烟草培养方法以及转基因方法

烟草转基因
准备工具：EP管灭菌
无菌水
Ms培养基
75%的酒精（蓝口小瓶）
升汞(要回收)
1ml枪枪头
EP管架
计时器
一、转基因
(1) 无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；
(2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec；
(3) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；
(4) 播种于MS培养基上，培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实
验室组织培养室中，暗培养4天。

25℃光照培养20-30天。

MS培养基pH5.8
(5) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于MS+BA0.2mg/L（壮芽，使
其快速成长）培养基上，继代培养。

(6) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶
片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。

(7) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。

侵染前一天晚上，
摇菌农杆菌2瓶。

将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。

以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入As25mg/L（40ml 中加40ulAs）
不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；
(8) 将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切
口周围有微菌斑形成；
(9) 洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5
次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；
(10) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA
1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8；
过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。

如果长菌，则继续保持Cef浓度。

(11) 每两周更换一次培养基，直至长出不定芽（一般情况为2周）。

切下再生的
小苗（1cm 左右），转入继代培养基MS+ BA0.2-0.1mg/L+ Hyg25mg/L + Cef500mg/L pH5.8；
(12) 至小苗长至2cm长时（有小芽即可），转接入生根培养基MS+
NAA0.2-0.1mg/L上，24 士1℃、12h 光照、1500lx 培养三周左右即可长出粗壮根系。

(13) 对生根的植株进行PCR初步检测，将结果呈阳性的植株经过炼苗后移到泥
炭：蛭石=7:1的基质中，放入人工气候室进行培养，并对其生长情况进行观察、记录。

农杆菌侵染液的制备
(1) 取-80℃冰箱保存的含有表达载体的农杆菌，划平板培养，LB固体平板中加
入50mg/L Kan和50mg/L Rif；
(2) 挑取单菌斑到含50mg/L Kan和50mg/L Rif的5mL LB液体培养基中，放入
摇床中28℃、200rpm培养过夜（12h-16h）；
(3) 保存菌种，750ul菌液加入灭过菌的甘油250ul，-80℃冰箱保存备用。

(4) 摇菌，LB液体培养基10ml加Kan（所需浓度50mg/L）10ul、Rif（所需浓
度50mg/L）10ul及菌液10ul，28℃、200rpm过夜培养（12h-16h）。

(5) 当菌液浓度达到OD600=1.5左右时，取2mL菌液加入到离心管中，4000rpm
离心5min；
(6) 倒掉上清液，吸1mL新的MS液体培养基，重悬农杆菌，4000rpm离心5min。

(7) 重复步骤（6）一次；
(8) 用1mL的MS液体培养基重悬菌后，再加入到40mL的MS的液体培养基中
（含40ul 25mg/L的As），即为侵染液。

放置2h以上，再侵染。

200ml悬菌液
20x大量10ml
200x有机1ml
200x铁盐1ml
200x微量1ml
蔗糖5.6g
二、烟草转化Hyg筛选压的确定
因为所构建的载体具有潮霉素（Hygromycin,Hyg）抗性，所以转基因过程中需用Hyg进行抗性苗的筛选。

以MS培养基为基础，添加不同Hyg浓度梯度进行试验，共设7个Hyg梯度：0 mg/L、5mg/L、10 mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L。

取烟草叶片或茎段划伤口后分别接种到潮霉素的诱芽培养基中（40-45天），30天后观察受体材料生长情况，统计外植体的出芽率，选择可以抑制受体材料生长的最低Hyg浓度作为筛选压。

（70-75天。

）最终Hyg筛选浓度为25mg/L。