临床样本 DNA自动测序结果的判读

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【ＫｅｙＷｏｒｄｓ】ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ；Ｒｅａｄｉｎｇ；Ｃｌｉｎｉｃａｌｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｔｈｏｌｏｇｙ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍｂｅｃｏｍｉｎｇａｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｓｋｉｌｌｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ，ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔｓａｎｄｏｔｈｅｒｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ．Ｔｈｉｓ，ｓｉｎｇｌｅｐｅａｋｓｏｆｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅａｎｄｌｏｎｇｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓａｒｔｉｃｌｅｄｅｓｃｒｉｂｅｄｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｏｆｓｉｎｇｌｅｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｍｕｔａｔｉｏｎｐｅａｋｓｏｆｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｈｉｃｈｗｅｒｅｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｏｆｂａｓｅｓｄｅｌｅｔｉｏｎａｎｄｉｎｓｅｒｔｉｏｎ，ａｎｄａｌｓｏｇａｖｅａｎａｄｖｉｃｅｆｏｒｃｏｒｒｅｃｔｒｅｃｏｇｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍ．Ｗｅａｌｓｏｄｉｓｃｕｓｓｅｄｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｔｈｅｉｒａｐｐｅａｒａｎｃｅ，ａｎｄｔｈｅｎｏｔｅａｎｄｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｒｅｍｏｖｉｎｇｔｈｅｍ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｓｏｍｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｗｅｒｅａｐｐｅａｌｅｄｆｏｒｔｈｅｒｅｐｏｒｔｆｏｒｍｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｐｒａｃｔｉｃｅ．
２］际应用［。因此自动测序结果的电泳图正确判读也成为临
床分子病理学医师和各类研究人员的一项重要工作。其中应用最为广泛的测序方法之一就是美国ＡＢＩ公司基于四色荧光末端终止法所形成的电泳图。我们将几年来在这类测序结果电泳图判读中的一些经验总结讨论如下。
０个碱基，置于测序引物的时候尽量使突变热点区避开前５质量最稳定的第１００～２００个碱基的位置。１２钉子峰这种峰的出现一般认为是在毛细管中出现了小的气泡或杂质，其出现位置不定，为变形的峰（多为变窄变高）挤在一起，且４种荧光颜色都有（图２）。钉子峰的出现
注：ＡＰＯＥ基因测序中可见胚系细胞中杂合峰，Ｔ峰与Ｃ峰等高
图４杂合峰测序图
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临床肿瘤学杂志２０１１年８月第１６卷第８期ＣｈｉｎｅｓｅＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ａｕｇ．２０１１，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．８一条突变型基因，再加上来自肿瘤的间质细胞及炎细胞的野生型ＤＮＡ，突变型仍会少于野生型细胞。当然理论上也存在着这样一种情况，即肿瘤中存在两个亚克隆，一个亚克隆是待测基因的纯合突变，只占肿瘤的小部分，另一个亚克隆是待测基因的野生纯合子，占肿瘤的大部分。结果也应当为同样的杂峰测序图，但这种情况在现实中出现的几率极低，只能通过对肿瘤的分割进行检测来证明。
注： “ ｇ ” 标记处可见一杂合峰
图５灵敏度实验中混有２０％突变型ＤＮＡ的样本测序结果上述的情况也给临床上测序结果的判读带来了一个重要的课题— — —当杂峰达到多高时判读为阳性？即灵敏度的问题。测序结果能不能只用阳性和阴性来出具报告？我们认为每一个实验室都应该针对自已的样本进行灵敏度的评估，而不能仅仅依据仪器供应商所提供的１／４峰高判为阳性这一单一标准。结果判读要根据突变的热点区、噪声的高低以及污染的轻重来综合判断（图６）。实验室可以通过设立对照，在保证测序质量时（野生型、突变型、空白对照工作良好，基线噪声低平）结合实验室的灵敏度及可信度，对于低于１／４峰高的可疑杂峰慎重考虑，应进行重复测序或反向测序验证，必要时与临床医师联系，在报告中注明此种情况。例如测到一个ＫＲａｓ基因的杂合峰，突变型峰高只占野生型峰／４，则突变型ＤＮＡ占所有ＤＮＡ的２０％左右。由于肿高的１瘤细胞中的ＫＲａｓ基因一般只有等位基因中的一个发生突变，那么实际提供这些ＤＮＡ的肿瘤细胞就应占所有检测细胞的４０％左右。如果报告的测序结果为突变型，判定为不适
国家中医药管理局专项资助项目（２００８７０２２）基金项目：１２１００２９江苏省中医院病理科
临床肿瘤学杂志２０１１年８月第１６卷第８期ＣｈｉｎｅｓｅＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ａｕｇ．２０１１，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．８会对激光探测头产生不良影响，应尽力避免。处理的方法是保证试剂的纯净，灌胶时排尽上胶块中的气泡，避免微小的气泡进入毛细胞管内。
２１００４６南京南京中医药大学基础医学院张树鹏１，赖仁胜１，杜益群１，谢玲１，吴晓斌１
【摘要】自动测序技术向临床医学方向转化，使测序结果电泳图的正确判读成为临床分子病理学家、肿瘤学家及临
床研究者十分重要的技能之一。本文总结了自动测序结果图中单位点杂峰、杂合子、纯合子及长片段杂峰序列，以及缺失与插入所致框移等的特点和正确判读方法，并就其发生原理、注意事项及处理方法等作一探讨。另外，结合临床实践对ＤＮＡ测序的报告内容提出了相应的要求。
图３酒精峰测序图１４杂合峰排除以上几种异常的峰值之后，如果在一个特定的位点上出现了两种颜色的峰叠在一起即为杂合峰。ＮＡ自动测序的原理，由于标有荧光的ｄｄＮＴＰ的竞争，根据Ｄ使测序反应产物形成了一系列相差只有一个碱基的、末端有一定荧光标记的片段组。在毛细管电泳时，这些测序图的峰高代表荧光强度，一种荧光素的高度能在一定程度上代表某
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注：约出现于３４、６４位碱基序列处的杂峰为ＢｉｇＤｙｅ峰，由于荧光强度太高，使后面序列显示较低（分析软件自动调整）
图１ＢｉｇＤｙｅ峰测序图
注：较高的钉子峰，为四色荧光重叠在同一位置
图２钉子峰测序图１３酒精峰酒精峰是由于测序反应产物纯化时酒精没有挥发干净所致。这种峰为平缓的“ 透明的” 单线条峰，可以跨过几个正常测序峰而不影响其形状（图３）。处理的方法就是增加酒精的挥发时间或适当提高挥发温度。
另外在肿瘤的测序结果中情况就变得复杂得多。临床ＬＣＭ）等技术，取得的肿瘤组织除非采用激光捕获显微切割（一般都不可避免地混有间质细胞及炎细胞等胚系细胞。这样一个肿瘤样本可以看成是一个嵌合体，如果再考虑肿瘤的异质性，这个嵌合体就更为复杂，基本上可见到下列情况：最常见的是杂峰中突变型的峰低于野生型峰，只为其几分之一（图５）。这是因为即使所有的肿瘤细胞都是杂合子，都含有
４］一特定片段的量［。
因为人类细胞内等位基因的存在，每一个基因都存在着两套，如果该等位基因是杂合状态，反映在测序图上应该是杂合峰位置上两峰值高度一致，而且往往杂合峰的高度低于周边正常峰（图４）。在实际工作中表现为检测外周血胚系细胞突变以评估疾病风险时，常可见到这类杂合峰。
随着人类基因组计划的完成及对遗传物质认识的进一步深入，人们对遗传物质的研究逐渐向医学临床应用方向转化和延伸。继美国提出癌症基因组计划以来，各种基因生物
１］标志的研究与临床检测方兴未艾［。自１９７７年英国剑桥大
１杂峰与杂合子的判读
１１ＢｉｇＤｙｅ峰ＢｉｇＤｙｅ是测序反应过程中最重要的试剂。在测序反应产物的纯化过程中，如果不能有效去除，就会在测序图前１００余碱基内出现一个或几个多色荧光重叠在一起的宽峰（图１）。当纯化效果很差时，ＢｉｇＤｙｅ峰可高达数千碱基，会造成后面测序峰过低，从而影响判断。解决的办法ＤＴＡ＋醋酸是采用适合自已实验室的纯化方法，如优化的Ｅ
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临床肿瘤学杂志２０１１年８月第１６卷第８期ＣｈｉｎｅｓｅＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ａｕｇ．２０１１，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．８
·综述与讲座·
临床样本ＤＮＡ自动测序结果的判读
３］钠法，或采用相应公司的纯化试剂盒［。另外也可以在设计
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学的ＦｒｅｄＳａｎｇｅｒ及美国哈佛大学的ＡｌａｎＭａｘａｍ和Ｗａｌｔｅｒ两个小组同时发明了ＤＮＡ序列测定方法以来，ＤＮＡＧｉｂｅｒｔ的测定技术发展迅速，新一代的测序技术向自动化、高灵敏、大通量和低价格的方向发展，从而推动了临床基因检测的实
【关键词】ＤＮＡ测序；电泳图；判断；临床分子病理学
中图分类号：Ｒ７３０文献标识码：Ａ文章编号：１００９－０４６０（２０１１）０８－０７４６－０５
ＴｈｅｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｄｉｒｅｃｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｄｕｒｉｎｇｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｔｅｓｔＺＨＡＮＧＳｈｕｐｅｎｇ，ＬＡＩＲｅｎｓｈｅｎｇ，ＤＵＹｉｑｕｎ，ＸＩＥＬｉｎｇ，ＷＵＸｉａｏｂｉｎ．ＴｈｅＰｒｅｃｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅＣｏｌｌｅｇｅ，ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００４６，Ｃｈｉｎａ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＴｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｕｔｏｍａｔｉｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｏｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｕｓｅｍａｋｅｓｔｈｅｃｏｒｒｅｃｔｒｅａｄｉｎｇｏｆｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ