转基因烟草方法

2．材料与方法2.1实验材料植物材料：K326烟草种子药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等；MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。

高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml.生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10gMS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基2.3实验方法2.3.1浸染菌液制备将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。

挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。

活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。

取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。

加入100ml的MS0培养基，混匀。

2.3.2烟草转化按叶圆盘法转化烟草。

将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。

然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。

将浸染过的叶盘分接种在覆有两层滤纸的预培养基上号，26℃下暗培养20-24h。

用加头孢霉素，羧苄青霉素(母液1000倍)的无菌水清洗10分钟，最后用无菌水清洗10分钟，然后用无菌滤纸吸去其表面的液体再转入分化培养基进行分化培养，前期2-3天继代一次，每次继代需在无菌条件下进行，连续继代3次后就每隔两周继代一次。

共培养至第一个小芽长出。

转入组培瓶培养待芽长至2厘米时，在超净台上切去芽基部的所有愈伤组织及基部叶片，植于生根培养基上。

待根长至3厘米时，取出无菌苗，轻轻打碎固体培养基，洗去残留的培养基。

然后将无菌苗置入土壤，套上透明塑料袋（扎孔），培养大约一周，移到室外。

（最初的3天应在阴暗处生长）。

3．结果与分析3.1无菌苗的培养：图1为K326烟草种子在MS培养基中培养20天与40天左右的烟草幼苗图，每个培养瓶有4-5棵烟草幼苗。

烟草植株大致生长到株高为6-8厘米时即可用于制作叶盘，此时每株大概有5-8片叶子，取中间大小且健康的的叶片用于制作叶盘。

A B图13.2分化培养图2分别为分化培养初期浸染叶片的培养图、叶片形成愈伤组织图片与愈伤组织上烟草新芽图片。

浸染初期由于叶盘体积小，所以每个培养皿里面的叶小块大概15块。

随着愈伤组织的形成和不断生长，培养皿条件已经不能满足愈伤组织的生长要求，这时将愈伤组织转入培养瓶中，每个培养瓶1-2个愈伤组织。

定期给愈伤组织更换培养基以保证其充足的成长营养。

愈伤组织经过再分化长成了烟草幼芽，此时，用携带AtWRKY22基因的农杆菌浸染的烟草愈伤形成的幼芽长势良好，而对照组的幼芽则被漂白。

A BC图23.3生根图3为愈伤组织上形成的幼芽在生根培养基上的生长图。

从图中可见幼芽生长迅速且未见污染现象，培养基内有长短不一的烟草根长出。

烟草的根呈淡黄色且非常纤细。

此图片说明转基因烟草幼芽已经成功生根。

图33.4转基因烟草的PCR反及分析将移栽的烟草植株在室外条件下生长一段时间，取含有目的基因的转烟草植株叶片和不含目的基因的烟草植株叶片进行PCR反应，反应图谱如下：图4如图所示，M为标记基因电泳结果。

1-6为转基因烟草PCR反应后的电泳图谱，7为非转基因对照组植物叶片的电泳结果。

由图可知转基因植株中检测到了目的基因，这表明AtWRKY22基因已经成功转入烟草植株。

而对照组植株没有检测到目的基因。

4．讨论作为基因工程的模式植物，烟草是进行转基因研究最早，也是转基因种类较多的经济作物。

自1986年以来，已经将烟草花叶病毒（TMV），马铃薯Y病毒（PVY），马铃薯X病毒（PVX）,黄瓜花叶病毒（CMV），苜蓿花叶病毒（AMV），烟草脆裂病毒（TRV）的外壳蛋白基因，PVY复制酶基因，CMV的微卫星RNA，几丁质酶基因、抗菌肽基因、葡糖糖氧化酶、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因（Bt）和蛋白酶抑制基因[12]等上百种外源基因转入烟草获得表达。

在之前拟南芥基因转化烟草的研究中，郭兆奎等[13]将拟南芥A VP2基因转入烟草研究了此基因对植株吸收钾离子的影响。

另外，付乾堂和余迪求[14]研究了拟南芥AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33在非生物胁迫条件下的表达分析。

对于AtWRKY22基因，尚庆茂等[15]研究了其抗病途径。

本实验用农杆菌介导和叶盘法相结合将拟南芥AtWRKY22基因转入烟草以获得抗病性转基因烟草植株。

许多因素都影响根癌农杆菌介导的基因转化：一是受体；二是农杆菌；三是受体与农杆菌的共培养时间。

各种因素的影响程度不同。

受体叶片的生理状态，它决定了被转化的能力。

本实验采用了无菌培养的烟草苗，这就避免了用栽培苗消毒太彻底而导致叶片死亡或是消毒不彻底而导致培养过程中生长其他细菌、真菌的情况。

烟草苗龄为1-2个月时，分化再生能力和对农杆菌感染的耐受力均较强。

苗龄过短时，不易剪出叶缘和主脉的小块，且这种小块在分化培养基只能够也很容易发白而死亡。

如果苗龄过长，特别是继代的时间过长或是代数过多，会大大增加叶片玻璃化的机率，再生能力和对农杆菌感染的耐受力均下降。

对外植体的预培养促进细胞分裂，分裂后的细胞更容易整合外源DNA，因而提高外源基因的转化率[16]。

在对照实验中，不含目的基因的烟草叶盘形成的愈伤组织上产生的新芽被漂白，而转基因愈伤组织上的新芽则正常生长，与赵佩欧等[17]人的实验结果相符合，这主要是因为不含目的基因的新芽不含抗病基因，导致外植体在分化培养基上白化死亡。

本实验用WRKY22基因转化烟草，获得了转基因的烟草植株。

农杆菌介导AtWRKY22基因转化烟草植株的获得为今后研究AtWRKY22基因功能提供了科学依据。

参考文献[1]中国植物志编委会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1985.[2]许旭明.烟草的起源与进化[N].三明农业科技,109(3):25-27,2007.[3]朱尊权.中国烟草生产科研现状与展望[N].中国烟草学报,14（6）:118-119,2008.[4]谢剑平. 2006年烟草化学学科研究发展报告[N].中国烟草学报,13(2):98-99,2007.[5]郝冬梅.中国烟草加工业市场结构与绩效分析[D].北京:中国农业大学研究院,2001.[6]闫克玉,赵铭钦.烟草原料学[M].科学出版社,2008.[7]符树民.烟草知识四百问[M].上海人民出版社.1987.[8]赵左福, 张乐.植物病原细菌简明手册[M].北京:农业植物植疫实验所, 125-128,1992.[9]李光西, 方敦煌, 殷端.香料烟细菌性斑点病病原鉴定[N].植物病理学报, 37(3):232- 236, 2007[10]杨建卿.烟草病理学[M].合肥:中国科学技术大学出版社, 157-161, 2003.[11]中国植物志编委会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1985.[12]闫新甫.转基因植物[M].北京:科学出版社, 381-386., 2003.[13]郭兆奎,杨谦,严培强.拟南芥AVP2基因转化烟草中吸钾相关基因的转录分析[N].西北农林科技大学学报36（9）,2008.[14]付乾堂,余迪求. 拟南芥AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33在非生物胁迫条件下的表达分析[J].HEREDITAS.32(8):848-856,2010.[15]尚庆茂,李晓芬,张志刚.植物对逆境交叉适应的分子机制[N].西北植物学报27（9）:1921-1924,2007.[16]王关林,方宏均.植物基因工程的原理与技术[M].科学出版社,2002.[17]赵佩欧,谢科,郭泽建.水稻OsWRKY10与GFP融合基因的烟草转化及亚细胞定位观察[N].浙江农业学报18（3）:159-162,20065．致谢大学生活一晃而过，回首走过的岁月，心中倍感充实，当我写完这篇毕业论文的时候，有一种如释重负的感觉，感慨良多。

在这即将毕业的时刻，我想感谢身边的很多人。

首先诚挚地感谢我的论文指导老师李立芹老师。

她在忙碌的教学工作中挤出时间来指导我的整个实验过程，从题目的确定到最后论文的完成，她始终耐心地指导我，并认真审查、修改我的论文。

还要感谢教过我的所有老师们，你们严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样。

最后，感谢四年中陪伴在我身边的同学、朋友，感谢他们对我的关爱，感谢他们对我提出的有益的建议和意见，有了他们的支持、鼓励和帮助，我才能充实地度过四年的学习生活。