青藤碱对细胞凋亡的影响研究进展

青藤碱对细胞凋亡的影响研究进展
青藤碱是青风藤的单体提取物，临床广泛运用于内风湿关节炎和内风湿疾病，近来越来越多的文献显示青藤碱对细胞的凋亡有调节作用。

本文就青藤碱对细胞的凋亡的影响作用做一综述。

标签：青藤碱；凋亡
调亡，又称程序性细胞死亡，是机体内调控细胞死亡的一种重要机制，在多细胞生物的生长、发育及维持机体稳态等方面发挥着非常重要的作用。

调亡与坏死不同，坏死作为细胞死亡的另一种形式，它会导致急性的炎症反应，而调亡却是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的主动死亡。

调亡过多或过少都会导致疾病的发生。

调亡的上调会造成细胞丢失紊乱，而下调则可能造成细胞增殖失控，进而导致癌症的发生。

细胞凋亡包括一系列生物化学事件，引起细胞发生特征性形体变化和生物化学改变。

形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。

首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180～200bp 片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。

生物化学变化：①DNA的片段化：细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。

这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA 片段约为180-200bp的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段，实验证明，DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死呈弥漫的连续图谱；②大分子合成：细胞凋亡的生化改变不仅仅是DNA的有控降解，在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子。

如TFAR-19就是在细胞凋亡时高表达一种分子，再如在糖皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡过程中，加入RNA 合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂即能抑制细胞凋亡的发生。

细胞凋亡主要有三种通路[1]：一种是以Fas和TNFR为代表死亡受体信号转导途径，凋亡发生过程中伴有caspase-8的活化；第二种是以线粒体为核心的凋亡途径，细胞色素C从线粒体释放到胞浆与凋亡相关因子1（APaf-1）继而与Caspase-9结合，引起Caspase-9自身剪切激活，启动凋亡过程中伴有caspase-9的活化；第三种是以内质网为核心的凋亡途径，凋亡过程中伴有caspase-12的活化。

调控细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和
抑癌基因。

其中研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。

青藤碱（Sinomenine，SIN）是从防己科植物青藤（Sinomenium acutum （Thumb.）Rehd. Et Wils）及毛青藤（Sinomenium acutm （Thunb.）Rehd. et Wil. Var cinerrum Rehd. et al）的干燥藤茎青风藤的单体提取物，其分子式为C19H23NO4，分子量为329.28，是青风藤中所含的主要生物碱。

青风藤味苦性平，归肝、脾经，具有祛风湿、通经络、镇痛、利小便之功效，用于治疗风湿痹痛、关节肿痛、麻痹瘙痒、水肿、脚气等，其化学成分主要含有青藤碱、青风藤碱、双青藤碱等，其中青藤碱具有抗炎、免疫抑制、镇痛、降压、抗心律失常等多种药理作用[2]。

20世纪初期，Ishiwari从日本青风藤中分离得到青藤碱单体，60年代我国学者朱任宏从国产青风藤中也发现青藤碱。

临床已有正清风痛宁片、缓释片、盐酸青藤碱注射液、毛青藤总碱片等制剂用于治疗类风湿关节炎及心律失常，且取得良好疗效，近年来还有用于治疗慢性肾炎、抗氧化、抗肿瘤、戒毒的报道。

对于青藤碱的作用以往较多关注于抗炎止痛方面，而对于青藤碱对凋亡的作用，了解较少。

近来越来越多的文献显示青藤碱对细胞的凋亡有调节作用。

本文就青藤碱对细胞的凋亡作用做一综述。

1 组织细胞
张茵[3]等通过流式检测细胞凋亡率，MTT比色法检测SIN对成纤维细胞生长的抑制作用，发现光镜及荧光显微镜下可见核固缩，变圆。

荧光染色增强等凋亡形态学变化。

流式细胞仪结果显示，随着SIN浓度及作用时间的增加，被处理的成纤维细胞凋亡率增加。

李乐[4]观察不同剂量青藤碱对建立H2O2损伤模型的SD大鼠乳鼠心肌细胞凋亡率发现与空白对照组比较，心肌细胞凋亡率显著增加，并随时间延长其凋亡率不断提高，SIN明显抑制H2O2所诱导各个时间段的心肌细胞凋亡率，其机制可能与抗脂质氧化、抑制心肌细胞表达NF-kB有关。

王文君[5]运用细胞培养，流式细胞术等方法，观察SIN对体外培养的RBL-2H3肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响，结果显示SIN对肥大细胞增殖有明显抑制作用，并能促进肥大细胞凋亡，且对肥大细胞脱颗粒有较强抑制作用，因此发挥抗炎抗休克作用。

南华大学戴润林通过流式检测凋亡率，WB检测p-ERK1/2蛋白表达，ELISA 检测IL-2表达，发现SIN能抑制IL-2的合成，并能诱导CD4+T细胞的凋亡，其分子生物学机制可能与其抑制p-ERK1/2蛋白信号及IL-2相关。

但也有研究显示虽然SIN能影响细胞的增殖，但与凋亡无关。

王海东[6]采用MTT及磷脂酰丝氨酸外翻分析发现SIN能显著抑制刀豆蛋白（ConA）和混合淋巴细胞MLC激活的单个核细胞增殖，随着浓度的增加其抑制作用加强，并与环孢素A（CsA）能够显著抑制ConA激活单个核细胞增殖，其作用途径不是通过诱导单个核细胞的凋亡。

2 肿瘤细胞
蒋廷枢[7]等采用MTT法检测SIN对非小细胞肺腺癌细胞NCI-H460细胞增殖，采用流式细胞AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡，TUNNEL法观察细胞形态学变化，扫描电镜观察细胞超微结构的变化，发现：随着SIN浓度的加大和作用时间的延长，其对细胞的增殖有明显的抑制作用，呈现明显的时间-剂量效应关系。

流式检测表明，SIN作用48h，有明显剂量依赖效应，随浓度加大，早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例都逐渐增加，通过电镜观察，SIN作用后，凋亡细胞体积变小，胞质浓缩，胞浆内空泡增多，染色质固缩、边集或碎裂成不规则块状，线粒体肿胀。

王晓洁[8]等采用MTT，流式，RT-PCR，WB检测发现ERK，p-ERK表达随处理浓度的增加而降低，MEK/ERK通路活化受抑制，且iSAPP-mRNA基因表达明显降低，发现SIN能抑制肺癌细胞株Calu-1增殖，促进凋亡，其机制与MEK 及ERK通路抑制有关。

吴敏[9]通过MTT法检测SIN及其卡铂联合对宫颈癌Hela细胞增殖的影响，及流式对SIN处理后宫颈癌Hela细胞周期及凋亡观察，发现SIN对Hela细胞的增殖有抑制作用，其机制可能与影响细胞周期分布、促进细胞凋亡有关。

龚立[10]应用形态学方法、AnnexinV荧光染色和流式检测肝癌细胞株HepG2细胞凋亡，定量检测ApO2.7及凋亡相关基因Bcl-2和Fas的表达，结果显示SIN 对HepG2细胞的生长有明显的抑制作用，并诱导凋亡，其机制可能与Bcl-2和Fas基因表达，改善线粒体功能有关。

张增弟[11]发现SIN在体外能抑制食管癌EC109细胞增殖并促进凋亡，其机制与抑制COX-2和Survivin蛋白表达有关。

张毅[12]等通过电镜、MTT、流式检测等发现SIN对人前列腺癌DU145细胞增殖有抑制作用，同时促进DU145的凋亡，能有效抑制人前列腺癌。

Zhang JX[13]等运用CCK-8，Hoechst33258及Annexin V/PI研究SIN和5-FU （5氟尿嘧啶）单独寄联合使用对结肠癌的作用研究中，发现SIN和5-FU单独及联合运用于LoV o结肠癌细胞株移植的裸鼠后，能明显抑制肿瘤的生长，SIN 或5-FU单独使用，可抑制LoV o结肠癌细胞株的增殖和促进凋亡，联合使用效果较单独使用效果明显。

WB显示SIN和5-FU联合作用的机制为促进Bax表达，抑制Bcl-2表达，同时，联合作用后未见明显副作用。

Li X[14]等在研究盐酸青藤碱对乳腺癌的作用时发现盐酸青藤碱引起了MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞株G1/S细胞周期停滞，导致细胞凋亡，引起了ATM/Chk2和ATR/Chh1通路调控的DNA损伤，而盐酸青藤碱导致的DNA 损伤是通过超氧化反应增强使活性氧（ROS）增加导致，用抗氧化剂NAC预处理后能阻断盐酸青藤碱导致的DNA 损伤。

盐酸青藤碱的抗肿瘤促凋亡作用与MAPK信号通路有关，盐酸青藤碱能引起细胞株p-ERK，p-JNK，p-p38剂量依赖性的增加。

而NAC预处理后，盐酸青藤碱引起的这些信号分子的增加减弱。

通过众多研究者的结果向我们展示了青藤碱在细胞凋亡中的效应。

根据现有的资料，我们可以认为，不同的细胞类型，不同的发育状态及多种因素的影响，决定了青藤碱在特定环境中发挥促凋亡的效应。

进一步深入研究青藤碱对凋亡的分子机制，将使我们更好地理解青藤碱对内风湿等免疫性疾病的治疗机制，同时为克服肿瘤寻找新的方法。

参考文献：
[1]李超，伏圣博，刘华玲，等.细胞凋亡研究进展[J]. 世界科技研究与发展，2007，29（3）：45-53.
[2]傅绍萱.青藤的药理作用Ⅱ-毒性及一般药理[J].药学学报，1963，10（11）：673.
[3]张莹，方勇飞，王勇，等.青藤碱对类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞体外增殖及凋亡的影响[J]. 第三军医大学学报，2007，29（12）：1179-1182.
[4]李乐，高小利，丁宝兴，等.青藤碱抑制H2O2诱导乳鼠心肌细胞凋亡[J].中国中药杂志，2008，33（8）：939-941.
[5]王文君，李红，杜群，等.青藤碱对RBL-2H3肥大细胞增殖凋亡以及活化脱颗粒的影响[J]. 免疫学杂志，2009，25（03）：261-163.
[6]王海东，刘庆军，徐秀红，等.青藤碱对人外周血单个核细胞的抑制作用及机制探讨[J].中医药临床杂志，2005，17（2）：150-151.
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[8]王晓洁，牛剑明，徐丽丹，等.青藤碱抑制肺癌细胞株Calu-1增殖、凋亡影响的实验研究[J]. 现代肿瘤医学，2013 21（2）：267-270.
[9]吴敏，李新国，张瑜，等.青藤碱与卡铂对宫颈癌Hela细胞增殖的协同抑制研究[J].实用妇产科杂志，2009，25（8）：473-476.
[10]龚立，高永翔.青藤碱诱导肝癌细胞凋亡的实验研究[J].成都中医药大学学报，2007，30（03）：38-39.
[11]张增弟，江川，鄢莫慧，等.青藤碱调节EC109细胞增殖与凋亡的COX-2信号通路研究[J].中西医结合研究，2012，4（5）：241-243.
[12]张毅，徐小嫚，张雁，等.青藤碱对人前列腺癌DU145细胞增殖、凋亡的影响[J]. 中国医刊，2013，48（1）：31-33.
[13]Zhang JX Yang ZR，Wu DD etc Suppressive effect of sinomenine combined with 5-fluorouracil on colon carcinoma cell growth[J].Asian Pacific Organization for Cancer Prevention，2014，15（16）：6737-6742.
[14]Li X，Wang K，Ren Y，et al.MAPK signaling mediates sinomenine hydrochloride-induced human breast cancer cell death via both reactive oxygen species-dependent and -independent pathways：an in vitro and in vivo study[J].Cell Death and Disease，2014，5e：1356.。