实验11大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA的转化

大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA的转化

南京大学生命科学学院生技基地

一、实验目的

1、了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。

2、学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞、外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术。

二、实验原理

在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

转化的方法：

）制备的感受态细胞，通过热1.化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl

2

击处理将载体DNA分子导入受体细胞；

2.电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。

受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，

使外源DNA能够进入；进入受体细胞的DNA分子可表达其携带的某些基因（如抗生素抗性、酶等选择标记基因），使转化细胞在选择培养基上表现出不同于未转化细胞的特征，从而可将转化细胞选择出来。

筛选的原理是：本次实验用于转化的质粒带有用于大肠杆菌篮白筛选的相关酶基因，可使受体菌在含对应底物的选择培养基上呈现蓝色，受体细胞本身缺乏相应基因，呈现白色。

二、实验主要仪器设备

1、恒温摇床

2、电热恒温培养箱

3、冷冻台式高速离机

4、无菌工作台

5、低温冰箱

6、恒温水浴锅

7、制冰机

8、分光光度计

9、微量移液枪

三、实验材料

1、大肠杆菌DH5α

2、带有质粒pUC18的大肠杆菌

四、实验试剂

1、含0.2％葡萄糖的LB液体培养基（pH7.2—7.4）：

称取蛋白胨10克，牛肉膏5克，氯化钠5克，加蒸馏水800毫升溶解上述试剂，用1mol/LNaOH调pH7.2—7.4，补加蒸馏水至1000毫升。8磅/英寸2灭菌30分钟。

2、含0.2％葡萄糖LB固体培养基：LB液+1.8％琼脂，8磅/英寸2灭菌30分钟。

3、转化缓冲液(TSS)：

100ml LB中加入

10g PEG8000，

6ml DMSO

5ml 1M MgSO4

4、氨基苄基青霉素（Apm）液（20mg/ml）：称取Apm（医用粉剂）20毫克，加无菌蒸馏水1毫升，临用时配制。

5、 IPTG（异丙基-b-D-硫代半乳糖苷）贮存液（100mmol/L）：1.19 g （IPTG

分子量为238.31）IPTG加水至50 ml，过滤除菌后-20℃避光保存。

6、铺平板用LB固体选择培养基（含Amp、IPTG、Xgal）：

将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入：

（1）Amp储存液，使终浓度为50ug/ml；

（2）IPTG贮存液，使终浓度0.1mmol/L；

（3）Xgal贮存液，使终浓度20 ug/ml

摇匀后铺板。

五、实验方法和步骤

一）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl

法)

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（1）从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期, OD600 ＝1左右。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

（2）每人取2个离心管，转入3ml培养液（1.5mlX2），在冰上冷却2-3min，于4℃，4000r／min离心5min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；

（3）倒净上清培养液，按照0.75ml/管，用冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，，冰浴15 min ；

（4）4000r／min离心5min；

（5）弃去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置2小时后，即制成了感受态细胞悬液；

二）细胞转化

（1）取1 µl质粒DNA加入100µl感受态细胞，轻轻摇匀，冰上放置30min （2）于42℃水浴中保温1min，然后迅速冰上冷却2min

三）平板培养

（1）取各样品培养液20ul或50ul，涂布于含Amp抗菌素的LB平板培养基上，（用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。

（2）菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)。

六、实验结果观察

细胞生长良好，转化细胞呈蓝色分布，转化率较高（如图1）。