显微切割技术章
生物显微技术ppt课件
G. 氯化汞 性质：无色粉末，剧毒
优点：渗透力强，对蛋白质有强烈的沉淀 作用
缺点：材料收缩
*常与甲醛、冰醋酸、丙酸等配合使用。 用碘除汞
H. 碘 性质：棕红色晶体
优点：渗透力强，野外使用方便
缺点：易挥发，标本不能长期保存
*溶于碘化钾溶液配置固定液；使用时可与 福尔马林配合使用。是低等单细胞生物、 浮游生物的良好固定液
有必要，必须采用与固定剂中的酒精浓度相同或相近 的酒精。
2.凡是含有铬酸、重铬酸钾、锇酸的固定剂，必须用流 水冲洗，冲洗时间应等于或多于固定时间。
3.如固定液中含有氯化汞，应根据溶液的性质用水或酒 精冲洗，冲洗完毕必须在70%酒精中加碘液去汞 。
4.含有苦味酸的固定剂，宜选用70%的酒精进行洗涤。苦 味酸的黄色在70%酒精中能自行脱去,或加入碳酸钾饱 和水溶液除去。
I. 锇酸 性质：灰黄色结晶，强氧化剂，剧毒
优点：目前最好的固定剂之一，脂类物质 唯一的固定剂
缺点：渗透力弱，组织固定不均匀，价格 昂贵
*取材较小，固定后用过氧化氢漂洗
第二节 洗涤和脱水
一、洗涤的目的和原则
洗涤的目的：将组织间隙中的固定剂清洗干净以免妨碍 染色或使材料在后续处理中变质。
洗涤的原则: 1.固定剂为酒精，或酒精混合物，一般不要求冲洗，如
第二章 光学透镜 第二节 凸透镜成像
➢ 显微镜的物镜、目镜和聚光镜都是由多个单透 镜或复透镜组成的透镜组，但其实质上只相当 于一个凸透镜。凹透镜所成的像总是缩小的虚 像，在显微镜上不能单独使用。
第七节 脱蜡与染色
四、染色过程中使用的其他辅助试剂
a. 媒染剂
有的染料不能直接使细胞或组织着色。媒染 剂通常能在水中电离金属离子（金属盐类或 金属氧化物）而与染料结合成有色复盐（不 溶于水或酒精）
第8章_第1节_基因诊断(3_LMJ)
4.DNA 芯片(DNA chip)技术
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1.斑点印迹(dot blotting)杂交
方法： 将核酸(DNA或RNA)样品点在NC膜上，变性 后与标记探针结合，显影或显色，密度测
(6)等位基因特异性PCR(AS-PCR)
针对等位基因的序列差异区域设计引物，使 引物的 3’端与等位基因序列的差异碱基对应， 仅能与突变型或野生型互补。
以DNA分子为模板，加入与拟扩增DNA片段两 端分别互补的一对寡核苷酸链作为引物，在 DNA 聚合酶的催化下，按照半保留复制的形式分别合 成两股新的DNA互补链，可使两引物间的DNA片段 拷贝数增加一倍。
多次重复这一过程，可使这段 DNA拷贝数随 复制次数以指数形式扩增。
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2. 基因诊断中常用的PCR及其衍生技术
（4）早期诊断：易在疾病尚无临床表现时作出诊断； （5）应用广泛：可检测自体基因和外源基因。
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二、基因诊断的主要技术方法
(一)核酸分子杂交（NA hybridiza单链构象多态性分析（SSCP）
(四)DNA分子多态性（DNA polymorphism）分析 (五)限制性片段长度多态性（RFLP）分析 (六)显微切割（microdissection）技术 (七)DNA序列测定（DNA sequencing）
DNA微阵列 (DNA microarray)——通过计 算机控制点样和图像扫描的高密度集成探 针的杂交技术。
应用： 单核苷酸多态性(SNP)、基因表达谱和遗传 性疾病的分析；病原微生物的大规模检测。
生物显微镜技术6-显微操作技
Leica转基因操作系统 LdcaASTP实现了把光学显微镜和显微操 作器的电控元件组合在同一控制部件内的第一台“转基因操作系 统”。用同一个控制器可以同步调控显微镜和显微操作器。
显微操作(NARISHIGE)系统 Nikon与NARISHIGE合作的结晶。 *采用油压传动的远程驱动*针对不同用途，可灵活选择不同 的配置方案
克隆羊“多莉”
克隆羊之父维尔莫特
克隆羊“多莉” 和它生下的小羊
细胞核移植技术流程
①供体体细胞经细胞培养后，提取细胞核；
②提取卵巢卵母细胞，在其减数分裂第二次 分裂中期除去细胞核，制成无核细胞质；
③将供体核与无核卵母细胞质融合，并培养 成早期胚胎；
④将早期胚胎移植到代孕母体子宫内，发育 成新个体。
显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、 嵌合体技术、胚胎移植、显微切割、细胞膜 打孔、外源基因显微注射导入等，是现代生 物学重要的实验技能之一。
第一节 显微操作仪
显微操作仪目前使用较为广泛的有两类： 一类为球面、齿轮机械传动操作式，如德
国Leica公司生产的MicromanipulatorM； 一类为液压传动操作式，如日本Narishige
细胞核移植技术，主要是用来研究胚胎发育过程中， 细胞核和细胞质的功能，以及二者间的相互关系； 探讨有关遗传，发育和细胞分化等方面的一些基本 理论问题。
细胞核移植技术已有几十年的历史。
迄今为止，已有下面9种供核类型的体细胞核移植 后代产生：胎儿成纤维细胞 、成体乳腺细胞 、卵 丘/颗粒细胞 、输卵管/子宫上皮细胞 、肌肉组织 的细胞 、成体耳部成纤维细胞、睾丸支持细胞 、 小鼠尾尖细胞 、初乳的乳腺上皮细胞
显微切割
第二代激光切割技术
• Laser Microbeam Microdissection LMM • Laser Pressure Catapulting LPC
- 德国Palm公司基于第一代的缺点，开创性地
采用紫外激光沿样品外缘切割的工作方式， 利用激光离焦面的冲击力，将分离后的样 品向上弹射收集
• 激光切割技术从切片中分选出泡状巨噬细胞
• 结合实时定量PCR检测技术分析CD68的表达并将其与整个切片样 品中CD68的表达量做对比 • 同时用巨噬细胞不表达的α-ACTIN 作为污染标记分子 。
案例2 －动脉样硬化组织中泡状巨噬细胞基因表达变化 结果，
• 所取的LMD样品中检测不到 α-actin的表达； • CD68的表达水平被LCM技 术富集了33.6倍，说明了激 光切割方法的优越性。
射分离技术（selective ultraviolet radiation fractionation，
SURF） – 先用墨水选择性在切片上的覆盖需要的细胞或组织，然后用高 能量的紫外激光束破坏周围无关组织中的DNA。用墨水覆盖区 的细胞的DNA得以保存，再用针采集
第一代商品化激光切割产品
• laser capture microdissection (LCM) – 1995年Liotta教授等进一步发展的非接触性激光显微切割技术 （non-contact laser microdissection of membrane-mounted
第二代激光切割技术示意图
• 开创性的一些意义
• 紫外激光的使用
• • • • - 更有效的分离能力； - 对RNA、蛋白质的保护； 首次提出样品的无接触收集 概念 对荧光观察方式的支持
激光辅助显微切割技术分离植物细胞研究进展
激光辅助显微切割技术分离植物细胞研究进展摘要LAM是一种强大的工具，可用于从获取的生物标本中分离特定的组织、细胞型甚至器官，这有益于RNA、DNA、蛋白质的提取。
分析该技术的原理及在植物研究中的重要性和优越性，介绍了LAM的工作原理及发展概况，并对其发展前景进行了展望。
关键词LAM；激光辅助显微切割；分离植物细胞植物体是由彼此相互联系的多种类型细胞所构成，正是由于这种结构上的复杂性，目前多数的研究都是通过分析混合组织样品来获得数据。
虽然这些研究提供了一些有用的信息，但是有时对某些结果却不能做出很好的解释，尤其是某一种类型细胞占组织的主要部分，而研究对象只是暂时存在其中或细胞数量相对较少的时候，具有很大的局限性。
因此，为了获得特定类型细胞的准确信息，分离出同质的目标细胞就显得非常重要。
1激光辅助显微切割（LAM）的优越性已报道过的从植物中分离同质细胞样品的方法至少有3种。
一种是从其中分离原生质体，这种方法能够获得很多同一种类型的细胞，但可能导致基因或蛋白表达发生未知的变化。
另一种是用毛细管从植物活体中获得植物细胞组，所获得的细胞样品虽然能进行部分代谢、基因表达和蛋白表达的分析，但数量上的限制使得应用这种方法很难采集到足够数量的单纯种类细胞样品来进行全局分析（尤其对RNA和蛋白质）。
此外，为了保持细胞特定的生理状态，样品可以在固定、包埋、切片后，从冰冻或者石蜡包埋的组织中分离，分离技术包括直接手工分离和激光显微切割分离。
激光捕获显微切割技术与以上其他方法相比，能够精确、快捷地获得大量的特定种类细胞样品，显现出极大的优越性。
LAM是一种强大的工具，可用于从获取的生物标本中分离特定的组织、细胞型甚至器官，这有益于RNA、DNA、蛋白质的提取。
LAM在生物研究的许多领域已经是一个常规技术，现在也已经成功用于植物组织的研究。
2LAM的基础原理及发展自1996年激光捕获显微切割技术首次采用以来，已经有多种激光捕获显微切割系统得到开发，文献报道中经常使用的是Arcturus Engineering公司的PixCell II系统和P.A.L.M.Microlaser Technologies公司的PALM Microbeam系统。
显微手术器械及基本技能
1．透明质酸 天然的结缔组织化合物， 不发生新陈代谢，也不降解， 线型多糖类 Healon是高分子透明质酸钠的百分之一的溶液。 公鸡鸡冠 主要特性： 1、高分子化合物；2、无抗原性；3、基本无 致炎性，不引起异物样反应；4、无致热原性； 5、高粘性；6、高弹性；7、无色透明；8、易 通过细针头成滴挤出
1.夹持面可变化的无齿银
2.夹持面固定的无齿镊
3.镊尖有凹糟的无齿镊
4.夹持面呈环形的无齿镊
镊子的选择
有齿镊主要利用其末端的小齿来抓取较 坚硬的组织 无齿镊主要用于夹持脆弱娇嫩的组织 手术者的习惯
剪刀
图3-14 Storz直剪
图3-15 Castroviejo 角膜成形－切除剪
达到组织愈合，其周围组织的损伤与变形也是极轻微
缝针
1．显微眼科手术缝针的基本结构 包括针弦长、针长、针半径、针身与针 粗的直径，共六个部分（图4-1）。其中 弦长可决定缝合的跨度。
缝针的分类
按照针尖与针身部横剖面形状的不同， 有四种类型（图4-2），即针身圆型圆尖 型、针身圆型三角尖型、针身反三角型 反三角尖型，针身铲型铲形尖型
刀柄及刀片
图3-30 普通刀柄
图3-31弹簧式刀柄
图3-32 晶状体手术常用手术刀
图3-33钻石手术刀
虹膜复位器
冲洗针头
第三节 显微手术器械的保养、维修和消 毒
三要：①保持显微器械的整洁,有条不紊 地排列在手术器械台上。②每次使用后, 须立即尽快地冲洗干净。③要细心地将 器械放回原装的器械盒内。 三不要:①不要让血痂或组织干固在器械 上。②不要用盐水冲洗器械(可用蒸馏水)。 ③不要用羊毛、棉花或纱布等有纤维物 擦器械。源自VISCOAT
第2章 生物样品制备技术
5、用以收集细胞，细胞器，生物大分子等
6、分离条件温和 ，但是温度需要控制
.
（二）等电点沉淀法
等电点沉淀法利用蛋白质是具不同等电点的两性电解质
，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离 的方法 。 由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的 蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，因此单独使用此
价格昂贵 为小分子多肽，在双向电 泳结果中出现 抑肽素pepstatin在pH9时 不能发挥其抑制作用
1 mM EDTA ， 1 mM EGTA
抑制金属蛋白酶
除去影响双向电泳的污染物 :
污染物
样品制备过程中带来的盐、残留缓冲液和 其它带电小分子
除杂技术
1、 透 析 2、 旋 转 透 析 3 、凝胶过滤 4 、沉淀 / 重悬法 1、DNase-l RNase-A 2、 超 速 离 心 3、 超 声 TCAI 丙酮沉淀法 离心
蛋白质样品处理中经常使用的添加剂:
1、变性剂 (尿素，打开氢键、增溶)
2、去垢剂 (CHAPS ，SDS等，消除疏水基团之间的相互
作用，增强蛋白质在其pI值处的溶解性)
3、两性电解质 (减少蛋白聚合，维持其溶解性)
4、还原剂 (DDT ，二硫苏糖醇，用于打开二硫键) 5、炕基化-SH (保护其不被再氧化)
由于样品可含有数千种乃至上万种生物分子同处于一个 体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的一劳永
逸的分离程序，但很多基本手段是相同的。为了避免盲目性
，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验 。
常用的分离纯化方法和技术有: 离心法、沉淀法(包括:
盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等)、透析法、色谱法、 等电聚焦制备电泳法等。
第12章免疫组织化学技术
抗原的保存与修复
酶消化法
盐酸水解法 高压锅法
常用的抗原 暴露、修复
方法
微波法 煮沸法
抗体的处理与保存
抗体的选择： 应注意选择具有高度特异和稳定的抗体，根据需要决定采用 单克隆或多克隆抗体。 抗体的稀释： 抗原抗体反应要求有合适的比例，过量或不足均不能达到预 期结果。 抗体的保存 ： 在保存抗体时，要特别注意保持抗体的生物活性，防止抗体 蛋白质变性。
酶标记抗体免疫组织化学染色
直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内 相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最 后用酶底物显色。
间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异 性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再 用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合 ，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色 。
临床免疫学与免疫学检验
第十二章 免疫组织化学技术
免疫组织化学技术（immunohistochemistry technique）又 称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原 进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为：
第四节 免疫标记电镜技术
原理
利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等 ）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密 度产物者如HRP标记抗体，在电子显微镜下对抗原抗体反应 中的高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的 技术。
相较于其他免疫组织化学技术是在光镜下进行抗原定位 ，免疫标记电镜技术在电子显微镜下的定位更为精确，可定 位至细胞膜、细胞器，在探索病因、发病机制、组织发生等 方面有其独特的优点。
17 病理学常用技术的原理及应用
免疫组织化学(免疫组化)和免疫细胞化学是利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一种技术，由免疫学和传统的组织化学相结合而形成。免疫组化染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，同时具有将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上原位确定某些蛋白质或多肽类物质的存在的特点，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析技术或激光扫描共聚焦显微技术等，可对被检测物质进行定量分析。
电镜技术在生命科学领域可用于胚胎及组织发生学方面的观察和研究，如通过电镜可以了解肿瘤间质新生血管芽的发生和形态特点(图17—2、图17—3)；在临床上可用于多种疾病亚细胞结构病变的观察和诊断，特别是肾小球疾病及肌病的诊断；疑难肿瘤的组织来源和细胞属性判定。如一些去分化、低分化或多向分化肿瘤的诊断和鉴别诊断。随着电镜技术的，不断发展以及与其他方法的综合使用，还出现了免疫电镜技术、电镜细胞化学技术、电镜图像分析技术及全息显微技术等。但电镜技术也有其局限性，如设备昂贵、样本制作较复杂；样本取材少。观察范围有限，有时还可能会遗漏信息：当用于辅助肿瘤的病理诊断时，只能判定肿瘤的组织或细胞的来源，不能确定肿瘤的良恶性。
(三)细胞病理学观察
通过采集病变处的细胞，涂片染色后进行观察、诊断。细胞的来源可以是运用各种采集器在口腔、食管、鼻咽部、女性生殖道等病变部位直接采集的脱落细胞，也可以是自然分泌物(如痰、乳腺溢液、前列腺液)、体液(胸腹腔积液、心包积液和脑积液)及排泄物(如尿)中的细胞，以及通过内镜采集的细胞或用细针直接穿刺病变部位(如乳腺、甲状腺、前列腺、淋巴结、胰腺、肝、肾等)，即细针穿刺(fine neecUe aspiI-ation，FNlA)所吸取的细胞。细胞学检查除了用于病人外，还用于肿瘤的普查。该方法设备简单，操作简便，病人痛苦少易于接受，但最后确定是否为恶性病变尚需进一步经活检证实。此外，细胞学检查还可用于对激素水平的测定(如阴道脱落细胞涂片)及为细胞培养和DNA提取’等提供标本。
显微操作技术(全面)
2.胚胎预处理
为了减少切割损伤，胚胎在切割前一般 用链霉蛋白酶进行短时间处理，使透明带软化 并变薄或去除透明带。
3.胚胎分割
在进行胚胎切割时，先将发育良好的胚 胎移入含有操作液滴的培养皿中，操作液常用 杜氏磷酸缓冲液，然后在显微镜下用切割针或 切割刀把胚胎一分为二。
不同阶段的胚胎，切割方法略有差异： （１）桑椹胚之前的胚胎这一阶段胚胎因为卵裂球 较大，直接切割对卵裂球的损伤较大。常用的方 法是用微针切开透明带，用微管吸取单个或部分 卵裂球，放入另一空透明带中，空透明带通常来 自未受精卵或退化的胚胎。 （２）桑椹胚和囊胚的分割对于这一阶段的胚胎， 通常采用直接切割法。操作时，用微针或微刀由 胚胎正上方缓慢下降，轻压透明带以固定胚胎， 然后继续下切，直至胚胎一分为二，再把裸露半 胚移入预先准备好的空透明带中，或直接移植给 受体。
非洲爪蟾制作
哺乳动物核移植
• ，哺乳类的移核实验必须在显微操作仪下才能进行。
• 最早用来做移核试验的哺乳动物是小鼠。 1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室用“ 亚无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。 1981年1月，美国《科学》杂志封面刊登3只小 鼠的照片，他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的 受精卵中，经培养移核卵发育至囊胚期，再将胚胎植 入同步孕鼠的子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发 育成了可育的个体。
近些年来，胚胎移植技术已在动物引种和改 良方面广泛应用，已成为体外受精、嵌合体、转 基因和克隆动物实现的应用技术，试管牛、转基 因猪和克隆羊均是通过胚胎移植途径生出的。
(二)胚胎移植的基本原则
1.胚胎移植前后所处环境的同一性 （１）供体和受体在分类学上的相同属性
（２）动物生理上的一致性
（３）动物解剖部位的一致性 2.胚胎发育的期限 3.胚胎的质量
显微切割技术
显微切割技术中国医科大学科学实验中心显微切割技术( 显微切割技术(Microdissection) Microdissection)：是在显微 状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲 选取的材料（组织,细胞群，细胞，细胞内组 分或染色体区带等）进行切割分离并收集用 于后续研究的技术。
显微切割技术实际上属 于在微观领域对研究材料的分离收集技术， 因此应用此技术往往是许多要深入的研究工 作中起始的重要一步。
是一种有效的细胞纯化技术， 是一种有效的细胞纯化技术 ， 可在基本不损伤细 胞内DNA 胞内DNA、 DNA 、RNA和蛋白质并保持组织细胞结构完整的条件 RNA 和蛋白质并保持组织细胞结构完整的条件 下，从组织中分离出同质细胞群 从组织中分离出同质细胞群、 同质细胞群、单个细胞甚至亚细胞 结构。
结构。
技术的必要性： 技术的必要性： 研究对象的异质性 研究对象的异质性 研究材料日趋微小 研究材料日趋微小基于流式细胞术 流式细胞术的荧光激活细胞分选： 流式细胞术 显微切割是目前从组织或细胞单层分离亚群细 显微切割 胞的有效方法，同时实现将组织中每种细胞群显微切割技术能够使作为研究对象，其分子表达谱会非常接近体内 状态 离心技术我们分离得到特异的 目的细胞，而没有周 围细胞的污染。
显微切割的特点2“原位”，利用显微切割技术是在组织细胞或染色体的原位取材，1 “细微”，由于是在显微状态并采用特殊的分 离收集手段，显微切割的对象可以达到微米 级，显微切割的精度可以达到毫微米级，因此 利用显微切割技术可以分离收集到象核仁和包 涵体及染色体特异区带这样细微的对象 。
因此所取材料的定位清楚，所研究对象的历史背景明确。
例如何杰 金氏淋巴瘤中瘤组织成分多样,特征性的瘤细胞(R-S细胞及其变异 型)占细胞成分的2%左右,且呈散在性分布,如果常规地用组织匀浆 的方式从组织中提取蛋白质或核酸，则既包含了来自瘤细胞的成 分，又包含了来自淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细 胞、组织细胞等多种非瘤细胞的成分,这样所提的蛋白质或核酸来 自何种细胞并不清楚，而如果用显微切割技术则可以选择我们需要 的细胞，以使研究对象的历史背景明确 。
显微切割技术
能够确保后续试验成果旳可靠性！
例如
霍奇金淋巴瘤中瘤组织成份多样， 特征性旳瘤细胞（R—S细胞及其变异型） 占细胞成份旳2％左右，且呈散在性分布， 假如常规地用组织匀浆旳方式从组织中 提取蛋白质或核酸，则既包括了来自瘤 细胞旳成份，又包括了来自淋巴细胞、 浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、 组织细胞等多种非瘤细胞旳成份，这么 所提旳蛋白质或核酸来自何种细胞并不 清楚，而假如用显微切割技术则能够选 择我们需要旳细胞，以使研究对象旳背 景明确；
1. 2. 怎样对已切割旳细胞进行分析
2.
显微切割后取得旳材料能够用于提取
蛋白质、DNA和RNA等用于Western Blot，
Southern Blot，Northern Blot，PCR等蛋白
质和核酸旳有关分析。
4.
3. 活细胞显微切割后还能够继续培养
（五）显微切割旳影响原因 1. 一切与显微切割结合旳技术中旳影响原因均为显微切
Building 10, 9000 Rockville Pike, Bethesda, MD 20892, USA. Comment on: Abstract
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第七章显微切割技术人体组织是由相互作用的不同的细胞群体组成的，这些细胞群体彼此组成复杂的三维结构，每种细胞均有自己的独特的mRNA与蛋白质表达（表现型）。
因此在复杂的组织中取得同质性的样本是相当困难的。
尤其在肿瘤的病理学研究中，样本的同质性是经常遇到的问题。
例如，霍奇金病的肿瘤细胞——Reed-Sternberg细胞和Hodgkin细胞（R-S/H细胞），通常单个分散在大量的反应性细胞（如淋巴细胞、组织细胞、嗜酸性粒细胞和浆细胞）组成的背景之中，给R-S/H细胞起源的研究带来很大的困难。
随着分子病理学研究的深入，需要分离的样本越来越小，从大块的组织精确到单个的细胞，甚至细胞器或者染色体。
常规的研究方法对此无能为力，而显微切割技术的出现解决了上述难题。
在显微切割技术（microdissection technique）发展之前，进行原位的细胞表型的研究方法是免疫组化和原位杂交。
但是免疫组化和原位杂交方法一般只能局限于一种或是几种基因表达的分析，而且难以进行DNA、mRNA和蛋白质的定量分析（如突变、缺失）。
显微切割技术能够对于组织病理学上确定的细胞群（甚至精确到一个特定的细胞，或特定的细胞器或特定的染色体）进行分子病理学研究，达到高度敏感性和高度特异性的统一。
尤其是在需研究的细胞只占样本中细胞的少数时，以及需研究的细胞呈散在分布时，显微切割的重要性尤为明显。
加之现在的免疫组织化学和原位杂交等技术可以在切片上特异性定位所需的细胞，因此显微切割技术在最近几年中得到了迅速地发展。
由于和高通量（high-throughput）基因分析（基因芯片）以及蛋白分析技术结合，显微切割技术显示出良好的发展前景（图7-1）。
图7-1一、显微切割技术发展的回顾组织显微切割的概念尤为简单，即直接在光学显微镜下从异质性的组织样本中选取某一特定的细胞群。
实际上，要达到这一目的在技术上经历了以下几个阶段：早期是从冰冻组织切片上在肉眼下用解剖刀刮去不需要的部分，剩下感兴趣的组织。
如1965年，Baxter对肾小管进行的显微切割的研究[1]。
后来发展成在显微操作仪（micromanipulator）引导下使用带有粘附尖端的解剖针或者吸管，进行手动切割和提取（图7-2），使得精确性和实用性大为增强。
如上个世纪90年代初德国Hansmann等使用这一方法对R-S/H细胞的研究[2]。
这些方法基本上为手动，精确性低，费时费力，可重复性差，而且不能完全避免污染。
1992年美国国立癌症研究院的Liotta等人研发的选择性紫外辐射分离技术（selective ultraviolet radiation fractionation，SURF）带来技术上的重大突破，该方法在切片上先用墨水选择性的覆盖需要的细胞或组织，然后用高能量的紫外激光束破坏周围无关组织中的DNA。
墨水覆盖区的细胞的DNA得以保存，再用解剖针采集[3]。
1995年Liotta教授等进一步发展的膜覆盖组织的非接触性激光显微切割技术（non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue）使得显微切割实现了高度精确、无污染、快速和自动化。
将热敏的乙酸乙烯薄膜覆盖在组织切片上，用激光束（100mJ～200mJ）直接照射需要的细胞群，薄膜受热而与下面的组织紧紧粘住，掀开薄膜就可将靶组织粘在薄膜上（图7-3），可用于PCR[4]。
另一种激光捕获显微切割术（laser capture microdissection，LCM）的原理是将薄膜预先覆盖在切片上，然后将组织切片或其他材料裱在薄膜之上，在显微镜下由紫外激光进行切割。
计算机控制的激光可以按照操作者的要求沿监视器上选定的细胞的边缘切割，切割下的细胞或组织直接落入下面的Eppendorf管内（彩图7-1）。
既避免了污染，又不会损害DNA、RNA或蛋白质。
Leica公司和Olympus 公司等已研发出计算机控制的激光捕获显微切割装置供应市场。
实现了快速、简单、精确的显微切割和无污染的提取靶细胞。
在国内目前上海肿瘤医院、浙江大学附属第二医院等单位均购置了此类设备。
图7-2图7-3二、显微切割的材料用于显微切割的材料十分广泛，可以是冰冻组织切片、石蜡切片、细胞涂片、细胞铺片、细胞爬片、分裂中期的染色体铺片等。
如用于DNA的提取，福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片可以满足大部分要求，但提取单个细胞的DNA进行PCR还需要冰冻切片。
如用于RNA的提取，则需要冰冻切片或者细胞涂片。
如用于蛋白质的分析，仍以冰冻切片为好。
三、显微切割的标记方法显微切割的切片或者涂片可以仅作常规的甲苯胺蓝或者甲基绿染色后，按照细胞形态学进行切割和提取。
对于特定的切割对象，可用免疫组织化学、原位杂交（包括FISH）、原位末端标记、原位PCR方法等先行定位后再进行切割。
这样切割的靶细胞或者靶组织可以保证高度的精确性和同质性。
例如在对于人R-S/H细胞的研究中，先使用CD30单克隆抗体标记R-S/H细胞，再作显微切割[2,5]。
以保证切割的精确性。
四、目前使用的主要的显微切割技术方法（一）液压控制手动显微切割（显微操作仪）采用液压式显微操作仪（如日本的Narishige，德国的Eppendorf）进行。
可通过液压系统进行三维控制，切割精度高。
在一定放大倍率的显微镜下,用显微操纵器（micromanipulator）探头挟持的微吸管（micropipette）或者30号针头，仔细分离出靶细胞并将其转移至Eppendorf管中,用蛋白酶K消化后作PCR扩增。
整个操作全过程能在显微镜直视下或显微电视监视下进行（图7-2）。
这种方法所需的设备较为简单，缺点为效率低，要收集较多的样本费时费力，且可能产生污染。
初学者可能要耗费相当多的时间，经过10至20例的实践之后才能在操作微吸管或者针头的速度和精度上达到协调[5]。
（二）激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）技术由美国NIH的Liotta等人研发的非接触性激光显微切割技术，使用红外激光束切割在薄膜下的组织或者细胞，产生的热量少，不会损伤组织的DNA、RNA 和蛋白质。
可以进行单个细胞、甚至染色体的切割。
系统由倒置显微镜、低能量红外激光器、摄像系统、样品收集系统和计算机等组成。
将热敏的乙酸乙烯薄膜覆盖在裱有组织切片的载玻片上，观察者在显微镜下发现需要的细胞后，用脉冲为5msec的激光束（100mJ～200mJ）照射需要的细胞群，温度可达到90°C。
薄膜受热而与下面的组织紧紧粘住，掀开薄膜就可将靶组织粘在薄膜上（图7-3）。
由于激光束产生的热量非常短暂，可迅速消散，所以不会破坏组织中的DNA、RNA和蛋白质。
激光束的直径可根据所需组织的大小从7.5µm到30µm可调[4,6]。
此种装置已经由Olympus公司生产，命名为LM200-Laser capture microdissection system。
由Leica公司研发的AS LMD显微切割系统是第三代激光显微切割系统。
它由自动显微镜、紫外激光器、摄像系统、样本收集系统和计算机组成。
经过硅化的玻璃载片上蒙上一层PEN薄膜，再裱上组织切片，经过染色（常规甲苯胺蓝染色或免疫组化染色）后，即可用于显微切割。
与NIH的方法不同的是，紫外激光（波长377nm）切割完所需组织或细胞的边界，带膜的组织即可由于重力的原因下落至玻片下的Eppendorf管中，实现真正的无污染切割和提取。
长焦距显微镜可以直接观察到切割下的组织在Eppendorf管中的存在（彩图7-1）。
整个操作可以在监视器上用光标进行，实现自动聚焦、自动切割和自动收集。
其切割精度可以达到单个细胞或者单个染色体。
由于其可以在荧光照射下工作，因此可用于FISH标本的显微切割。
五、显微切割技术的应用显微切割技术的应用日益广泛，主要是用于组织切片上特定组织和细胞的DNA、RNA和蛋白质的精确的、无污染的切割和分离。
切割的组织或细胞可用于DNA、RNA和蛋白质三个层面的研究。
（一）DNA水平DNA的克隆、定量PCR（real time PCR）、DNA文库的构建、Southern印迹杂交，DNA测序、X染色体灭活（X-chromosome inactivation）、比较基因组杂交（comparative genomic hybridization）、双脱氧指纹（dideoxy fingerprinting）和杂合缺失（loss of heterozygosity）等。
（二）RNA水平总RNA和polyA+RNA的分离、RT-PCR、cDNA文库的构建、Northern杂交和靶向分化显示（targeted differential display）等。
（三）蛋白质水平2D-SDS-PAGE、LC MS、免疫印迹、免疫组织化学、表面增强（surface enhanced）、激光解吸附（laser desorption）和离子化（ionization）等。
（四）显微切割技术应用的举例对于霍奇金病的R-S/H细胞的研究。
霍奇金病和一般的肿瘤在组织病理学上的不同在于肿瘤性的R-S/H细胞一般只占肿瘤组织的极少部分（<1%）并分布散在，其余是大量背景细胞，如小淋巴细胞、浆细胞、组织细胞和粒细胞等，这造成对于R-S/H细胞起源研究的困难和结果的混乱。
1993年德国病理学家Hansmann等人使用显微操作仪，从冰冻切片分离出霍奇金病的单个R-S/H细胞进行PCR，检测免疫球蛋白基因的重排，证实了R-S/H细胞实际上是分化上出现异常的B淋巴细胞[2,7]。
国内华西医大李甘地等人的研究进一步发现在R-S/H 细胞中存在免疫球蛋白lambda轻链的重排[8]而不存在T细胞受体基因重排（图7-2）[9]。
国内第四军医大学黄高升等人同样使用类似方法发现R-S/H细胞中存在巨细胞病毒DNA[10]。
NIH的Liotta等人用激光捕获显微切割方法用于研究胃癌进程中各种基因变化启动和持续的时间，并建立了来自同一病人正常胃粘膜上皮、不典型性增生上皮、原位癌和浸润癌的cDNA文库。
通过分析这些cDNA文库可以发现与肿瘤进程相关的基因或基因表达的模式[6]。
NIH的Fend等人报告应用激光捕获显微切割和基因重排等技术，对于3例组合性低度恶性的B细胞淋巴瘤的研究显示3例分别为套细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的组合中，存在双克隆性的免疫球蛋白重链基因重排并用测序加以证实。
这一发现说明，组合性淋巴瘤是由不相干的两个克隆性增生形成的，而使用常规的全组织切片提取DNA的方法则不能发现存在双克隆性的重链基因重排[11]。