圆二色谱CD原理

- band (nm) 222 208 216
220-230 (weak) 180-190 (strong) 190 200
+ band (nm) 192
195
205
210-230 weak 212
3、估算蛋白质二级结构含量
仅适合含量较高的蛋白质！
未知结构的蛋白的CD信号
• 将测得的CD曲线与标准曲线拟合。
• 可见光区：各种氨基酸都没有光吸收。
• 紫外光区：只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨 酸有吸收。
• 氨基酸分子内的紫外生色基团：吲哚基、酚羟基、 苯基、二硫键、咪唑基和羧基等。
2、肽的圆二色谱
活性肽构象与其生理功能的关系 肽的构象也是蛋白质构象的一种模型。 肽的圆二色性为研究肽在溶液中的构象提供了重要信息。
透射光强的变化频率与外加调制电压的频率相同。
交流成分S相 当于圆二色性
直流成分 IA=（IL+IR）/2
当调制电压过其峰值（正和负）时， εR＞εL时，透过的右旋圆偏光的光强对应于最大值，而左旋最小（实线）； εR＜εL时，透过的左旋圆偏光的光强对应于最大值，而右旋最小（虚线）。
PMT的输出信号由正比于IA的直流分量和正比于S的交流分量所组成。
• 圆二色性的存在将通过该物质传播的左、右圆偏光变成椭 圆偏振光。并且只在发生吸收的波长处才能观察到。
理论计算的圆二色性与该椭圆偏振光的摩尔椭圆率的关系：
[θ] = 100θ/（c ·l） = 3300（ εL-εR）
ε：介质对圆偏振光的摩尔消光系数， c ：样品摩尔浓度， l ：样品厚度（cm ）， [θ] 单位：℃/（mol ·cm）
相同
平面偏振光
不同 平面偏振光，方向改变
相同
椭圆偏振光
不同 椭圆偏振光，方向改变
振幅相等、振动方向相互垂直、相位相差1/4波长 的两平面偏振光合成圆偏振光
右旋
7、旋光色散（Optical rotatory dispersion，ORD）
旋光性：光学活性分子对左、右圆偏光的折射率不同，透射光虽然仍 然为平面偏振光，但其偏振面旋转了一定的角度。 旋光物质又称为光学活性物质。 旋光度：偏振面旋转的角度
x+ xb + xc = 1.0 t = x + xbb + xcc • 改变x、xb和xc，使t与样本曲线最佳拟合（最小二乘法，least squares minimization ）
myoglobin
t = x + xbb + xcc fits best with
朝光源看， 电场矢量方向按顺时针方向旋转的，称为右圆偏振光； 电场矢量方向按逆时针方向旋转的，称为左圆偏振光。
6、光的叠加
一束自然光可以看作是两束相互垂直而没 有相位关系的平面偏振光的加和。
旋转方向相反的 左、右圆偏光 透过一光学 活性物质后
振幅 相等 相等 不等 不等
透过的左、右圆偏光
相位
矢量和
圆二色性光谱及其应用
（Circular Dichroism，CD）
光学活性分子对左、右圆偏光 的吸收率的差值
1、自然光
光具有波、粒二象性，是横电磁波。只有横波才有偏振 现象:
光矢量的振动方向与光的传播方向垂直， 在垂直于光传播方向的平面内, 有不同的振动方向。 电场矢量E和磁场矢量H互相垂直、位相相同。
50
50 OC
40
75 OC
30
20
10
0
-10
-20
-30
-40
190
200
210
220
230
240
250
260
wavelength in nm
10 5 0 -5
-10 -15 -20 -25
200
fit to GCN4-p1 50OC data
original data best fit with mix of 0OC and 75OC spectra
圆二色光谱仪工作原理
• 用相同强度，相同频率的左、右旋圆偏光交替照射 样品测得透过样品后的强度IR和IL
• 由于IR和IL十分接近，令IA=（IL+IR）/2，S= IR – IL
• 只放大相应于S的PMT输出电压Es（交流信号），而不放 大相应IA的输出电压EA。（适当选取放大倍数G值，使ESG 与EA可比）。
如果所有的跃迁仅在基态的最低振动能级 和第一激发态之间，吸收光谱将是很狭窄 而不连续的谱线。
由于分子的价电子跃迁总伴随着振动和转 动能级的跃迁，所以，紫外分光光度计测 定物质的吸收光谱，虽然有一最大吸收峰 值，但都是具有一定波长宽度并相对平滑 的曲线。
光的吸收
若溶液中的溶质对某一波长的入射光有吸收，则透射光的 光强度小于入射光。
ORD是渐近线，两端不回归
ORD 吸收带附近，旋光度由负到正 吸收带附近，旋光度由正到负
正Cotton效应 负Cotton效应
CD 正CD带 负CD带
CD比ORD容易辨别重叠峰 CD比ORD弱带易检测
CD比ORD更容易拟合 CD比ORD提供较多意义明确的信息
表明有三个生色团，其中两个有光学活性
CD能够提供的信息：
210
220
230
240
250
wavelength in nm
GCN4-p1
(i) primary structure, (ii) secondary structure (iii) tertiary structure
Alpha-helix, beta-sheet 肽链骨架的构象变化
蛋白质的紫外吸收光谱主要有两个峰： 190-250nm：肽键 280-290nm：酪氨酸tyr，色氨酸trp
Far UV CD spectra of poly-L-Lys
1、100% α-螺旋 2、100% β-折叠 3、100%无规卷曲
Main CD features of protein 2ndary structures
α-helix β-sheet β-turn polypro II helix Random coil
9、ORD与CD光谱
同时产生， 包括同样的分子结构信息：光学活性物质分 子中的不对称生色团。 CD反映光与分子间能量的交换，旋光性则 是与分子中电子的运动有关。 可以由Kronig-Krammers转换方程相互转 换。
CD谱的极值处与吸收峰一致（科 顿效应，cotton effect），因而 分子中不同生色团对于谱的贡献 比在ORD中更容易分辨。
晶轴相互平行时， 透射光强度最大；
晶轴夹角为α时， 透射光强度与 cos2α成正比。
晶轴相互垂直时， 透射光强度为零；
3、平面偏振光（Plane polarized light）
也称线（完全）偏振光，简称偏振光。 它的振动面称为其偏振面。 振动方向保持不变 振幅发生周期性变化 E之端点在空间的轨迹为一平面正弦曲线 投影到垂直于光传播方向的平面上为一直线段
传播方向 在入射面内
折射率随方向而变化 不一定在入射面内
o光和e光：频率相同、振动方向相互垂直、平面偏振光
自然光入射到某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）时，晶片吸 收振动面与晶轴垂直的光，而只允许振动面平行于晶轴的光通过。
自然光
. ...
平面偏振光
.
. ...
. ...
. ...
起偏器
检偏器
Near-UV ~ Near-infrared (300-1000nm)： colored proteins
芳香氨基酸残基及二硫键处于不对称微环境时， 在近紫外区表现出CD信号
苯丙氨酸（ phenylalanine， Phe）：255、261和268nm附近； 酪氨酸（ tyrosine， Tyr） ：277nm左右； 色氨酸（ tryptophan， Trp） ： 279、284和291nm附近； 二硫键的变化反映在整个近紫外区。
4、布儒斯特角
当入射光射到两种介质界面上时，反射光和折射光的偏振情况与入 射光不同。
5、四分之一波片
使o光和e光的光程相差1/4波长的晶片。此时，相位差为 π/2，透射的合成光是长轴与晶轴重叠的正椭圆偏振光。
若入射平面偏振光的电矢量与晶体晶轴的夹角θ＝45°，则
Eo = Ee，合成光是圆偏振光（Circular polarized light）。
10、 J-810圆二色光谱仪
M0
LS S1
M2
M1
M4
P1
P2 S2
M3
O-ray
E-ray
M5
S3 L F CDM SH
PM
S1-S2:第一级单色器；S2-S3:第二级单色器; M：球面反光镜；P：晶体石英棱镜；L:透镜；F:滤光器；
由CDM交互形成的左、右旋圆偏光通过光学活性物质， 透射光强度随时间的变化
2、光的偏振
双折射现象： 一束光射入各向异性晶体后有两束折射光。 尼科耳棱镜。
在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各 向异性，淀粉粒、染色体和纺锤体等具有双折射性， 因此被用于组织细胞的化学研究。
名称 折射定律
寻常光 （o光）
遵守
非常光 （e光）
Βιβλιοθήκη Baidu不遵守
折射率
对于晶体一切方向都具 有相同的折射率
E
0
v
H
E
传播方向
振动面
由于感光作用都是E 引起的，因而，将E 作为光矢量。 振动面：E 与光传播方向组成的平面。
从统计规律上说，自然光的光振动: 在垂直于光速的平面上遍布所有方向， 沿各方向振动的光矢量呈对称分布, 相应光矢量的振幅（光强度）相等。
超高压短弧氙灯: 在高压纯净氙气中放电发光。
[ in 1000 deg cm2dmol-1
CD signals for GCN4-p1
O'Shea et al. Science (1989) 243:538
figure 3: 34M GCN4-p1 in 0.15M NaCl, 10mM phosphate pH 7.0
80
70
60 0 OC
Peltier Cell Holder
Stopped Flow
CD/Total Fluorescence
-20～200℃
FMO
蛋白质的光学活性
The peptide bond is inherently asymmetric and is always optically active
1、氨基酸的圆二色性
旋光色散：不同波长的偏振光的旋转角度不同。 旋光仪是测量旋光性与波长的函数关系，从而得到一个旋光色散谱。
圆双折射：某个物质对于左、右圆偏光的折射率分别为nL和nR， 若 nL = nR，则为光学各向同性物质； 若 nL ≠ nR，则为光学各向异性物质；左、右圆偏光的相位改变， 若nL＞nR，透射光的偏振面右旋。 若nL＜nR，透射光的偏振面左旋。
x = 80% xb = 0% xc = 20% agrees well with structure 78% helix, 22% coil
For further details:
www-structure.llnl.gov/cd/cdtutorial.htm
MRE in 1000 degs cm2mol-1
旋光现象是圆双折射的一种特殊形式。 旋光物质使左、右圆偏振光的速度不同，即其色散大小的折射率不同， 旋光现象的产生是由于光学各向异性物质的折射率nL≠nR的结果。
旋光，双折射
8、光的吸收和圆二色性（circular dichroism, CD）
化合物在正常情况下，处于低能的基态， 电子占据所有的成键轨道（σ、π、n轨 道）。如果电子吸收了外界的能量，它就 从基态跃迁到激发态能级。
或℃ ·cm2/dmol。
圆二色性的表示
吸收（率）差 = L - R A = AL – AR
椭圆度，摩尔椭圆度[] = 2.303（AL – AR）/4
[] = 3298（L - R） 3300 （L - R）
在蛋白质研究中，常用平均残基摩尔椭圆度
园二色＋双折射
Far-UV (250-170nm) Secondary Structure: α-helix, β-sheet, β-turn, random Tertiary Structure Class: all-α, α+β, α/β, all-βI, all-βII
Near-UV (320-250nm)： aromatic side chain
（1）高亮度的点光源； （2）日光色。色温接近6000K； （3）在可见光区连续光谱； （4）高显色性，显色指数＞95； （5）在整个寿命期内维持光色特性； （6）高电弧稳定性； （7）热重启能力； （8）启动后即能达到接近最大光输出； （9）电弧光斑小、易聚光。
自然光 平面偏振光
圆偏振光 样品
椭圆偏振光