烟草转基因操作细则

烟草转基因操作细则
烟草无菌苗准备:
将烟草种子灭菌放入1/2 MS培养瓶中发芽；然后按2-3株每瓶移植到新的1/2MS培养瓶中一般组培光温条件下生长。

转基因步骤：
1 10 mL YEB (YEP) 摇菌过夜（农杆菌菌株GV3101; EHA105 ）；
2 离心收集菌液；
3 用25 mL激活培养基(液)悬浮；
4 在28o C摇3-
5 h；
5 转入到培养皿；
6烟草叶片放到上面培养皿（含菌液的激活培养基）；
7 用解剖刀将烟草无菌苗叶片切至0.2-0.5 cm见方；
8 在激活培养基中浸泡10 min 左右；
9 将叶片取出，置于灭菌纸上吸干菌液；
10 将叶片放入共培养基上暗培养3天；然后将叶片用50 mL灭菌水（含一滴吐温和40 μL 头孢）洗4-6次，最后一次用纯灭菌水（不加吐温和头孢）；
11 将叶片转到筛选培养基（平板/或培养瓶）上，常规光温条件培养；
12 一般2周后有芽（小植株）出现；当小植株长出后，切下小植株转移到生根培养基（培养瓶）上培养。

培养基配方
激活培养基：MS (Suc 3%) + 200 μM As，pH5.2 (pH5.8)；
共培养基：MS (Suc 3%) + 2 (1)* mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.5 (5.8);
筛选培养基: MS (Suc 3%)+ 2 (1) mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.8，头孢0.5g/L；
潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）**；
生根培养基：1/2 MS (Suc 3%) [（+ 2 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA，可以不加），pH5.8，头孢0.5 g/L；潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）。

注：* [2 (1) mg/L 6-BA] 按(1)这些后面数据激素比例出愈（苗）率高，但是假阳性比例可能也较高。

**一般来看潮霉素假阳性少，卡那霉素假阳性较多。