激活细胞分选： 流式细胞术 显微切割是目前从组织或细胞单层分离亚群细 显微切割 胞的有效方法，同时实现将组织中每种细胞群显微切割技术能够使作为研究对象，其分子表达谱会非常接近体内 状态 离心技术我们分离得到特异的 目的细胞，而没有周 围细胞的污染。
显微切割的特点2“原位”，利用显微切割技术是在组织细胞或染色体的原位取材，1 “细微”，由于是在显微状态并采用特殊的分 离收集手段，显微切割的对象可以达到微米 级，显微切割的精度可以达到毫微米级，因此 利用显微切割技术可以分离收集到象核仁和包 涵体及染色体特异区带这样细微的对象 。
因此所取材料的定位清楚，所研究对象的历史背景明确。
例如何杰 金氏淋巴瘤中瘤组织成分多样,特征性的瘤细胞(R-S细胞及其变异 型)占细胞成分的2%左右,且呈散在性分布,如果常规地用组织匀浆 的方式从组织中提取蛋白质或核酸，则既包含了来自瘤细胞的成 分，又包含了来自淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细 胞、组织细胞等多种非瘤细胞的成分,这样所提的蛋白质或核酸来 自何种细胞并不清楚，而如果用显微切割技术则可以选择我们需要 的细胞，以使研究对象的历史背景明确 。
激光捕获显微切割技术在胃肠道肿瘤研究中的应用
激光捕获显微切割技术在胃肠道肿瘤研究中的应用邢敬【摘要】激光捕获显微切割(IJCM)技术是一种在显微镜直视下,通过激光捕获和切割从异质性组织中获得纯净目的细胞群或单个细胞的技术.该技术既解决了组织异质性问题,又不脱离体内环境,是连接病理学与分子生物学研究不可或缺的桥梁.我国是胃癌高发地区,近年来结直肠癌的发病率亦逐渐升高.为此,本文对LCM的操作步骤及其与多种技术结合,在胃肠道肿瘤研究中的应用作一综述.%Laser capture microdissection (LCM) is a technique that allows the procurement of pure cell populations or single cells from heterogeneous tissue under direct microscopic visualization. By this technique, the limitation of tissue heterogeneity can be solved and cells can be obtained while keeping their natural environment. Therefore, LCM can serve as an indispensable bridge connecting the pathological and molecular biological investigations. As the incidence of gastric cancer is high in China, and colorectal cancer becomes more prevalent in recent years, the procedure of LCM and its application in association with other techniques in studies of gastrointestinal tumors were reviewed in this article.【期刊名称】《胃肠病学》【年(卷),期】2011(016)004【总页数】4页(P242-245)【关键词】激光捕获显微切割;胃肠肿瘤;聚合酶链反应;逆转录聚合酶链反应;蛋白质组学【作者】邢敬【作者单位】上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科上海市消化疾病研究所,200001【正文语种】中文人体组织是由多种细胞组成的复杂结构，实体瘤组织如胃肠道肿瘤不仅包含肿瘤细胞（实质成分），还包含其他多种类型的细胞和基质（间质成分），如各种炎性细胞、纤维结缔组织等，因此通过直接研磨组织块提取DNA、RNA、蛋白质等进行研究并不能确切反映肿瘤的生物学特性。
激光显微切割简易操作手册
激光显微切割简易操作1.开机：先开电脑 CTR6500控制器，显微镜自检，自检结束后前面触摸屏上显示基本信息开laser 控制器，打开电源开关，把钥匙拧到on 的位置，laser控制器预热5-10分钟，待右侧指示灯变绿如果使用荧光，打开EL6000的光源开关双击桌面上显微切割软件的快捷方式，进入软件。
2.TL-BF明场切割过程：1)点击样品夹unload，选择样品夹类型，放上样品，磨面朝下，点击continue，样品夹退回机器；2)点击收集管unload，选择收集管类型，安装收集管，PCR管半径值默认为3，8连排为4，点击continue，收集管退回机器；3)选择收集管盖/孔。
点击对话框左下方的收集装置，选择收集管盖/孔（A、B、C或D），被选中的管盖，颜色由红变绿。
4)点击micro control，选择TL-BF，选择物镜的倍数，FL调到最大，一般切割大的区域选择6.3X或10X，如果是单细胞20、40、60倍，如果切割亚细胞器、染色体用150X；5)找到样品画面，对焦，调出清晰画面，如果画面效果不好，点击camera菜单下的setting window，调节自动白平衡，调好画面后，关闭界面；6)找到目标区域，选择single（单图切割）还是multi(多图切割)，选择draw+cut，画出要切割的区域，有line , 椭圆，矩形，画完区域选择指定的收集管，点击下面收集管，颜色与区域一样，在shape list中可以看到收集管的位置；7)点击laser menu下的laser control，调节激光的设置，开始可以把power 低一点，切割的aperture窄一点看看效果，摸索条件，specimen balance调到0；8)点击start cut 开始切割，如果切割很好，不用修改激光参数，如果不好适当调整激光参数；9)切割结束后，点击collector，查看收集管中切割的样品，找到样品，点击收集管unload，退出收集管，进行后续实验；10)点击specimen回到样品界面；11)测量。
激光显微切割
The History of LMD
1965 ，Baxter TJ，肾小管 1990‘s ，紫外激光切割超薄膜上的组织 1996，NIH，红外激光光源，转运膜技术 美国Arcturus 公司：热塑膜 德国PALM 公司：激光脉冲所产生的压力
Advance of LMD
⑴无破坏性，用于粘附目的细胞的热塑膜厚度约为 100～200 μm, 能够吸收激光产生的绝大部分能量， ⑵高精确性，激光定位的准确程度可以达到1 μm， 切割直径可以小到2 μm，捕获点范围达到3～5 μm， ⑶高效率，每次激发耗时不超过1秒, ,单张转运膜 可以一次捕获上万个细胞； ⑷自动化程度高，全电脑操作 ⑸无污染，使用全封闭操作，能避免外来物质的污 染。
激光捕获显微切割技术 Laser Micro-Dissection (LMD)
Definition of LMD
显微镜下用手工或仪器采样的方法从组织切 片或细胞涂片上将所要研究的形态或表型相 同的细胞从组织三维构造中分离出来，获得 纯的细胞群（pure cell population），以备 进一步作分子水平的研究。显微切割技术的 贡献就是克服了组织的细胞成分非常繁杂这 一重大的缺点。 Laser capture microdissection
Annotation: How to prepare frozen section
1. 取 材：取新鲜的组织。 2. 固 定：组织固定于10%中性福尔马林,冰冻切片。 3. 切 片：
利用切片机的厚度调节旋钮调节切片厚度，调整切片角度， 安装切片刀。 将样品放到样品托上，利用包埋剂固定，放到冷台上冷冻， 在即将完成冷透前用热交换装置压平。 将样品放到样品头上，用样品快进按钮将样品移近刀口， 利用慢进按钮开始修片，修好后即可放下防卷板切片，使 切出的样品进入防卷板与刀片的狭缝，取出后染色观察
激光捕获显微切割技术及其在肿瘤研究中的应用
激光捕获显微切割技术及其在肿瘤研究中的应用激光捕获显微切割技术（Laser Capture Microdissection，LCM）是一种通过激光束精确切割组织样本的技术，可以在细胞水平上收集纯净的细胞或组织。
它主要应用于肿瘤研究中，可以帮助研究人员获取纯净的肿瘤细胞，分析和研究这些细胞的特征和功能。
激光捕获显微切割技术的原理是利用激光微束直接切割目标细胞，然后将切割下的细胞收集到特殊材料上，通过滤纸迅速吸附，最后可以用于进行进一步的分析，如基因组测序、蛋白质组学分析等。
这种技术可以避免传统切片技术中细胞混合的问题，保证提取到纯净的细胞或组织。
在肿瘤研究中，激光捕获显微切割技术具有以下几个重要的应用：1.分离肿瘤细胞：利用激光捕获显微切割技术可以选择性地分离肿瘤细胞，从而研究和分析这些细胞的生物学特征。
相比传统方法，LCM可以更准确地分离肿瘤细胞，避免混杂其他细胞的污染。
2.基因组学研究：通过激光捕获显微切割技术可以获取纯净的肿瘤细胞，进一步进行基因组测序分析。
这有助于了解肿瘤的发生机制和基因表达变化，寻找潜在的致癌基因或抑癌基因。
3.蛋白质组学研究：激光捕获显微切割技术可以用于收集肿瘤细胞，然后进行蛋白质分析，如蛋白质组学研究、质谱分析等。
这有助于寻找和鉴定肿瘤细胞中的蛋白质标志物，为肿瘤诊断和治疗提供新的靶点。
4.生物标记物研究：通过激光捕获显微切割技术可以选择性地获取肿瘤组织中的特定细胞或区域，研究和鉴定细胞内的生物标记物。
这有助于开发针对特定细胞亚群的个体化治疗策略。
尽管激光捕获显微切割技术在肿瘤研究中有许多优势，但它也存在一些限制。
首先，该技术需要专业的仪器设备和经验丰富的操作人员，成本较高。
其次，激光捕获显微切割技术在样本处理过程中可能导致细胞或组织的染色质、RNA和蛋白质的损失。
因此，在应用该技术时需要在实验设计和操作中严格控制条件。
总之，激光捕获显微切割技术是一种非常有潜力的技术，在肿瘤研究中具有重要应用价值。
染色体显微切割
显微切割技术的突破在于它与PCR的 结合，1989年Ludecke等切割了人类G显 带染色体，结合PCR技术进行体外扩增， 使其工作量大大减小。
对于同一条染色体，只要切割和收集5 ～ 10个拷贝，通过PCR扩增，即可满足实验要 求。从而极大地提高了实验技术的可行性和 准确性。
在1989年，Ludecke等建立了一个显著提高克 隆效率的方法。 该方法首先用Rsa I酶切显微切割的DNA，连接 到一个用Sma I酶切的pUC载体，然后用PCR扩增插 入位点两侧的载体序列。
一些肿瘤常见的染色体异常 病名 染色体异常 Ph,即t(9;22) 慢性粒细胞白血病 t(8;14),t(2;8),t(8;22) Burkitt淋巴瘤 +8;7q,5q或-5 急性非淋巴细胞白血病 t(8;21),t(15;17),t(9;22)；t(11;14),+12 t(?;11),t(1;9),t(7;12),t(9;14) 慢性淋巴细胞白血病 t(8;14),t(4;11),+21 急性淋巴细胞白血病 t(4;11),+12 14q+,+12 恶性淋巴瘤 del(3)(p14-23) 小细胞肺癌 t(6;14) 卵巢乳头状腺癌 del或t(1;?)(p 32-36;?) 神经母细胞瘤 13q 脑膜瘤 -22,22q Wilms瘤 11p 睾丸癌 1(12p) 畸胎瘤 1(12p)
2.染色体显微切割的应用
2.1 感兴趣区域DNA克隆的构建 2.2 FISH探针的制备 2.3 染色体重排的检测 2.4 区域特异性cDNA的选择
2.染色体显微切割的应用
2.1 感兴趣区域DNA克隆的构建
显微操作仪
嵌合体技术
• 嵌合体 (chimera)一词源于古希腊神话， 其意是指狮头、羊身、龙尾等部分拼凑起 来的怪兽。 • 嵌合在生物学上是指同一个体中，基因型 相异的细胞或组织混合存在的状态。
显微切割技术
能够确保后续试验成果旳可靠性！
例如
霍奇金淋巴瘤中瘤组织成份多样， 特征性旳瘤细胞（R—S细胞及其变异型） 占细胞成份旳2％左右，且呈散在性分布， 假如常规地用组织匀浆旳方式从组织中 提取蛋白质或核酸，则既包括了来自瘤 细胞旳成份，又包括了来自淋巴细胞、 浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、 组织细胞等多种非瘤细胞旳成份，这么 所提旳蛋白质或核酸来自何种细胞并不 清楚，而假如用显微切割技术则能够选 择我们需要旳细胞，以使研究对象旳背 景明确；
1. 2. 怎样对已切割旳细胞进行分析
2.
显微切割后取得旳材料能够用于提取
蛋白质、DNA和RNA等用于Western Blot，
Southern Blot，Northern Blot，PCR等蛋白
质和核酸旳有关分析。
4.
3. 活细胞显微切割后还能够继续培养
（五）显微切割旳影响原因 1. 一切与显微切割结合旳技术中旳影响原因均为显微切
Building 10, 9000 Rockville Pike, Bethesda, MD 20892, USA. Comment on: Abstract
显微切割
MMI cell-cut plus1.组织切片样本放在特殊载玻片的中间，注意应放在平面一边，不要放在凹面一边，然后将再有标本的一边反转放在玻璃的载玻片上固定好后放在载物台上。
2.活细胞的种植：将cell重在带薄膜的不锈钢内皿中，加入1mlmedium，再将内皿放在附有粘着力的外皿上，培养24-48小时，切割活细胞时，将外皿放在显微镜的载物台上，被切割下的活细胞粘贴在外皿上，取出内皿，外皿内加入medium继续培养。
取出的不锈钢内皿可弃掉，也可以放在另外一个新的外皿里，继续在同一样培养物上切割其他不同的细胞。
系统设置如下1．打开PC主机使计算机的启动过程完成达到windows界面。
2．打开显微镜白光电源3．用钥匙旋拧打开激光电子发射器，黄色LED灯明亮。
4．点击软件图标，等待软件完成启动和自检的过程。
5．按下控制皿上的激光切割键，此时绿色LED等明亮。
放置载玻片（可以同时放三个slide），安装收集管，调节显微镜焦距使画面清晰。
处理新的载玻片：1.点击File——New slide或点击slide list左边的，片子的编辑将打开，可通过按“+”加入一个新的片子。
所有文件都将被储存在关于这张载玻片名字下的文件夹内。
2.通过移动玻片膜到左上角，然后按limit1，而后再移动玻片膜到右下角，再按limit2，通过上述限定来确定载玻片膜的工作范围。
3.在4×物镜下，通过点击扫描键，软件会创造一个样本的纵览图片，在纵览图片上双击鼠标左键，将会导航到你所感兴趣的区域，也可以用光标键移动XY界面，或用鼠标拖拽闪亮的矩形。
4.点击对应键使caplift（收集管盖）下降或使用hotkeyF2降低caplift后，应该调节显微镜焦距使画面清晰达到所需。
5.用鼠标激活 too/bar(工具栏)上的任意一个所需键，如手控自由画工具，使用者能够在所要显微切割的目标周围画上切割线，按cut键来对所选定的目标进行切割，升高收集管，盖上收集切割下的标本。
蔡司显微切割无菌收集活细胞的方法
蔡司显微切割无菌收集活细胞的方法说实话蔡司显微切割无菌收集活细胞这事儿，我一开始也是瞎摸索。
我试过好多方法呢。
最开始的时候，我就像没头的苍蝇一样到处乱撞。
我就知道要保证无菌，那我想首先就得把环境都弄干净了。
我就把实验室打扫得一尘不染，感觉像是要迎接什么贵宾一样，所有的器材也都消毒好多遍，就觉得多消毒总没错啦。
在显微镜切割这个操作上，我可走了不少弯路。
我之前切割的时候总是掌握不好尺度，要么切多了，把不需要的也切下来了，要么切少了没把目标细胞完全切好。
后来我就想这个就像切菜一样，得先看准了下刀的地方，然后稳稳地切下去。
所以我就先仔细地在显微镜下观察，把活细胞的边界啥的都看清楚，就好比把菜的形状先看明白了才下刀。
然后说到无菌收集细胞，这个也是挺麻烦的。
我一开始用的收集工具总是会把外面的细菌带进去。
后来我就专门找那种经过严格无菌处理的收集器，就像一个专门的无菌小盒子一样。
把切割下来的活细胞慢慢引导进这个小盒子，过程中还不能碰到周围不干净的东西。
这个引导的过程就像是在一个窄窄的桥上走，得小心翼翼的。
我还犯过一个错误呢，就是在操作过程中没有很好地控制时间。
有一回做着做着突然意识到可能时间太长，细胞的活性会受到影响。
那之后我就每次都给自己定个闹钟，严格控制时间。
我觉得如果要做蔡司显微切割无菌收集活细胞，尽量精简步骤很重要，步骤越多就越容易出错。
而且自己的手法得练熟练，我那种看到细胞就有点慌的感觉也得克服。
我不确定我这个方法是不是最好的，但是目前按照这个方法我算是能比较顺利地完成这个蔡司显微切割无菌收集活细胞的工作了。
我也曾尝试过不同的温度环境。
我想细胞在合适的温度下活性会更好。
我试过冷一点的环境，结果细胞好像变得有点懒洋洋的，动得很慢。
后来我就努力把温度调到接近细胞正常生长的温度，就好像给它们创造了一个舒服的小家一样。
然后细胞在收集过程中就很活跃，这样收集后的细胞状态也比较好。
不过温度这个事儿我还在摸索，到底什么温度是最适合所有情况的我还不敢确定。
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第二代激光切割技术
• Laser Microbeam Microdissection LMM • Laser Pressure Catapulting LPC
- 德国Palm公司基于第一代的缺点，开创性地
采用紫外激光沿样品外缘切割的工作方式， 利用激光离焦面的冲击力，将分离后的样 品向上弹射收集
• 激光切割技术从切片中分选出泡状巨噬细胞
• 结合实时定量PCR检测技术分析CD68的表达并将其与整个切片样 品中CD68的表达量做对比 • 同时用巨噬细胞不表达的α-ACTIN 作为污染标记分子 。
案例2 －动脉样硬化组织中泡状巨噬细胞基因表达变化 结果，
• 所取的LMD样品中检测不到 α-actin的表达； • CD68的表达水平被LCM技 术富集了33.6倍，说明了激 光切割方法的优越性。
射分离技术（selective ultraviolet radiation fractionation，
SURF） – 先用墨水选择性在切片上的覆盖需要的细胞或组织，然后用高 能量的紫外激光束破坏周围无关组织中的DNA。用墨水覆盖区 的细胞的DNA得以保存，再用针采集
第一代商品化激光切割产品
• laser capture microdissection (LCM) – 1995年Liotta教授等进一步发展的非接触性激光显微切割技术 （non-contact laser microdissection of membrane-mounted
第二代激光切割技术示意图
• 开创性的一些意义
• 紫外激光的使用
• • • • - 更有效的分离能力； - 对RNA、蛋白质的保护； 首次提出样品的无接触收集 概念 对荧光观察方式的支持
• 外沿式的分离方法
第二代技术的限制
• 伴随蛋白质组学和高通量分析 技术的发展，LMD产品的自 动化程度有待提高 • • • • 所能适用样品的范围有待提 高 - 大面积样品的切割和收集； - 染色体和细胞器等精细切割 和收集； - 对活细胞的切割和收集
– 早期是从冰冻组织切片上在肉眼下用解剖刀刮去不需要的部分， 剩下感兴趣的组织（1970s）
– 在显微操作仪（micromanipulator）引导下使用带有粘附尖端
的解剖针或者吸管，使得精确性和实用性大为增强（199出现
• selective ultraviolet radiation fractionation，SURF – 1992年美国国立癌症研究院的Liotta等人研发的选择性紫外辐
激光显微切割－－起源
如何解决低含量样品的问题
案例2 －动脉样硬化组织中泡状巨噬细胞基因表达变化
泡状巨噬细胞在动脉粥样硬化过程中起着重要作用 研究其在不同损伤时期的基因表达变化已成为动脉粥样硬化
研究中的一个重要方向
案例2 －动脉样硬化组织中泡状巨噬细胞基因表达变化
传统的做法是拿一整块组织匀浆来抽提RNA或蛋白质做研究，这
的染色体）进行分子研究，达到高度的敏感性和高度的特异性的 统一。 尤其是在目标的细胞只占样本中细胞的少数时，以及目标的 细胞呈分散分布时，显微切割的重要性尤为明显
激光切割技术的演变
• 组织显微切割的概念：在显微镜下从异质性的组织样本中选取某 一特定的细胞、细胞器或细胞群
• 在技术上经历了以下几个阶段：
显微激光切割技术
激光显微切割系统
激光切割技术发展 历史与未来
激光显微切割－－起源
大多数生物组织是由相互作用的不同的 细胞群体组成的，这些细胞群体彼此组
成复杂的三维结构。如腺体、肾小球、
肝小叶等。其功能的发挥不仅取决于实 质细胞，同时间质（stroma)也扮演着 十分重要的作用.
激光显微切割－－起源
细胞培养－可以解决这个问题吗？
• 可提供大量纯化的细胞供研究，并可进行干扰 • 缺点：
– 由于微环境已经改变，培养细胞缺乏与间质的接触和相互作用， 培养组织和细胞的基因表达可能与组织中实际细胞的蛋白表达
有着很大的不同
– 许多永生化的细胞株来自进展期的肿瘤，其基因改变已是多个 基因的多种改变的叠加，不能反映早期肿瘤的特点
种方法会很不准确，因为一整块组织中包含很多种细胞，单在粥
样损伤组织中就有淋巴细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等。
缺点 : 一是可能受到其它细胞的干扰
二是待检测信号的弱化
案例2 －动脉样硬化组织中泡状巨噬细胞基因表达变化
实验过程 • 将损伤组织冰冻切片 • 巨噬细胞特异性的标记分子CD68单抗做免疫组化染色
第三代技术的发展
全自动化高速切割技术
- 全自动的显微镜平台
- 高频脉冲激光器 - 全视野样品自动识别、切割
第三代技术的发展
大面积样品切割的要求
- 提供可以切割低倍物镜选择 6.3x 5x 更低1.25x - 新的收集方式 过大面积的样品由于重量问题，会使以往方法
无法成功收集样品。
重力收集的方式发明
1、适合大小样品； 2、无任何接触； 3、速度快； 4、适合保存样品。
第三代技术的发展
染色体切割的要求 - 足够的放大倍数－－150x染色 体切割物镜
激光显微切割技术发展的趋势
- 亚细胞水平的切割、收集功能； - 与组织芯片和基因芯片、蛋白芯片技术的整合；
– 不是能有所有类型的细胞系，限制了研究的方向
新问题的出现
随着分子肿瘤研究的深入，需要分离的样本越来越小，从大块
的组织精确到单个的细胞，甚至细胞器或者染色体。
?
显微切割技术（microdissection technique）
可以很好地解决以上问题,显微切割技术能够对于组织学上确
定的细胞（甚至精确到一个特定的细胞，或特定的细胞器或特定
面临的问题 1、相同的遗传信息（DNA）与独特的mRNA与蛋白质表达（表现型）
之间的不同；
2、组织内多细胞成分构成的现实； 因此样本的同质性是科研中经常遇到的问题。
案例1
霍奇金病的肿瘤细胞——
Reed-Sternberg细胞（RS细胞），常单个分散在
大量的反应性细胞组成的
背景之中，给R-S细胞起
源的研究带来很大的困难;
native tissue）使得显微切割实现了高度精确、无污染、快速
和自动化 – 将热敏的乙酸乙烯薄膜覆盖在组织切片上，用激光束 (100mJ～200mJ)直接照射需要的细胞群，薄膜受热而与下面 的组织紧紧粘住，掀开薄膜就可将靶组织粘在薄膜上，可用于 PCR
第一代技术的限制
1，切割速度慢；
2，对样品制备要求高；