资料-多糖含量测定的各种方法优缺点

苯酚-硫酸法测多糖含量

一、原理

多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。

二、试剂

1、浓硫酸：分析纯，95.5%

2、80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

3、6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配）

4、标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。

5、15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

6、5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

7、6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。

8、6mol/L 盐酸

三、操作

1、制作标准曲线

准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2、样品含量测定

1）取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。

2）离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。

3）水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。

4）定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。

四、注意

1、此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。

2、制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。

3、对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。

4、测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1~0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定，即可无碍。

蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量

一、实验原理

糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮（C14H10O）脱水缩合，形成糠醛的衍生物呈蓝绿色。该物质在620nm处有最大吸收，在150µg/mL范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。该法有很高的灵敏度，糖含量在30µg左右就能进行测定。

二、试剂器材

1、蒽酮试剂：精密称取0.1g蒽酮，加80%浓H2SO4100mL使溶解，摇匀。当日配制使用；

2、葡萄糖标准液：将无水葡萄糖置于五氧化二磷干燥器中，12hr后精密称取100mg，用蒸馏水定容至100ml；

3、其他器材：分析天平、分光光度计、容量瓶（100ml、50ml、10ml）、烧杯、具塞试管、移液器、移液器吸头、涡旋振荡器和废液缸等。

三、操作步骤

1、葡萄糖标准曲线的制作

取7支具塞试管，按下表数据精密配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液，每个浓度做2~3个重复：

管号0 1 2 3 4 5 6

标准葡萄糖溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水/mL 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 在每支试管中立即加入蒽酮试剂6mL，振荡混匀，各管加完后一起置于沸水浴中加热15min。取出，迅速浸于冰水浴中冷却15min。

在625nm波长下以第1管为空白，迅速测定其余各管吸光值。

以标准葡萄糖含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

2、样品的测定

将样品溶液糖浓度调整到测定范围，精确吸取2mL置于干燥洁净试管中，在每支试管中立即加入蒽酮试剂6mL，振荡混匀，各管加完后一起置于沸水浴中加热15min。取出，迅速

浸于冰水浴中冷却15min，每个浓度做2~3个重复。

在625nm波长下迅速测定各管吸光值。根据葡萄糖含量的标准曲线，由样品溶液吸光值计算各样品溶液中糖的浓度，并计算其糖含量。

四、注意事项

该法的特点是几乎可测定所有的碳水化合物，不但可测定戊糖与已糖，且可测所有寡糖类和多糖类，包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。

在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值，但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，否则会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。

不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时则可避免此种误差。

多糖含量的测定

一、原理

分子量大于10,000道尔顿的多糖经80%乙醇沉淀后，加入碱性铜试剂，选择性地从其他高分子物质中沉淀出葡聚糖，沉淀部分与苯酚-H2SO4反应，生成有色物质，在485nm条件下，有色物质的吸光度值与葡聚糖浓度成正比。

二、适用范围

参照AOAC方法。适用于检测含有分子量大于10,000道尔顿葡聚糖的样品。

三、仪器

1、分光光度计

2、离心机

3、旋转混匀器

4、恒温水浴锅

四、试剂

除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。

1、80%乙醇：800ml无水乙醇加水200ml。

2、2.5mol/L NaOH溶液：100gNaOH加蒸馏水稀释至1L，加入固体无水硫酸钠至饱和。

3、铜贮存液：称取3.0g CuSO4·5H2O，30.0g柠檬酸钠加水溶解至1L。溶液可贮存2周。

4、铜应用溶液：取铜贮存液50ml，加水50ml混匀后加入无水硫酸钠12.5 g，临用新配。

5、洗涤液：取水50ml，加入10ml铜应用溶液，10ml 2.5mol/L NaOH溶液，混匀。

6、1.8mol/L H2SO4：取100ml浓硫酸用水稀释至1L。

7、20g/L苯酚溶液：称取2.0g苯酚，加水溶解并稀释至100ml，混匀备用。

8、葡聚糖标准液：称取500mg葡聚糖（分子量500,000D）于称量皿中，105℃干燥4h 至恒重，置于装有干燥硅胶的干燥器中冷却。准确称取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容至100ml，葡聚糖标准浓度为1.0mg/ml。

9、葡聚糖标准应用液：吸取葡聚糖标准液10ml，用水稀释10倍，葡聚糖终浓度为0.1mg/ml。