激光捕获纤维切割技术

第四章

激光捕获显微切割技术（Laser Capture Microdissection，LCM）

激光捕获显微切割技术(Laser Capture Microdissection，LCM)：是一种有效的细胞纯化技术，可在基本不损伤细胞内DNA、RNA 和蛋白质并保持组织细胞结构完整的条件下，从组织中分离出同质细胞群、单个细胞甚至亚细胞结构。

LCM技术的必要性：研究对象的异质性研究材料日趋微小基于流式细胞术的荧光激活细胞分选：LCM是目前从组织或细胞单层分离亚群细胞的有效方法，同时实现将组织中每种细胞群作为研究对象，其分子表达谱会非常接近体内状态

LCM技术能够使我们分离得到特异的目的细胞，而没有周围细胞的污染。LCM技术的特点：

细微：研究对象可以达到μm 级

原位：在组织细胞原位取材，定位清楚、准确

同质：保证获得同质研究对象

结合：分子生物学、免疫学及病理学研究

组织标本

同质细胞群、单个细胞、亚细胞成分

DNA RNA 蛋白质

LCM分离纯化

结合多种分子生物学技术：

DNA水平：结合测序、RFLP、SSCP、MSP等方法,

基因突变、染色体易位、甲基化改变等方面的研究。

RNA水平：结合Real-time PCR、cDNA芯片等技术，基因表达分析。

蛋白水平：结合western blot、2-D电泳、蛋白组学方法，肿瘤研究。

样品保存

固定方法切片厚度

切割效率影响LCM标本中DNA、RNA、蛋白质提取量的因素

普通染色：苏木素，甲基绿等

免疫染色：是在LCM之前进行免疫组化或免疫荧光染色，增强在复杂组织中对目的细胞的鉴别能力，可以在形态上相似的细胞中选出在免疫表型上明显不同的细胞，如B和T细胞，实现对功能分类后的细胞进行分选。

免疫染色LCM

主要用于研究DNA和RNA

染色过程应注意，使用高亲和力和高浓度的抗体，并尽量缩短免疫染色的时间，减少对DNA和RNA的破坏。

全自动显微镜、软件操作

金属卤素光源，激发光强度可调

切割、收集一体化

目标自动识别

石蜡、冰冻切片、活细胞（贴壁细胞）、涂片、甩片、树脂包埋组织

6.3x、20x、40x切割专用物镜主要应用：

从组织切片中获取同质目的细胞GFP标记的活细胞筛选

工作原理：激光束通过物镜，由电脑控制

沿着设定好的路径切割，即可获得需要的特定细胞或组织，依靠重力作用收集。

组织切片

PEN膜

载玻片PEN（polyethylene naphthalate）

收集管

载玻片

PEN膜

组织切片激光束

6.3x

20 x

40 x

物镜

GFP（green fluorescent protein）标记的活细胞筛选：

目的：筛选稳定转染目的基因的细胞群

稳定转染目的基因的细胞：研究某个外源基因

对细胞某些生物学行为（增殖、凋亡、迁移、侵袭）的影响。稳定表达外源基因的肿瘤细胞接种到动物体内可以直接观察体内成瘤和转移情况，同时施加一些处理因素，如放化疗、免疫生物治疗等对体内肿瘤的疗效。

将带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的质粒载体连接目的基因，转染进入细胞后，能够同时表达出GFP和目的基因，GFP的表达和定位代表目的基因。目前GFP已经成为跟踪活组织或细胞内基因表达及蛋白定位的常用标记物。

GFP

目的基因

表达融合蛋白

利用LCM系统对活细胞筛选，就是将这些表达GFP（代表目的基因）的单细胞克隆逐个挑选出来，分别培养扩增，最终建立稳定表达目的基因的细胞系。

2.倒置、切割

3.收集

4.转移

皿盖

1.接种细胞

PEN 膜

整个过程可以保证无菌操作

分选得到的细胞克隆准确可靠

一次即可分选出所有阳性克隆

全景扫描（Specimen overview）：利用电动

扫描台的精确步进功能，在高倍视野下（40×）

对一整块组织按顺序连续扫描，每个镜下视野

采集一张图像，形成一个m×n个图片拼接而成

的组织全景图片

可以实现组织切片的电子放大

寻找连续切片的镜下同一位置

计数相似面积内的不同组织切片中结节或阳性细胞的数量展望：

发展单细胞切割技术

更智能的自动识别功能

固定、染色和抽提方法的改进

用于芯片、蛋白质组学等高通量分析