烟草培养方法以及转基因方法

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烟草转基因
准备工具:EP管灭菌
无菌水
Ms培养基
75%的酒精(蓝口小瓶)
升汞(要回收)
1ml枪枪头
EP管架
计时器
一、转基因
(1) 无菌条件下,将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次;
(2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec;
(3) 再用0.1%的升汞处理5min,最后用无菌水冲洗5次;
(4) 播种于MS培养基上,培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实
验室组织培养室中,暗培养4天。

25℃光照培养20-30天。

MS培养基pH5.8
(5) 待烟草苗长至3-5cm时(20-30天),取顶芽放于MS+BA0.2mg/L(壮芽,使
其快速成长)培养基上,继代培养。

(6) 继代培养14天后(有小叶片即可),取叶片,大小1cmX1cm,切去叶柄,叶
片表面及叶边缘划伤,放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上,正面朝下紧贴培养基放置,于黑暗条件下预培养2-3天。

(7) 然后取出预培养的叶片或茎段,放入侵染液中进行侵染。

侵染前一天晚上,
摇菌农杆菌2瓶。

将2ml离心管装满菌液,4000rpm离心5min,用悬菌液清洗两次。

以1:10比例(10ml悬菌液放1管1.5ml菌体)放入悬菌液,加入As25mg/L(40ml 中加40ulAs)
不断摇晃侵染液,使其与叶片及茎段切口处充分接触,10min后,取出,放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液;
(8) 将叶片及茎段放回到预培养基上,28℃黑暗条件下共培养2-3天,至叶片切
口周围有微菌斑形成;
(9) 洗菌,取出共培养的烟草叶片及茎段,用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5
次,第一次放置于摇床摇30min,后面每次5min,以洗去外植体表面的农杆菌;
(10) 取出后,用滤纸吸干,转移到烟草诱芽培养基上,诱芽培养基为MS+ BA
1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8;
过2周观察,如果发现不长菌,则降低Cef浓度。

如果长菌,则继续保持Cef浓度。

(11) 每两周更换一次培养基,直至长出不定芽(一般情况为2周)。

切下再生的
小苗(1cm 左右),转入继代培养基MS+ BA0.2-0.1mg/L+ Hyg25mg/L + Cef500mg/L pH5.8;
(12) 至小苗长至2cm长时(有小芽即可),转接入生根培养基MS+
NAA0.2-0.1mg/L上,24 士1℃、12h 光照、1500lx 培养三周左右即可长出粗壮根系。

(13) 对生根的植株进行PCR初步检测,将结果呈阳性的植株经过炼苗后移到泥
炭:蛭石=7:1的基质中,放入人工气候室进行培养,并对其生长情况进行观察、记录。

农杆菌侵染液的制备
(1) 取-80℃冰箱保存的含有表达载体的农杆菌,划平板培养,LB固体平板中加
入50mg/L Kan和50mg/L Rif;
(2) 挑取单菌斑到含50mg/L Kan和50mg/L Rif的5mL LB液体培养基中,放入
摇床中28℃、200rpm培养过夜(12h-16h);
(3) 保存菌种,750ul菌液加入灭过菌的甘油250ul,-80℃冰箱保存备用。

(4) 摇菌,LB液体培养基10ml加Kan(所需浓度50mg/L)10ul、Rif(所需浓
度50mg/L)10ul及菌液10ul,28℃、200rpm过夜培养(12h-16h)。

(5) 当菌液浓度达到OD600=1.5左右时,取2mL菌液加入到离心管中,4000rpm
离心5min;
(6) 倒掉上清液,吸1mL新的MS液体培养基,重悬农杆菌,4000rpm离心5min。

(7) 重复步骤(6)一次;
(8) 用1mL的MS液体培养基重悬菌后,再加入到40mL的MS的液体培养基中
(含40ul 25mg/L的As),即为侵染液。

放置2h以上,再侵染。

200ml悬菌液
20x大量10ml
200x有机1ml
200x铁盐1ml
200x微量1ml
蔗糖5.6g
二、烟草转化Hyg筛选压的确定
因为所构建的载体具有潮霉素(Hygromycin,Hyg)抗性,所以转基因过程中需用Hyg进行抗性苗的筛选。

以MS培养基为基础,添加不同Hyg浓度梯度进行试验,共设7个Hyg梯度:0 mg/L、5mg/L、10 mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L。

取烟草叶片或茎段划伤口后分别接种到潮霉素的诱芽培养基中(40-45天),30天后观察受体材料生长情况,统计外植体的出芽率,选择可以抑制受体材料生长的最低Hyg浓度作为筛选压。

(70-75天。

)最终Hyg筛选浓度为25mg/L。

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