宏基因组测序技术检测方法

宏基因组测序技术检测方法

宏基因组测序技术检测标准

简介：

宏基因组测序介绍

宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代

基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、

种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研

究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究

提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，

也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。可以真实客

观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。目前又可以分为

针对16s DNA/18sDNA/ITS 测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就

是对这两者的具体介绍。

一、16s DNA/18s DNA/ITS 测序

16sDNA 是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中

16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。目前，普遍使用Roche 454 平台来对环境样品进行16s DNA 测序。因为16s DNA 序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454 平台的平均读长在400bp 左右，可以很好的避免此类问题。

二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就

可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪

个微生物。可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个

细菌基因组的全序列。此外，该项测序不单可以针对DNA 水平，也可以针对全RNA 进行基因表达水平的研究。

样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。

核酸提取：

宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。

核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = 1.8-2.0 ，260/230 = 1.8-2.0 ，电泳检测DNA应是完整的一条带

测序Sequencing

1) 16S/18S 测序：

Sanger 测序：

用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先通过PCR将

16S/18S 序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130 或ABI 3730 进行毛细管电泳测序。

由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现通常用做二代测序结果的验

证。

454 Platform ：

454平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GSJ unior System。

454 GSF LX+ System 测序读长可以达到600-1000bp，通量450-700M，GSJ

unior System 测序读长在400bp左右，通量在35M。

文库构建：

用fusion Primer 扩增核糖体RNA，将已扩增的rRNA 直接做乳液PCR，在GS FLX+ 和GS Junior 系统上进行测序。

测序深度：数据分析：使用免费的软件包对微生物的种群多样性进行鉴定，并进行比较。

1.MEGA：N一个宏基因组分析工具，可以在大量的测序数据中对测序结果进

行聚类分析。

2.MG-RAS：T 用于注释宏基因组样品的全自动软件。

3.IMG/M：基于宏基因组序列微生物群体的功能性。

4.CAMER：A致力于微生物生态学研究。

5.CARM：A可以通过未拼接的序列来进行物种组成和微生物的遗传潜力的研究。

6.GALAX：Y 用于高等真核生物的研究，例如昆虫等。

7.Greengenes：16S rRNA的数据库，可以用来做16S rRNA的比对。

8.QIIME：针对454 测序数据的宏基因组分析。

9.The Ribosome Database Project （RDP）：针对焦磷酸测序的分析方法。

Miseq Platform ：

Miseq 平台读长可以是2X250bp 或2X300bp。使用Miseq Reagent Kit V2 可以产出7.5-8.5Gb 的数据，使用Miseq Reagent Kit V3 可以产出13.2-15Gb 的数据。

文库构建：

根据感兴趣的片段设计引物，通过PCR扩增出片段做为模板构建文库。使用Nextera XT Sample Prep Kit 构建文库，按照试剂盒说明书操作。将建好的文库归一化处理并将其混到一起。在Miseq 系统里自动进行成簇反应，进而完成测序。

文库检验：

用Agilent 2100 检测文库大小片段是否与预期一致。文库片段是否集中。测序深度：

16S rRNA 测序深度应至少在50,000 条reads 以上，以保证较好的覆盖度。数据分析：

对微生物生态进行定量观察

Greengenes：16S rRNA 基因数据库和分析工具；宏基因组分析工具：MEGAN 核糖体数据库计划(RDP)

Ion Torrent Platform ：

Ion Torrent 平台主要有两个测序系统：Ion PGM System 和Ion Proton System。Ion PGM有两种读长，200bp 和400bp，Ion PGM主要应用三种芯片，Ion 314 Chip ，Ion 316 Chip 和Ion 318 Chip ，最多数据产出可以达到2Gb。Ion Proton 读长为200bp，最多数据产出可达到