宏基因组测序-高科技与产业化-陈龙-20170719

宏基因组测序

一、概况

宏基因组学（Metagenomics，又称元基因组学）这一概念最早在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出，随后伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter将宏基因组定义为：应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株的科学。鉴于环境中99%的微生物不可培养，宏基因组无需进行微生物分离操作的技术特点打破了传统微生物学基于纯培养研究的限制，为充分认识全球和人体范围内微生物和开发利用未培养微生物，并从完整的群落水平上研究微生物的活动和发掘潜在功能提供了可能。传统的宏基因组学研究通过直接从环境样本中提取DNA，构建DNA克隆载体的宏基因组文库，并利用基于核酸序列差异分析、克隆子的特殊代谢活性、底物诱导基因的表达和（或）稳定同位素和荧光原位杂交等技术对宏基因组文库进行筛选和分析，从而有效地利用环境中丰富的微生物资源和挖掘新的特殊功能代谢物。

在宏基因组学研究的发展前沿中，核酸测序技术测序速度和通量的增长引人注目。在下一代测序技术（NGS，又称第二代高通量测序技术）出现之前，基于宏基因组测序的核酸序列差异分析通常使用Sanger测序（主要基于双脱氧核苷酸链终止反应）方法，对宏基因组克隆文库或功能扩增子进行测序，来研究环境中微生物群落多样性及功能特征。但Sanger测序方法通量较小、测序周期较长且价格昂贵。

随着新一代测序技术的迅猛发展以及广泛应用，宏基因组测序的方法也发生了翻天覆地的变化，目前科学家们可以对环境中的微生物全部基因组进行测序，在获得海量的数据后，全面地分析微生物群落结构以及基因功能组成，了解微生物如何耐受极端环境，发觉新的生物资源并探索微生物与环境间的相互作用。下一代测序方法使用了几种不同的高通量平台，最先使用的是基于焦磷酸聚合酶乳液的Roche GS20454测序仪（又称焦磷酸测序仪）。焦磷酸测序技术继承了Sanger 测序读长较长和准确率高的优点，并且显著提高了测序的通量。虽然焦磷酸测序仪（包括GS20和GS FLX系列及其试剂）使用超过了10年（2005~2016），但它仍然存在一些缺点：测序试剂成本高、均聚物错误率高（复杂重复序列的错读）以及基于磁珠DNA分子凝集的表面区域捕获限制了测序通量和获得reads的数目。第二个出现的下一代测序仪是2006年引入的Solexa（Illumina）Genome Analyzer（GA），这种测序技术将寡核苷酸阵列的flow cell、可逆的链聚合反应和桥式PCR反应集合于一体，并且一次运行能产生超过1.8TB的数据量。Illumina 目前拥有多种技术平台，包括GA、MiSeq、HiSeq和NextSeq，并且具有多种可选择读长（100~300bp PE reads）模式和通量以应对各种实际测序需求。比如，MiSeq平台基于overlap的最长read为500~550bp，但是相较于HiSeq平台每次运行能产生数十亿reads而言，MiSeq平台通量较低。合成长读长测序技术（TruSeq synthetic long reads或Moleculo）作为一种新兴的Illumina测序技术，除了能够获得较长的read长度（超过8kb），还能够有效促进高度复杂的土壤微生物组或其它生物样本的组装。下一代测序技术的进步使得宏基因组研究中组装contigs 的长度显著增加。

包括单分子DNA测序仪在内的新兴第三代测序技术在更快速、高信息量的宏基因组研究中展示出巨大潜力。PacBio单分子实时定量（SMRT）技术目前能够提供约10~25kb的读长，每个SMRT cell能够产生约300Mb数据量。除优秀的读长和通量外，PacBio平台还能够在DNA合成过程中不进行化学修饰检测非常规或修饰碱基，如DNA甲基化等。牛津纳米孔（Oxford Nanopore）测序平台是另外一类新兴且具有潜力一种单分子测序仪。不同于目前的单分子测序平台，Oxford平台不依赖于边合成边测序（SBS）方法，而是通过纳米孔直接对核酸进行测序。与PacBio平台相似，牛津纳米孔能够检测DNA修饰，拥有1~2kb平均读长，读长最长可达90kb。牛津纳米孔测序仪最主要的益处在于其使用无线技术能够在个人笔记本电脑上实时监控测序过程。过去的5年中，PacBio平台已经成为微生物单菌株从头（De novo）测序和宏基因组拼接的强有力技术。使用PacBio平台进行文库构建时需要微生物的DNA具备较高的分子量（大于40 kb），这是PacBio使用的一个限制。牛津纳米孔为潜在的长scaffolds（大于50kb）的测序和直接从环境样本中重构基因组提供了一条廉价的途径。这些新技术的主要挑战是如何获得几百kb甚至几Mb高质量和高分子量的DNA。就大规模的研究而言，Oxford和PacBio平台通量仍然较低，但鉴于两者在测序组装方面应用的优势，使得这两种单分子测序技术为未来微生物组群落研究中前途光明。

微生物组是指特定环境中的全部微生物及其遗传物质的集合，如土壤或肠道中栖息的全部微生物。这些栖息在特定环境中的微生物组起着维持生态系统多样性和平衡的重要功能，并与人类健康、气候变化和粮食安全等诸多方面密切相关。宏基因组测序技术为研究微生物组提供了极大的便利，短短十几年来，基于宏基因组测序的微生物组研究已经渗透到各个领域，从海洋到陆地，再到空气，从白蚁到小鼠，再到人体，从发酵工艺到生物能源，再到环境治理等。

表1截止到2016年国际上构建的大型基因集汇总

项目/疾病基因数研究对象年份测序平台

MetaHIT3,299,822欧洲人群2010Illumina GA

T2D4,267,985中国人群2012Illumina

HMP5,140,472美国人群2012Illumina GAIIx

LC5,382,817中国人群2014Illumina

IGC9,879,896中、美、欧人群2014Illumina

OM-RGC40,154,822海洋2015Illumina -2,572,074中、美、欧小鼠2015Illumina HiSeq2000

-7,685,872中、欧猪群2016Illumina GAIIx、HiSeq2000

宏基因组关联分析（MWAS）作为微生物组研究的一把利器，在微生物与疾病的关系研究中真发挥越来越重要的作用。Nature于今年7月6日紧随Science 4月29日的微生物特刊，推出业内顶级专家主笔的6篇有关“肠道菌群-宿主相互作用”的重量级综述和观点透视专辑，展示了肠道菌群在多个领域的临床应用发展中的重要进展。本期专辑的推出，为肠道菌群和肠道健康的研究和转化再一次摇旗呐喊。其中Jack A.Gilbert（美国环境、医院和家庭微生物组计划发起人）介绍了有关宏基因组关联分析在疾病领域的研究进展。2010-2014年间国内外应用宏基因组测序技术对不同疾病类型，包括炎症性肠病（IBD）、结直肠癌（CRC）、

II型糖尿病（T2D）、肝硬化（LC）等人类粪便样本进行测序，并基于MWAS 研究各类疾病与肠道微生物组间的关系，筛选生物标记（Bio-marker）（表1）。未来基于MWAS技术对微生物组在相关疾病中作用的研究会越来越深入，科学家们希望能够发展一个微生物全球定位系统来对疾病人群进行分层，指导精准医疗，从而维护人类健康。

涉及微生物组的研究工作也引起了国内外的广泛关注，各个国家及其科研工作者积极参与到多个微生物组研究计划之中。

表2截止到2016年国际上启动的大型人类微生物组研究项目汇总

项目周期参与国家

人类微生物组计划（HMP）第一阶段2007-2012美国

人类肠道宏基因组（MetaHIT）2008-2012中国、丹麦、法国、德国、意大利、荷兰、西班牙、英国

加拿大人微生物组项目（CMI）2008-2012加拿大老年人宏基因组（ELDERMET）计划2008-2013爱尔兰

六国补充人类微生物组研究计划2008-2012澳大利亚、中国、法国、日本、新加

坡、韩国

国际人类微生物组联盟（IHMC）2007至今澳大利亚、加拿大、中国、法国、冈比亚、德国、哈萨克斯坦、爱尔兰、日本、韩国、西班牙、美国

人类微生物组计划（HMP）第二阶段2013至今美国

我的新肠道（MNG）计划2013-201815个国家合作

营养药学生物中心（APC）微生物组联

盟

2013-2019爱尔兰MetaGenoPolis（MGP）计划2013-2017法国

环境，基因和慢性疾病（EGCD）计划2016至今加拿大、国际合作

自然资源与环境：部门挑战-基因组解决

方案（NRESCGS）计划

2016至今加拿大、国际合作

肠道微生物组学联合行动（JAIM）计划2016至今加拿大、国际合作人类微生物组的研究主要由美国和加拿大主导，中国也参与其中。截止到今年，国际上启动的大型人类微生物组研究项目有13项，其中有8项正在实施，另外5项已经完成。在这些大型项目中，美国、加拿大、爱尔兰和法国是主要的参与国家，也包括2项中国参与的项目，分别是人类肠道宏基因组（MetaHIT）和国际人类微生物组联盟（IHMC）。美国是绝对的引领者，其中美国独立开展2项微生物组计划，包括最早的一项—人类微生物组计划（HMP），并参与全部人体微生物组计划中的5项。加拿大后来居上，主导人类微生物组研究项目中的4项（表2）。

在人类微生物组项目中最早启动的人体微生物组计划（HMP）针对5个人体部位（胃肠道，口腔，鼻腔、女性生殖道和皮肤）的微生物组变化与疾病健

康的关系，并且人体微生物组计划被确立为美国国立卫生研究院医学研究路线图的重要组成部分，同时也为其他科学研究提供了信息和技术支称。

MetaHIT计划是由欧盟第七框架计划（FP7）资助的子项目之一，合作伙伴包括了来自中国在内的8个国家学术界和工业界的13个成员。该计划研究了人类肠道中的所有微生物群落，了解了人类肠道中细菌的物种分布，最终为后续研究肠道微生物与人类肥胖、肠炎等疾病的关系提供非常重要的理论依据。

表3截止到2016年国际上启动的大型环境微生物组研究项目汇总

环境微生物组的研究相比人体微生物组研究开展的更早，涉及的范围也更为广泛。客观上来说，微生物组研究的很多工具，方法，思路等多来自于环境微生态学领域。最初，我们只是把环境中的微生物作为生态学系统中的一部分来考虑，直到最近才将这种观念应用于人体微生物组的研究中。所以，人类微生物组研究还有很多地方需要借鉴环境微生物组的研究方法和成果。综合来看，美国在环境微生物组方面的大型研究项目占据绝对主导地位，在统计的9个环境微生物组研究中，有5个项目由美国独立实施，其余的国际项目美国多有参于（表3）。

地球微生物计划（EMP）通过对全球典型的环境样本（包括土壤、海洋、空气、淡水等生态系统）进行宏基因组测序，并全方位地分析微生物群落的多样性和功能，为后续环境微生物组研究提供了参考和依据。

2016年5月13日，白宫科技政策办公室（OSTP）在一些联邦机构（包括美国能源部、航空航天局、国立卫生研究院、美国国家科学基金会、农业部）、产业和基因会的资助下宣布了一个全国性的微生物组计划（NMI），这是奥巴马政府继脑计划、精准医学、抗癌“登月”之后推出的又一个重大国家科研计划。该计划关注的方向主要包括如下几个方面：支持跨学科领域研究，解决不同生态系统微生物的基本问题；开发平台技术，对不同生态系统中微生物组的认识以及知识的积累，并提高微生物数据的访问；通过公民科学、公众参与，扩大微生物的影响力。

整体来讲，各国都在加紧制定符合本国经济利益的微生物组项目。项目的目标设定都比较宏观和长远，国际化合作项目越来越多，并且精细化，专业化项目也越来越多。其中，在计算生物学和生物信息学、参考数据库和生物资源库、标准化的协议和工具等方面是微生物组研究的重点。纵向和功能性的微生物组研究，以及跨学科研究也越来越受欢迎。

二、市场分析

美国政府一直在微生物组研究领域进行投资。早在2007年，美国国家卫生研究院启动的人类微生物组计划（HMP）中，就累计投入资金2.15亿美元，为今天微生物组研究的迅猛发展奠定了基础。近几年，美国政府对微生物组领域的支持力度进一步增加。美国官方2015年公布的报告显示，2014年度在微生物组研究领域的联邦投资是2012年投资的3倍，最近3年间的联邦投资总额超过9. 22亿美元。2016年，美国白宫宣布启动国家微生物组计划（NMI）中，美国政府将在未来两年投入1.21亿美元联邦资金作为该计划的启动资金，除了联邦机构外，还有数十所大学和研究机构将加入“国家微生物组计划”，他们将在未来几年投入总共４亿美元的启动资金。

据不完全统计，2016年，提供宏基因组测序服务的公司在微生物业务方向的销售额超过1亿5000万元。其中上海美吉生物医药科技有限公司2016年微生物业务方向业绩达到4600万元，较2015年（3700万元）同期增长12.43%（表4）。

表42016年度国内部分测序服务公司全年测序服务业务额汇总

19壹基因0.15-

20世和基因0.1-

21菲沙基因0.1-

2016年国家自然科学基金中标项目统计结果显示，微生物组研究领域的国自然中标项目584个，累计金额2.75亿元，占国家自然科学基金总金额（183.2亿元）的1.5%。在微生物组研究领域中，肠道、土壤和水体微生物组研究方向占据微生物组研究方向总金额的58.05%。其中肠道微生物组研究方向占据首位，中标项目137个，累计金额7487万元，占微生物组研究方向总金额的27.23%，土壤微生物组和水体微生物组各占微生物组研究方向总金额的19.96%和10.86%（表5）。

表52016年度国家自然科学基金微生物组研究方向中标项目统计结果汇总

排序方向项目数量金额（万元）微生物组方向金额占比

1肠道微生物组研究方向137748727.23% 2土壤微生物组研究方向125549019.96% 3水体微生物组研究方向60298610.86%

合计3221596258.05%

三、研发动向与展望

目前宏基因组学研究中仍有许多挑战需要解决以增加我们对微生物组群落和潜在功能的深入理解。微生物群落分析最大的一个障碍是生物信息学和计算瓶颈，如构建基因集以改善reads的组装、构建特定微生物类群注释平台并开发多组学综合算法以增强对微生物组群落和潜在功能的阐释。宏基因组学研究中还需要解决的其它挑战包括：高度多样化和复杂样本类型（如土壤、沉积物和人体肠道）中DNA分子的提取，直接从复杂生态系统中组装完整基因组序列而非序列片段，满足大型宏基因组de novo组装的高计算内存需求，对TB到PB数据足够的存储和分析选择，开发统计和数学模型来整合数据并提供有生物学意义注释信息。

1.普及宏基因组测序技术，降低宏基因组学研究成本

国内宏基因组学研究仍落后于国外研究水平，其中一部分原因归结于宏基因组研究成本较高。目前国内大部分科研及医疗机构从事微生物组的研究仍然依托于扩增子测序技术（价格是宏基因组测序服务价格的十分之一），并且对宏基因组测序技术了解不够深入。相较于2015年，2016年测序成本降低至同期的四分之一，但宏基因组测序服务（测序+生物信息学分析）价格却只降低了约30%，因此我们仍需促进宏基因组学研究的普及，以提高科研及医疗机构研究人员生物信息学分析能力和水平，从而降低宏基因组学研究的服务成本。

2.控制实验成本的同时降低污染，客观还原环境微生物群落结构

针对人体、动物和植物组织等含有宿主细胞，以及粘膜、血液和牙龈等微生物含量较低的样本类型时，常规DNA提取手段仍无法有效避免宿主或环境（试

剂盒）污染。目前针对宿主的污染情况可在后续生物信息分析时通过比对宿主参考序列剔除；微生物含量较低类型样本可以通过全基因组扩增（WGA）的方法提高微生物DNA的含量，但研究成本会相应增加。因此，我们仍需要研发特殊的方法，如基于宿主与微生物DNA沉降系数不同进行梯度离心以最大程度的降低宿主DNA含量。此外，由于不同微生物（如细菌与真菌）细胞壁结构存在差异，目前市场上流通的DNA抽提试剂盒很难保证均一化抽提各类微生物的DN A。就细菌与真菌而言，我们可以基于两者细胞壁结构的不同，在进行微生物细胞裂解前加入真菌破壁酶，提高真菌DNA抽提的比率，以期最大程度客观还原环境中微生物的真实群落结构组成。

3.优化生物信息分析流程，提高数据利用率

目前微生物组研究主要集中在人体和实验室环境方向，针对极端环境领域尤其是未知的复杂微生物组样本类型的测序数据，数据拼接利用率较低（不足50%）。针对这些情况，一方面我们需要拓展对未知环境领域的微生物组研究和认识，将已有的数据整合构建参考数据库；另一方面还需要优化宏基因组数据拼接流程并开发新的算法，以尽可能提高宏基因组数据的利用率。也可以参考基因组学研究中酶切图谱技术，Hi-C（又称Meta3C）技术，三代测序数据辅助拼接，以及二代、三代数据混合拼接等方法以提高测序数据拼接效率和准确性。

4.宏基因组测序流程标准化，数据共享更具可比性

在微生物的研究中，宏基因组测序技术作为主要方法，已经并且将继续产出海量的测序数据和分析结果。在宏基因组测序中使用标准化的实验和分析流程将有助于后期数据的整理、储存和共享。此外还需要各领域研究组织和机构间相互协作，建立宏基因组数据共享平台，将测序数据以及结果信息（Metadata）以标准化的语言格式上传共享，以便于不同研究者间进行相同或不同生态系统间微生物多样性和功能的比较，以及检索特定生态系统中微生物群落和功能。

5.宏基因组测序与其它组学相结合，微生物研究更深入

近十年核酸测序和质谱（MS）技术的进步使得分析各种日益复杂的生态系统中微生物组成为可能。近十几年，国外的科研工作者采用先进的测序和质谱技术相结合对不同多样性和复杂性的微生物组（包括切页蚁群、白蚁肠道、人体肠道、沉积物、海洋水体、冻土和草原土壤等）进行了研究，然而国内的多组学研究目前仍然不够成熟。随着技术手段的不断提高，利用多组学结合技术（基因组学、转录组学、蛋白组学与代谢组学相结合）将微生物群落的新的和已有的研究结果进行整合，对于破译微生物在它们栖息地的作用和确定微生物群落成员间复杂的相互作用对生态系统持续性和健康的影响至关重要。对这些对微生物群落表型更深入的认识将便于我们更好的理解环境扰动如气候变化和疾病对微生物组功能的影响，更好的预测这些变化的影响并促进形成维持生态系统稳定性和人体健康的策略。

6.启动中国人的微生物组计划

中国人也应该尽快启动自己的微生物组计划，利用中华民族遗传背景、生活方式和养生保健经验丰富多样的优势，把大规模的样本资源和现代组学技术和大数据技术结合，建立中华民族典型人群的健康与疾病微生物组标准数据库和菌种

库；建立以微生物组结构和功能动态为核心的人体健康监测新技术；开发可以调节微生物组改善健康的药食同源食品、药品、益生元、益生菌以及可以重构健康微生物组的菌群移植等新产品和新技术；为预防疾病、改善中国民众健康、推动中国传统医药升级换代和走向世界作出独特的贡献。