转基因烟草方法

2．材料与方法

2.1实验材料

植物材料：K326烟草种子

药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等；

MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0

预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml

分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml.

生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10g

MS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基

2.3实验方法

2.3.1浸染菌液制备

将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。

挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。

活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。

取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。加入100ml的MS0培养基，混匀。

2.3.2烟草转化

按叶圆盘法转化烟草。将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。将浸染过的叶盘分接种在覆有两层滤纸的预培养

基上号，26℃下暗培养20-24h。用加头孢霉素，羧苄青霉素(母液1000倍)的无菌水清洗10分钟，最后用无菌水清洗10分钟，然后用无菌滤纸吸去其表面的液体再转入分化培养基进行分化培养，前期2-3天继代一次，每次继代需在无菌条件下进行，连续继代3次后就每隔两周继代一次。共培养至第一个小芽长出。转入组培瓶培养

待芽长至2厘米时，在超净台上切去芽基部的所有愈伤组织及基部叶片，植于生根培养基上。待根长至3厘米时，取出无菌苗，轻轻打碎固体培养基，洗去残留的培养基。然后将无菌苗置入土壤，套上透明塑料袋（扎孔），培养大约一周，移到室外。（最初的3天应在阴暗处生长）

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3．结果与分析

3.1无菌苗的培养：

图1为K326烟草种子在MS培养基中培养20天与40天左右的烟草幼苗图，每个培养瓶有4-5棵烟草幼苗。烟草植株大致生长到株高为6-8厘米时即可用于制作叶盘，此时每株大概有5-8片叶子，取中间大小且健康的的叶片用于制作叶盘。

A B

图1

3.2分化培养

图2分别为分化培养初期浸染叶片的培养图、叶片形成愈伤组织图片与愈伤组织上烟草新芽图片。浸染初期由于叶盘体积小，所以每个培养皿里面的叶小块大概15块。随着愈伤组织的形成和不断生长，培养皿条件已经不能满足愈伤组织的生长要求，这时将愈伤组织转入培养瓶中，每个培养瓶1-2个愈伤组织。定期给愈伤组织更换培养基以保证其充足的成长营养。愈伤组织经过再分化长成了烟草幼芽，此时，用携带AtWRKY22基因的农杆菌浸染的烟草愈伤形成的幼芽长势良好，而对照组的幼芽则被漂白。

A B

C

图2

3.3生根

图3为愈伤组织上形成的幼芽在生根培养基上的生长图。从图中可见幼芽生长迅速且未见污染现象，培养基内有长短不一的烟草根长出。烟草的根呈淡黄色且非常纤细。此图片说明转基因烟草幼芽已经成功生根。

图3

3.4转基因烟草的PCR反及分析

将移栽的烟草植株在室外条件下生长一段时间，取含有目的基因的转烟草植株叶片和不含目的基因的烟草植株叶片进行PCR反应，反应图谱如下：

图4

如图所示，M为标记基因电泳结果。1-6为转基因烟草PCR反应后的电泳图谱，7为非转基因对照组植物叶片的电泳结果。由图可知转基因植株中检测到了目的基因，这表明AtWRKY22基因已经成功转入烟草植株。而对照组植株没有检测到目的基因。

4．讨论

作为基因工程的模式植物，烟草是进行转基因研究最早，也是转基因种类较多的经济作物。自1986年以来，已经将烟草花叶病毒（TMV），马铃薯Y病毒（PVY），马铃薯X病毒（PVX）,黄瓜花叶病毒（CMV），苜蓿花叶病毒（AMV），烟草脆裂病毒（TRV）的外壳蛋白基因，PVY复制酶基因，CMV的微卫星RNA，几丁质酶基因、抗菌肽基因、葡糖糖氧化酶、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因（Bt）和蛋白酶抑制基因[12]等上百种外源基因转入烟草获得表达。在之前拟南芥基因转化烟草的研究中，郭兆奎等[13]将拟南芥A VP2基因转入烟草研究了此基因对植株吸收钾离子的影响。另外，付乾堂和余迪求[14]研究了拟南芥AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33在非生物胁迫条件下的表达分析。对于AtWRKY22基因，尚庆茂等[15]研究了其抗病途径。本实验用农杆菌介导和叶盘法相结合将拟南芥AtWRKY22基因转入烟草以获得抗病性转基因烟草植株。

许多因素都影响根癌农杆菌介导的基因转化：一是受体；二是农杆菌；三是受体与农杆菌的共培养时间。各种因素的影响程度不同。受体叶片的生理状态，它决定了被转化的能力。本实验采用了无菌培养的烟草苗，这就避免了用栽培苗消毒太彻底而导致叶片死亡或是消毒不彻底而导致培养过程中生长其他细菌、真菌的情况。烟草苗龄为1-2个月时，分化再生能力和对农杆菌感染的耐受力均较强。苗龄过短时，不易剪出叶缘和主脉的小块，且这种小块在分化培养基只能够也很容易发白而死亡。如果苗龄过长，特别是继代的时间过长或是代数过多，会