硫酸软骨素双酶法生产新工艺
硫酸软骨素的提取和纯化的研究进展
硫酸软骨素的提取和纯化的研究进展栾允光赤峰学院化学系，赤峰024000摘要介绍了硫酸软骨素的来源、结构、性质及其生理功能，对硫酸软骨素的提取方法——中性盐法、碱提取法、酶提取法、超声波法、乙酸抽提法和纯化方法一一溶剂法、季铵盐化合物沉淀法、超滤膜法、色谱法电泳法的具体工艺路线及其优缺点进行了综述。
关键词：硫酸软骨素；提取；纯化硫酸软骨素（Chondroitin sulfate）是一种酸性粘多糖，广泛存在于哺乳动物的软骨、喉骨、鼻骨和气管中。
硫酸软骨素是由葡萄糖醛酸和氨基己糖交替连结而成的双糖聚合物，它通常与蛋白质结合成糖蛋白的形式存在，当其水解时发生消去反应，连接硫酸软骨素与蛋白质中丝氨酸羟基的苷键断裂，可以得到游离态的硫酸软骨素。
硫酸软骨素为白色或微黄色粉末,具有吸湿性，易溶于水而成粘度较大的溶液，难溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙醇、丙酮和冰醋酸等有机溶剂，并且遇热不稳定，乙酰基易发生水解脱落,在酸性条件下更易水解成不同聚合度的低聚糖。
硫酸软骨素具有降血脂、抗凝血、抗炎症及抗肿瘤等生理活性，临床上可用于预防动脉粥状硬化、提高机体免疫力、治疗风湿病和肾炎及由链霉素引起的听觉障碍。
硫酸软骨素与铜等金属离子结合可用于治疗皮肤病，与硝酸铋或氢氧化铝反应得到的络合物可用于治疗消化性溃疡，与苯甲酸酯、利多卡因或布比卡因作用生成的衍生物可用作麻醉剂。
作为食品添加剂，硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异味。
在化妆品中添加硫酸软骨素，可调节皮肤的细胞代谢，促进营养的吸收，保持皮肤的水分和改善发质。
[1,2,3]1 硫酸软骨素的提取1.1 中性盐法先用10%氯化钙提取，氯仿-戊醇（1：4）除去蛋白质，2倍量乙醇沉淀，最后以Lloyd 试剂精制。
而以透析法除杂质、氯化六氨合钴纯化，或一磷钨酸纯化，均可使工艺简化。
以30%氯化钾或30%氯化钾加1% 碳酸钾提取，高岭土吸附除去杂蛋白，可提高产品收率。
该方法提取的产品较白，各项指标符合国家标准，也不会造成环境污染，但是产率较低，造成原材料的大量浪费，对经济效益有一定的影响。
硫酸软骨素制作工艺流程
硫酸软骨素制作工艺流程英文回答：The production process of chondroitin sulfate involves several key steps.Step 1: Raw Material Preparation.The first step in the process is the preparation of raw materials. This includes sourcing and selecting high-quality bovine trachea or shark cartilage, which are the primary sources of chondroitin sulfate. The raw materials are inspected and cleaned to remove any impurities.Step 2: Extraction.Once the raw materials are prepared, the next step is the extraction of chondroitin sulfate. This is typically done using a combination of enzymatic and chemical methods to break down the cartilage and extract the chondroitinsulfate.Step 3: Purification.After extraction, the chondroitin sulfate undergoes a purification process to remove any remaining impurities and contaminants. This is often done through filtration and precipitation techniques to isolate the chondroitin sulfate from the extraction solution.Step 4: Drying.Once purified, the chondroitin sulfate is dried to remove any remaining moisture. This is typically done using a combination of air drying and vacuum drying to ensure the final product has the proper moisture content.Step 5: Testing and Quality Control.Throughout the production process, the chondroitin sulfate is tested for purity, potency, and quality. This ensures that the final product meets the necessaryspecifications and standards for use in dietary supplements or pharmaceuticals.Step 6: Packaging.The final step in the process is the packaging of the chondroitin sulfate. This is typically done in a controlled environment to prevent contamination and ensure the product remains stable during storage and transportation.中文回答：硫酸软骨素的制作工艺包括几个关键步骤。
硫酸软骨素生产工艺
硫酸软骨素生产工艺硫酸软骨素生产工艺动物软骨中均含有酸软骨素，大家畜的鼻中隔及喉头骨中含量较多，据报道，猪鼻中隔含有41%左右。
药物硫酸软骨素是从软骨中提取的硫梳软骨素A 和硫酸软骨素C等各种硫酸软骨素的混合物。
有的商品称康得灵。
本品用于因链、霉素所引起的听觉障碍症的预防和冶疗，如偏头痛、神经痛、风湿痛、肝炎等症。
性状：硫酸软骨素是一种白色粉末，吸水性强，易溶于水而成粘稠液体，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂中，其盐类对热较稳定上。
制法：硫酸软骨的制剂和片剂，它的生产工艺主要有稀碱和浓碱和浓碱提取两种，下面各介绍两种。
一、稀碱提取工艺之一工艺流程：猪喉（鼻）软骨，浸出氢氧化钠过滤，浸出液，酶水解盐酸、胰酶53～54℃，水解液，吸附活性白土、活性炭，沉淀氯化钠、乙醇，PH值6.3～7，沉淀物，干燥无水乙醇60～65℃，干品，制剂氯化钠P值5.5，注射液。
操作过程：浸出：将2%氢氧化钠250千克置浸泡罐内，加入洁白干燥软骨40千克，在室温下每隔半小时缓缓搅拌1次，待浸出液比重达波美5.0（20℃）度时出料。
用纱布过滤。
骨渣再用适量蒸镏水浸泡20分钟，过滤。
二次过滤液合并，使滤液总体积为200升。
酶解：将上述滤液置消化罐中，搅拌下缓缓加入1：1盐酸并调PH 值8.8～9.0，用循环水浴加热。
罐内温度达50℃时加入相当于1：25倍胰酶1300克（宜使用高倍的胰酶）继续升温，控制消化温度为53～54℃，不得超过50℃循环水浴温度55～57℃保持，水解7小时。
在水解过程中，由于氨基酸的增加，PH值会有下降，需用10%的氢氧化钠随时调整PH值至8.8～9.0，在水解过程后期，取反应液少许，用滤纸自然过滤到比色管中，10毫升滤液滴加10%三氯醋酸1～2滴。
若仅微显浑浊，说明消化情况良好，否则可酌情增加适量胰酶。
吸附：使内温53～54℃保持，用1：2盐酸调节PH值至10%氢氧化风俗溶液调PH值至6.0，并加入与滤液体积等同的1%氯化钠溶液。
软骨素工艺流程
硫酸软骨素生产工艺图
硫酸软骨素生产工艺说明
1、原料清洗：将动物软骨原料去除结缔组织及油脂，粉碎成软骨碎料。
2、消化（碱解）：软骨碎料加水，再加入氢氧化钠和氯化钠，使溶液中氢氧化钠
浓度为2~3%和氯化钠浓度为 1.5~2.5%，控制温度为50~60O C,连续搅拌保温6~8小时，静置取上清液。
3、酶解：上清液用盐酸调节PH为6~8，加入重量为动物软骨重量4%的胰酶在
50~60O C下酶解6~10小时，用盐酸调节PH值到5.5~6.5，得酶解液。
4、过滤：所得酶解液进行抽滤，得澄清酶解液。
5、醇沉：将酶解液用95%乙醇沉淀，沉淀物用65%乙醇洗涤，再用无水乙醇脱水，
得硫酸软骨素粗品。
6、真空干燥：真空度0.07~0.095Mpa，干燥温度65~80O C。
7、粉碎：100目粉碎过筛。
硫酸软骨素提取工艺及药理学作用的研究进展
福建水产,2007年6月第2期NO.2 J O URNAL O F FUJ I AN F I SHER I ES Jun.26.2007硫酸软骨素提取工艺及药理学作用的研究进展陈守平1,许永安2(1.、福建农林大学食品学院,福建福州350002;2、福建省水产研究所,福建厦门361012)摘要:硫酸软骨素是从动物软骨中提取的粘性多糖,在医药、化妆品和食品工业上有广泛的用途,市场前景广阔。
本文主要阐述了硫酸软骨素提取方法及其药理学作用的研究进展,为该领域的生产和研究工作者提供参考。
关键词:硫酸软骨素;提取工艺;药理学作用 硫酸软骨素(Chondr oitin sulfate,简称CS)是一种天然酸性粘多糖,属生物高分子化合物。
CS有A、C和D的3种异构体,均是由D2葡萄糖醛酸和N2乙酰2D2氨基半乳糖硫酸酯为单位组成[3],只是硫酸基位置不同。
CS广泛存在于人和一些动物如猪、牛、羊和鱼等软骨组织中,且通过共价键与核心蛋白相结合[1-3]。
CS为白色、无臭、略带咸味的固体粉末[4],吸水性强,易溶于水而成粘度大的溶液[5],难溶于乙醇、丙酮等有机溶剂[6,7],其盐类对热较稳定。
CS具有促进冠状动脉循环、降血脂、抗凝血、抗肿瘤和心血管硬化等活性[8～10],主要是治疗风湿和类风湿疾病的药物,对冠心病、动脉粥样硬化、心肌梗塞等心血管疾病的防治有一定疗效。
1 硫酸软骨素的提取工艺硫酸软骨素的提取方法有碱法、碱盐法、酶解、超声波法和乙酸抽提法等;其分离纯化有乙醇沉淀法、盐液沉淀法、季铵盐络合法和离子交换色谱法等。
目前国内普遍采用稀碱和浓碱的提取法,国外报道用稀碱稀盐综合提取法,而这些制备工艺一般都要经过酶解和活性碳或白陶土等处理。
111 碱法碱法提取硫酸软骨素的原理是基于硫酸软骨素与蛋白质结合的O-糖苷键可在强碱作用下发生β-消去反应,使糖-肽键断裂,硫酸软骨素从蛋白多糖中释放出来[11],但在强碱作用下硫酸软骨素易发生降解。
硫酸软骨素提取工艺工艺流程及注意事项
硫酸软骨素提取工艺工艺流程及注意事项哎呀呀，硫酸软骨素的提取工艺可太重要啦！要想得到高质量的硫酸软骨素，这工艺流程可得一丝不苟呀！
先说这工艺流程吧，那得像精心编排的舞蹈一样精准有序呀！不能有丝毫的马虎。
比如说，原材料的选取就得精挑细选，这就好比为一场盛宴准备最上乘的食材！然后是一系列的化学处理步骤，每个环节都要恰到好处，就像给精密的仪器校准一样。
再讲讲这注意事项，可千万不能掉以轻心呀！你想想，要是在提取过程中温度控制不好，那不是前功尽弃啦？这就跟开车速度不稳容易出事故一样。
还有呀，试剂的添加量也得严格把控，多一点少一点都不行，不然怎么能得到理想的产品呢？
哇塞，整个提取过程都要保持高度的专注和严谨，难道能随便对待这么重要的工作吗？就像对待珍贵的艺术品一样，每一个细节都要精心雕琢呀。
硫酸软骨素的提取可不是闹着玩的，这可不是小孩子过家家呀！一定要牢记工艺流程和注意事项，别等出了问题才追悔莫及。
要好好对待这个重要的提取工作呀！。
硫酸软骨素不同生产工艺的考察
浸提液
盐酸, pH 2. 8～ 3. 2 30 m in, 过滤
滤液
胰酶 (骨重量的 4% ) , 6 h pH 8. 5～ 9. 0, 50～ 54℃
酶解液
活性炭, 盐酸, pH 6. 5 80～ 90℃, 过滤
滤液
乙醇达 60% 4h
沉淀干60燥℃1
3. 2 稀碱提取工艺 ( )
软 骨 碎 片 2% 氢氧化钠 (骨重量 6 倍) 浸 提 液 盐酸, pH 2. 5～ 3. 0
27. 02 0. 016 3. 35
30. 16 0. 019 2. 98
4. 2 影响产品收率的主要因素是浸提是否完全、除 杂过程和沉淀过程的损失量。资料报道[1]2% 氢氧化 钠溶液便可从软骨中较完全地提取 1。 从现在的方 法和数据看, pH 13, 即约 0. 4% 的碱溶液辅以氯化钠 溶液也可较完全地提取 1。 但浓碱提取时, 时间较 短, 易使产品色泽加深, 温度高时尤甚; 即便用稀碱 溶液提取, 温度也不宜超过 40℃。 不同浓度的碱液 提取法可影响 1 的分子链降解。碱液浓度愈大、温度 愈高、提取时间愈长, 则分子降解程度愈大。 粘多糖 类药物其生物活性与分子量有关[7]。 如果希望药物 成分在特定的范围内保持分子完整, 则应避免用浓 碱提取, 并避免高温。1 分子量为 2×103～ 5×103 时 用于治疗动脉粥样硬化和风湿类症状效果较好。 4. 3 表 1 中不同工艺制得 1 的含量 (1 含量 % = 2. 82×氨基己糖含量[2]) 和氮含量都符合原料药的 要求。 一般说来, 1 含量愈高, 其氮含量在一定范围 内就愈低; 产品氮含量超过规定值愈多, 表明蛋白质 或其肽链杂质愈多。 提取后的处理过程主要是为了 除去蛋白质。比较几种工艺的产品质量可看出, 浸提 溶液中的离子强度对提取处理过程中限制蛋白质浸 出以及蛋白质沉淀影响较大, 离子强度较大时有利 于提高产品质量。
硫酸软骨素提取工艺工艺流程及注意事项
硫酸软骨素提取工艺工艺流程及注意事项嘿呀！今天咱们来聊聊硫酸软骨素提取工艺的工艺流程及注意事项哇！
首先呢，咱来说说这工艺流程。
1. 原材料的准备呀！这可太重要啦！得选用优质的软骨组织，比如猪、牛、鸡的软骨等等。
哎呀呀，可不能随便找些质量不过关的软骨哟！
2. 然后就是预处理啦！把软骨清洗干净，去除杂质和多余的组织，这一步可得仔细着点呢！要是没弄好，后面可就麻烦啦！
3. 接下来是酶解过程哟！加入适量的酶，让软骨中的成分分解出来，这可需要控制好酶的种类、用量还有反应条件呀！
4. 再就是分离和提纯啦！通过各种方法，像离心、过滤啥的，把咱们想要的硫酸软骨素从混合物中分离出来，哇，这可是个精细活！
5. 最后就是干燥和包装啦！把提纯好的硫酸软骨素进行干燥处理，然后包装好，就大功告成啦！
再说说这注意事项。
哎呀呀！这注意事项可不少呢！
1. 安全第一呀！处理化学试剂的时候，一定要戴好防护用具，小心别让自己受伤啦！
2. 控制反应条件可关键啦！温度、酸碱度啥的，都得严格把控，不然结果可就不理想喽！
3. 选择高质量的酶和试剂呢，这能保证提取的效果和效率，可不
能为了省钱而随便选哟！
4. 操作过程要规范哇！每一步都得按照标准流程来，不能偷懒，也不能马虎！
5. 设备的清洁和维护也不能忘呀！不然会影响提取的质量和纯度呢！
哇塞！总之，硫酸软骨素的提取工艺可不是一件简单的事儿，工艺流程得精心设计，注意事项得牢记心中！这样才能得到高质量的硫酸软骨素呀！。
猪鼻软骨硫酸软骨素双酶法提取初探
浓液二 ： 粗 重 缩。 ｉ 王 。 ． ： ： 重
。 成 品
硫酸 软骨素提取方 法有稀碱 一 酶解提 取法国 浓碱 一复合 、
酶酶解提取法四 以及双酶酶解法Ｈ 等。 目前 ， ， ｔ 工业 生产 中仍有 不少工 厂生 产工艺仍 然采用 浓碱法 、 碱法 、 稀 稀碱 稀盐 法等传 统工艺 ， 工艺控制 繁琐 ， 质量 不稳定 、 收率较低 ， 废料 易污染 且 环境。本实验 用酸性蛋 白酶 、 中性蛋 白酶 、 碱性蛋 白酶 、 木瓜蛋 白酶 、 肪酶等多 种酶进行 正交试验 ， 析不 同种 类酶对 硫酸 脂 分
按 １ ．的料液 比加入去 离子水 ，分别加 入原料 １ ：５ １ ％的第 １ 类
酶， ｐ 调 Ｈ值 至对应最 适作用范 围， ０Ｅ ５ ￣搅拌酶解 ２ ， ｈ 直到残渣 为总量 的 ２ ％左右 时倒去上 清液 ，残 渣中再加入 ０５ ０ ．％的第 １ 类酶 ， ｐ 调 Ｈ值至对应 最适 作用范 围，０ ５ ％搅拌酶解 １ 。 ｈ 滤去残 渣 ， ２次酶解 液合并 ，０ 将 ５ ℃恒温 １ ， ｐ ｈ 调 Ｈ值 至 ７５ 加入 ２ ．， ％ 的Ｎ Ｃ 和 ２ ａ １ ％的第 ２类酶进行酶解 和盐解 。 ５Ｅ ５ ￣恒温 ０５ ．ｈ后 ，
ＨＨ一 ６型恒温水浴锅 （ 坛市杰瑞尔 电器有限公司 ） 金 。
２ 实验方 法
２１ 双 酶 法 提 取 工 艺 流 程 ．
干 软 ’ ｌ ‘ 碎 骨 第ｉ 酶 ’ 提 。酶 解 南 液 燥 骨 预 软 ’ ’ § 粗 液第２ 酶 ｊ精 愦取 处 粉 类 类
贿 、 ｊ
从 哺乳动物组 织 中提取得 到 的硫 酸 软骨素 以 Ｃ — 、 Ｓ Ｃ为 ＳＡ Ｃ —
２ ０年 ４月 ０１
广 西 轻 工 业
硫酸软骨素 生产工艺
硫酸软骨素生产工艺硫酸软骨素是一种由软骨组织提取的天然高分子多糖，具有保湿、抗炎、修复皮肤等多种功效，可广泛应用于药品、保健品和化妆品等领域。
下面是硫酸软骨素的生产工艺。
第一步：原料准备软骨素的主要原料是鸡胸腔软骨，需要确保原料的质量和安全性。
软骨经过清洗、消毒后，切成小块，以便于后续的提取过程。
第二步：软骨提取软骨块放入提取罐中，加入适量的碱性溶液（常用的是NaOH溶液），将提取罐密封，进行高压高温的水煮处理。
水煮过程中，软骨中的软骨素会被溶解出来，形成软骨素溶液。
第三步：软骨素预处理软骨素溶液经过离心、过滤等处理，去除其中的杂质和颗粒物，得到纯净的软骨素液。
同时，根据实际需要，可以对软骨素进行一些物理或化学的处理，例如使用酶解剂进行分解，或者使用活性炭进行脱色等。
第四步：硫酸化反应将软骨素液缓慢加入硫酸液中，并同时进行搅拌和冷却，以避免反应过程中产生过高的温度。
硫酸与软骨素反应后，软骨素中的羟基被硫酸基取代，形成硫酸软骨素。
第五步：液固分离硫酸软骨素溶液经过澄清、过滤等处理，去除分散其中的固体颗粒，得到澄清的硫酸软骨素溶液。
第六步：浓缩和干燥将澄清的硫酸软骨素溶液进行浓缩处理，去除其中的水分。
通常采用真空浓缩、蒸发浓缩或者冷冻浓缩等方法进行。
浓缩后的硫酸软骨素溶液再经过喷雾干燥或者冷冻干燥等工艺，将其成为粉末状或颗粒状的硫酸软骨素产品。
第七步：包装和检验经过干燥的硫酸软骨素产品进行包装，一般采用密封包装，以防止湿气和杂质的进入。
同时，还需要对产品进行质量检验，检测其外观、含量、纯度等指标，确保产品的质量和安全性。
硫酸软骨素的生产工艺是一个基于鸡软骨的提取和化学反应的过程。
在生产中，需要注意原料的选择和质量控制，加强生产过程中的卫生与安全管理，提高产品的质量和稳定性。
超声波辅助复合酶提取鸡软骨中硫酸软骨素
超声波辅助复合酶提取鸡软骨中硫酸软骨素宋志鹏;徐丽萍;王鑫【摘要】以鸡软骨为原料,采用超声波辅助碱-双酶法提取硫酸软骨素,以硫酸软骨素得率为考察指标,选取最优提取方法,并对最优方法进行单因素试验和响应曲面优化.试验结果表明,最佳工艺参数为超声波功率500 W,超声时间120 min,碱性蛋白酶添加量为1％,木瓜蛋白酶添加量为2％,硫酸软骨素得率可达到36.08％.超声波辅助碱-双酶法耗时短,操作简单且得到的产品纯度高.【期刊名称】《哈尔滨商业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(032)001【总页数】6页(P38-43)【关键词】鸡软骨;硫酸软骨素;双酶;超声波【作者】宋志鹏;徐丽萍;王鑫【作者单位】哈尔滨商业大学食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室,哈尔滨150076;哈尔滨商业大学食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室,哈尔滨150076;哈尔滨商业大学食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室,哈尔滨150076【正文语种】中文【中图分类】TS251硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)又称牛磺软骨素、康得宁，多分布于哺乳动物的软骨、肌膜和韧带中，是结缔组织的主要成分之一[1].硫酸软骨素一种白色或淡黄色的粉末，无臭、无味，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，易溶于水.低温条件下比较稳定，当温度在60℃以上时则会降解[2].硫酸软骨素具有抗血栓、调节血脂、抗感染、增强免疫功能、清除自由基以及抗肿瘤等生理功能[3-5].在不同动物体内的存在类型不同，在猪、牛、羊等动物的软骨中主要存在的是硫酸软骨素A，而在鲨鱼等海洋动物体内主要含有的是硫酸软骨素C[6] 软骨中的硫酸软骨素以蛋白多糖的形式存在，是一种酸性粘多糖[7].硫酸软骨素对于角膜炎、视力老化等眼科疾病具有一定的治疗效果，可与生理盐水、羟基水杨酸己基汞钠等药物制成复方眼药水[8-11].硫酸软骨素在作为临床生化药物的同时，还被人们用在膳食补充剂中来改善人体机能[12-13].动物软骨中的硫酸软骨素迄今为止仍无法人工合成[14]，因而其提取及应用已成为当前功能性食品研究的一大热点.本文采用超声波辅助碱-双酶法提取硫酸软骨素，找出一种简单合理、成本低廉的提取硫酸软骨素的方法，使之能够尽快应用于生产当中，同时提高农产品附加值，对发展我国经济具有十分深远的意义.1.1 材料与仪器鸡软骨，哈尔滨千鹤冷冻食品；碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶，北京澳博星生物技术有限责任公司；无水乙醇，天津市天力化学试剂有限公司；氢氧化钠，天津市大陆化学试剂厂；氯化钠，天津市天新精细化工开发中心；盐酸、浓硫酸，西陇化工股份有限公司；咔唑，上海源叶生物科技有限公司.FZ102型中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；DL-5-B型低速容量离心机，上海安亭科学仪器厂；ZDF-6090型真空干燥箱，上海恒一科学仪器有限公司；ALC-1100.2型电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；TU-1900双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；酒精计，河间市黎民居玻璃仪表厂；KQ-500VDE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司.1.2 实验方法1.2.1 鸡软骨预处理鸡软骨经解冻处理后，置于锅内煮约30 min，至鸡软骨表面附着肉、筋膜、脂肪及其他软组织等杂质脱落，清水洗净，切割至薄片，烘干，粉碎，过40目筛后备用.1.2.2 硫酸软骨素的提取取5 g软骨粉，按料液比1∶20(g/mL)加入体积分数为3%的NaOH溶液，置于500 W、25 ℃条件下超声波辅助提取120 min.调节pH至10，加入原料质量分数1%的碱性蛋白酶[15-16]，50 ℃条件下搅拌酶解3 h.将酶解液进行离心操作，取上清液.调节pH值至6.8，加入原料质量分数2%的木瓜蛋白酶进行酶解.55 ℃水浴加热0.5 h后，80 ℃恒温5 min灭酶.离心，取上清液.将上清液调至中性，按滤液体积加入 2%的NaCl，搅拌至溶解加入无水乙醇至醇沉体系体积分数为65%(V/V)，静置过夜，收集沉淀离心，离心得到的沉淀再用少量无水乙醇洗涤脱水，放于鼓风干燥箱60 ℃干燥，得到硫酸软骨素粗提物.1.2.3 硫酸软骨素含量测定准确称取0.01 mL硫酸软骨素样品置于25mL具塞试管中，加入蒸馏水稀释至 5 mL，冰水浴中冷却.加入6 mL浓硫酸，盖塞振荡均匀后置于沸水中加热20 min，取出放于冰水浴中冷却.加入0.20 mL咔唑溶液，摇匀后置于沸水中加热15 min，显色，取出迅速置于冰水浴中冷却至室温.用无醛乙醇作为空白溶液进行参比，在526 nm波长下测定硫酸软骨素溶液的吸光度值.1)硫酸软骨素含量的计算其中：C为测量质量浓度，mg/mL； n为稀释倍数；V为提取液体积；mL； M为原料干重，g.2)硫酸软骨素得率的计算其中：W为硫酸软骨素得率，% ；m为硫酸软骨素粗品质量，g ；M为干燥鸡软骨粉质量，g.3)硫酸软骨素纯度的计算其中：W为硫酸软骨素质量分数，% CS为硫酸软骨素百分含量，% ； P为硫酸软骨素得率，%.1.2.4 硫酸软骨素提取工艺单因素试验1) 超声波时间单因素实验称取5份3 g原料，按料液比1∶20(g/mL)加入体积分数为3%的NaOH溶液，置于500 W、25 ℃条件下超声波辅助提取100、120、140、160、180 min.之后按提取方法的工艺流程进行操作，得到硫酸软骨素粗提物.干燥称重，计算硫酸软骨素得率.2) 超声波功率单因素实验称取5份3 g原料，按料液比1∶20(g/mL)加入体积分数为3%的NaOH溶液，置于300、350、400、450、500 W，25 ℃条件下超声波辅助提取120 min.之后按1.2.2进行试验.干燥称重，计算硫酸软骨素得率.3)碱性蛋白酶添加量单因素实验称取5份3 g原料，按料液比1∶20(g/mL)加入体积分数为3%的NaOH溶液，置于500 W、25 ℃条件下超声波辅助提取120min.调节pH至10，加入原料质量分数0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的碱性蛋白酶，50 ℃条件下搅拌酶解3 h.离心，取上清液.之后按1.2.2进行试验.干燥称重，计算硫酸软骨素得率.4)木瓜蛋白酶添加量单因素实验称取5份3 g原料，按料液比1∶20(g/mL)加入体积分数为3%的NaOH溶液，置于500 W，25 ℃条件下超声波辅助提取120min.调节pH至10，加入原料质量分数1%的碱性蛋白酶，50 ℃条件下搅拌酶解3h.离心，取上清液.调节pH值至6.8，加入原料质量分数1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%的木瓜蛋白酶酶解.55 ℃水浴加热0.5 h后，80 ℃恒温5 min灭酶.离心，取上清液.将上清液调至中性，按滤液体积加入2%的 NaCl.醇沉，干燥，得到硫酸软骨素粗提物.称重，计算硫酸软骨素得率.1.2.5 响应曲面法优化硫酸软骨素的提取工艺条件依据单因素实验结果，采用Box-Behnken模型对超声波辅助碱-双酶法提取硫酸软骨素的工艺条件进行响应曲面设计优化.以硫酸软骨素得率为响应值，考察超声波时间、碱性蛋白酶添加量、木瓜蛋白酶添加量三个因素对硫酸软骨素得率的影响.各因素的区间为：超声波时间100～120 min，碱性蛋白酶添加量0.8%～1.2%，木瓜蛋白酶添加量1.8%～2.2%，因子编码及水平见表1.2.1 硫酸软骨素提取结果采用超声波辅助碱-双酶法提取硫酸软骨素，经浓缩干燥，三次平行试验得率分别为30.07%、34.37%、31.25%，平均得率为31.89%.2.2 硫酸软骨素提取工艺单因素实验结果分析2.2.1 超声波时间实验的结果分析由图1可以看出，超声时间在100～120 min范围内时，硫酸软骨素得率随着时间的延长而增加，在时间为120 min时达到最大值为30.44%.这是因为随着超声时间的延长，超声波的空化和机械震荡等作用得到充分发挥，可使细胞破裂更完全，使硫酸软骨素得率随之增大.但时间超过120 min后，硫酸软骨素得率反而随着超声时间的延长而降低，这可能是由于长时间的作用造成了大分子多糖的断裂，其中部分硫酸软骨素发生水解，而且水解程度大于浸出的速度，造成提取过程中的损失增大而使硫酸软骨素得率降低.结果分析可知，最佳超声时间为120 min.2.2.2 超声波功率实验的结果分析由图2可以看出，超声波功率在350～500 W范围内时，硫酸软骨素的得率随着功率的增加而增加，在功率500 W时达到最大值为30.25%.这是因为随着超声波功率的增加，超声波的空化和机械震荡等作用得到充分发挥，可使细胞破裂更完全，使硫酸软骨素得率随之增大，在500 W时达到最大值.结果分析可得，最佳超声波功率为 500 W.2.2.3 碱性蛋白酶添加量实验的结果分析见图3.2.2.4 木瓜蛋白酶添加量实验的结果分析由图3可以看出，当碱性蛋白酶添加量在0.6～1.0%的范围内时，随着酶添加量的增加，硫酸软骨素的得率也随之增加，在1.0%时达到最大值30.37%.酶添加量超过1.0%后，硫酸软骨素得率随添加量的增加而逐渐降低.这可能是因为在酶浓度较低时，底物不能与酶充分反应，从而限制了蛋白质的水解程度，但随着酶添加量的不断加大，所有的底物都能与酶进行充分反应，以蛋白多糖形式存在的硫酸软骨素可以得到充分释放，进而提高了硫酸软骨素的得率.但如果酶添加量继续不断增大，会造成酶作为一种未被水解的蛋白质残留在提取液中的现象，进而降低了硫酸软骨素的得率.结果分析可得，1.0%为最佳碱性蛋白酶添加量.由图4可以看出，当木瓜蛋白酶添加量在1.6%～2.0%的范围内时，随着酶添加量的增加，硫酸软骨素的得率也随之增加，在2.0%时达到最大值32.57%.酶添加量超过2.0%后，硫酸软骨素得率随添加量的增加而逐渐降低.这可能是因为在酶浓度较低时，底物不能与酶充分反应，从而限制了蛋白质的水解程度，但随着酶添加量的不断加大，所有的底物都能与酶进行充分反应，以蛋白多糖形式存在的硫酸软骨素可以得到充分释放，进而提高了硫酸软骨素的得率.但如果酶添加量继续不断增大，会造成酶作为一种未被水解的蛋白质残留在提取液中的现象，进而降低了硫酸软骨素的得率.结果分析可得，2.0%为最佳木瓜蛋白酶添加量.2.3 响应曲面法优化硫酸软骨素提取工艺条件实验的结果分析见表2.2.3.1 超声时间与碱性蛋白酶添加量的交互作用的分析与优化图5反映了超声时间和碱性蛋白酶添加量的交互作用对硫酸软骨素得率的影响.从超声时间与碱性蛋白酶添加量的等高线和响应曲面可以看出，当木瓜蛋白酶添加量为2%时，这两个因素的交互作用比较显著.在实验水平范围内，超声时间和碱性蛋白酶添加量分别在110～120 min和1.0～1.1%的范围内，硫酸软骨素得率达到最大值.2.3.2 超声时间与木瓜蛋白酶添加量的交互作用的分析与优化图6反映了超声时间和木瓜蛋白酶添加量的交互作用对硫酸软骨素得率的影响.从超声时间与木瓜蛋白酶添加量的等高线和响应曲面可以看出，当碱性蛋白酶添加量为1%时，这两个因素的交互作用显著.在实验水平范围内，超声时间和木瓜蛋白酶添加量分别在110～120 min和2.0%～2.1%的范围内，硫酸软骨素得率达到最大值.2.3.3 碱性蛋白酶添加量与木瓜蛋白酶添加量的交互作用的分析与优化图7反映了碱性蛋白酶添加量和木瓜蛋白酶添加量的交互作用对硫酸软骨素得率的影响.从碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶添加量的等高线和响应曲面可以看出，当超声时间为120 min时，这两个因素的交互作用显著.在实验水平范围内，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶添加量分别在1.0%～1.1%和2.0%～2.1%的范围内，硫酸软骨素得率达到最大值.2.3.4 方差分析及显著性检验从响应曲面模型的方差分析表3可见，此模型高度显著(P<0.0001)，模型的校正决定系数=0.9388,说明该模型能解释93.88%响应值的变化.相关系数R=0.9865，说明该模型拟合程度良好，误差小，可以用来分析硫酸软骨素的提取效果.利用Design Expert软件对数据进行多元回归拟合，得到超声波辅助碱-双酶法提取硫酸软骨素的超声时间(X1)、碱性蛋白酶添加量(X2)和木瓜蛋白酶添加量(X3)的二次多元回归方程为：Y=27.63-0.37X1+1.12X2-0.57X3+0.15X1X2+0.15X1X3-0.85X2X3-2.20X12-1.71X22-6.67X32从表4回归方程系数显著性检验数据可知，模型一次项X2显著，二次项均显著.最佳工艺条件：超声时间120.61 min、碱性蛋白酶添加量1.01%、木瓜蛋白酶添加量2.03%，硫酸软骨素得率理论值为36.24%.2.4 验证试验结果分析采用响应曲面法优化后的工艺条件，根据实际试验条件优化工艺条件为：超声时间120.00 min、碱性蛋白酶添加量1.00%、木瓜蛋白酶添加量2.00%，进行验证试验，硫酸软骨素得率为36.24%，提取后硫酸软骨素质量分数为44.25%.以鸡软骨为原料，采用超声波辅助碱-双酶法提取硫酸软骨素，以硫酸软骨素得率为参考指标，对最佳提取方法的工艺条件进行优化.确定最佳提取工艺为：超声时间120 min、碱性蛋白酶添加量1%、木瓜蛋白酶添加量2%，硫酸软骨素得率为36.08%，提取后硫酸软骨素质量分数为44.25%.此方法成本低，耗时短，操作简单，而且对环境污染小，适合大规模工业化生产.【相关文献】[1] 熊双丽, 任飞, 吴照明, 等. 鸡胸软骨硫酸软骨素的制备及结构分析[J]. 食品科学, 2008,29(12):79-82.[2] 张静文, 张凤清, 张培刚, 等. 玉米芯多糖的提取及其单糖组成研究[J]. 食品工业科技, 2010 (3): 242-244.[3] TAKANISHI G C, BORST C A. 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表 ｌ 因素水平 表
表 ３ 方 差 分 析 结 果 表
２ ２ ３ 正 交试 验 及 结 果 ．．
精 密 吸取 供 试 品溶 液 ０ ５ｍ ， ． Ｌ 置具 塞 试 管 中 ， ２ １２ 下方 按 ．． 项 法 进 行 显 色 ， ５０ｎ 波长 处 测 定 吸 光 度 Ａ， 算 总皂 苷 的 含 量 。 于 ３ ｍ 计
白多糖 中释 放 出来 。 碱 提过 程 中会 使 提取 液 颜 色加 深 ， 期 除蛋 白 但 后
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耗， 简化 了操作 ， 得 新工 艺更 稳 定 。 使 现报 道 如下 。 １ 仪器 与 试 药
物 的 合成 和创 新 药 物 研 究 提 供 借 鉴 。
作 者 简 介 ： 湘 鄂 （ ９ ９一） 女 ， 北 枝 江 人 ， 读 博 士研 究 鲁 １７ ， 湖 在
生 ， 要 从 事 中 药及 其 制 剂 的工 艺和 质 量标 准 的研 究 ， 电 子信 箱 ） 主 （
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７ ２光 度 滴 定 仪 （ 士 万 通 公 司 ）Ｔ ０ 瑞 ；ｕ一１ ０ 型 紫外 分 光 光 度 ９１
’ ＇ ， ＇ ｌ １． １＇ ＇ ， ． １ ｌ ， ’ ’ ， ＇ ｌ ｌ ｌ ’ ， ， ’ ， ＇ ， ＇ ＇ ｍ ， ＇ ｌ ’ ’ ’ ， ． ． １
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２ ２ ４ 方 羞 分 析 结果 ． ．
理 。 者采 用 双 酶 法新 工 艺 ， 引 入新 型 复 合蛋 白酶 ， 笔 通过 去掉 碱 提 、 氧
化 步 骤 ， 著 缩短 了生 产周 期 ， 保证 产 品质 量 基 础 上降 低 了物 料 消 显 在
蛋 白多糖 的形式 存 在 …。 现行 硫 酸 软骨 素 生 产工 艺 大部 分 是 先碱 解 ， 然后 用 胰 脏 （ 酶 ） 碱 性 蛋 白 酶进 行 酶 解 ， 终 使 硫 酸 软 骨 素从 蛋 胰 和 最
总皂 苷 含 量较 高 ， 操 作 简 单 ， 用 提 取 时 问短 ， 节 能 、 术 经济 而且 所 从 技
和资源综合利用的角度来看 ， 应用超声提取具有一定的优势。
３ 讨 论
超声 提取法是 在提取过程 中进行超 声波强化 处理 ， 最大 的优
点 是 提 取 时 间 短 、 度 低 、 取 率 高 。 交 试 验 优 选 确 定 的 超 声 提 温 提 正
结 果见 表 ２ 。
表 ２ 正 交 试 验 结 果表
注 ： ２ ２） １＝ ９ Ｆ【 ， ０ ５ １ Ｆ（ ， ０ ０ ９， ２ ２） ＝ ９，Ｆ（ ２） ＝９。 ｏ ２， ｏＩ
Ｂ无 显著性差异 （ ０ １ ， Ｐ＞ ． ）故最佳 提取工艺 以 Ｂｃ 组合为佳 ， 。 即
１ 量 ４ ％ 的 乙 醇 提 取 ４ ａｎ ６倍 ０ ０ｒ 。 ｉ ２ ３ 结 果对 比 ．
本 研 究 结 果 表 明 ， 梅 根 中总 皂 苷 的含 量 高 ， 示 尚有 大 量 的 岗 预 研 究 工 作 有 待 进 行 ， 为 寻 找 高 效 、 毒 化 合 物 进 而 研 究 新 药 奠定 可 低
基础 ， 同时 也 可 为 有 机 合 成 化 学 家 开 展 分子 多 样 性 的 苷 类 天 然产
将 水 浴 提 取 法 和 超 声 提 取 法 两种 方法 按 优 化 条 件进 行 比较试 验， 分别 对 岗 梅根 总 皂 苷进 行 了提 取 和 含量 测 定 。 结果 水 浴提 取 法 总 皂苷 含 量 为 １３ ５ ， 声 提 取法 为 １ ７６ 。 见 ， 声 提取 所 得 的 ． ５％ 超 ．０％ 可 超
取 最 佳 工 艺 水 平 是 科 学 、 行 的 ， 利 于 实 际 生 产 降 低 能 源 、 约 可 有 节
时 间 ， 确 定 岗 梅 根 中总 皂 苷 的最 佳 提 取 方 法 为 超 声 提 取 ， 工 艺 故 其 以 Ａ ＢＣ 组 合 为 佳 ， １ 倍 量 ４ ％ 的 乙醇 提 取 ４ ａ ｎ 即 ６ ０ ０ｒ 。 ｉ
２１ ０ ０年第 ｌ ９卷第 ２ ２期
硫 酸 软 骨 素 双 酶 法 生产 新 工 艺
刘宪锋 ， 王 贞， 李稳强
４ ２０ ） ６ ０ ０ （ 华懋双 汇 实业 ＜ 团） 限公 司生 物化 学制 药厂 ， 南 漯河 集 有 河
制 技 剂术
摘要 ： 目的 介 绍 硫 酸 软 骨 素 双酶 法 生产 新 工 艺 。 法 引入 新 型 复 合 蛋 白酶 ， 用 双酶 法新 工 艺 生产 硫 酸 软 骨 素 。 果 与 现行 硫 酸 软 骨 素 方 采 结 生产 工 艺相 比 ， 有 效 缩 短 生 产 周期 、 低 生 产 成本 、 高产 品 质 量 。 论 双酶 法 生产 新 工 艺值 得 生 产 企 业 重视 和 推 广 。 能 降 提 结 关键词 ： 酸软骨素 ； 酶法 ； 工艺 硫 双 新 中 图分 类 号 ： ４ ０ ６ Ｒ ７ ． Ｔ ６． ：９７６ 文 献标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ６ ９ １２ １ ）２— ０ ５— ２ １０ —４ ３ （０ ０ ２ ０ ５ ０ 困 难 ， 重 影 响 产 品 色 泽 和 质 量 ， 要 在 后 道 工 序 进 行 氧化 脱 色 处 严 需
硫 酸 软骨 素 （ｈｎｒｉｎｓｌ ｔ， Ｈ ） 一类 动物 性 黏多 糖 ， 动 ｃｏｄｏｔ ｆ ｅＣ Ｓ是 ｉ ｕａ 由
物喉 骨 、 鼻软 骨 、 管或 骨 腱 、 带 等 含 硫 酸软 骨素 的软 骨 组 织 制取 气 韧
而成 。 软骨 中 ， 酸 软 骨 素 与 蛋 白 质 （ 胶原 蛋 白 ） 合在 一 起 ， 在 硫 如 结 以