临床PCR试剂盒的选用和质检讲解

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乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)操作说明

心数秒，按 43μl/管分装到反应管中。 2. 内参配制将 n×3μl 内参（单通道仪器不加内参）及 n×50μl 核酸提取液 B 至于一新离心管中混匀备用（混合后避免反复冻融使用，使用前混匀 5 秒钟）。 3. 样本、对照品的处理样本处理：取 100μl 待检血清样本（冻存血清使用前在室温融解，振荡混匀 10 秒钟）分别加入 100μl 核酸提取液 A，振荡混匀 10 秒种，12000rpm 离心 10 分钟，弃上清；分别加入 50μl 核酸提取液 B 与内参的混合液至沉淀中（使用前一定要充分混匀，将颗粒和液体一起加入沉淀中，其中颗粒量应在 15％以内），振荡混匀 10 秒钟， 100℃保温 10 分钟， 12000rpm 离心 2 分钟。处理后的样品应在 1 小时内使用，或在-20℃～-80℃最长保存 1 个月（不宜反复冻融）。血清对照品处理：按照血清标本处理方法处理试剂盒内阳性血清对照、弱阳性血清对照、阴性对照。（冻存血清对照品使用前在室温融解，振荡混匀 10 秒钟）。定量校准品处理：定量校准品无需处理，在样本加样前直接将定量校准品 1 号至 5 号振荡混匀 10 秒钟，低速离心数秒后加样。 4. 样本加样将样品处理上清液（冻存样品使用前室温充分融化，振荡混匀数秒，12,000rpm 离心 2 分钟）、阳性血清对照、弱阳性血清对照、阴性对照以及定量校准品各 7μl 分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置定量 PCR 仪上。 5. 仪器扩增程序 1、ABI7300/7500/Mx3000P/SLAN 双通道仪器：反应管先在 50℃反应 2 分钟，然后 94℃保温 5 分钟，再按 94℃10 秒→60℃45 秒循环 40 次。60℃采集 FAM、JOE 荧光通道的信号。 2、LightCycler 480 仪器：反应管先在 50℃反应 2 分钟，然后 94℃保温 5 分钟，再按 94℃10 秒→60℃45 秒循环 40 次。 60℃采集 FAM、RED 610 荧光通道的信号。 3、单通道仪器：反应管先在 50℃反应 2 分钟，然后 94℃保温 5 分钟，再按 94℃10 秒→60℃45 秒循环 40 次，60℃采集 FAM 荧光通道信号。 6. 质量控制试剂盒中提供定量校准品五个，阴性对照，阳性血清对照和弱阳性血清对照各一个。如试剂质量完好并操作正确，阳性血清对照、弱阳性血清对照、定量校准品应表现为阳性结果，阴性对照应表现为阴性结果，阳性血清对照定量值为 5.0±2.5 ×10 IU/ml，弱阳性血清定量值为 5.0±2.5×10 IU/ml。如超过范围则实验无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。在每次检测中都应设置阴阳性对照品。 7. 结果判断仪器程序运行完成后，按软件要求进行结果保存，输入HBV 定量校准品的量值，选择自动分析模式，软件将自动给出标准曲线并计算各样本的HBV DNA 含量Q(IU/ml）。

丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(PCR-荧光探针法)(北京纳捷诊断说明书2018年)

丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书【产品名称】通用名称：丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒（PCR–荧光探针法）【包装规格】 48人份/盒【预期用途】本试剂盒用于体外定量测定血清样本中的丙型肝炎病毒（HCV）核酸（RNA），适用于需要进行HCV感染检测的患者和接受抗病毒治疗的丙型肝炎患者。

本试剂盒可以检测HCV 1~6型临床常见型别，主要通过对丙型肝炎患者血液中HCV RNA含量及变化情况的监测，用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果。

该检测不得作为患者病情评价的唯一指标，必须结合临床表现和其他实验室检测指标对患者病情进行综合评价。

本试剂盒不得用于HCV的血源筛查。

【检验原理】本试剂盒在PCR扩增管内用含磁珠的裂解液提取血清样本中HCV RNA，并在同一管中进行扩增，HCV RNA在逆转录酶作用下反转录成HCV cDNA，然后在DNA聚合酶的作用下，应用TaqMan探针技术扩增HCV cDNA并进行实时荧光定量检测。

本试剂盒校准品和质控品为含有丙型肝炎病毒的临床血清样本（已灭活）。

本试剂盒通过检测内标来监测样本中是否有PCR抑制物，避免假阴性。

【主要组成成分】丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒（PCR–荧光探针法）序号产品组成主要成分规格与装量RLB 核酸提取试剂HCV裂解液（含磁珠）氢氧化钠、氯化钾、Tris碱、构象磁珠7.5ml×1瓶RWB HCV漂洗液氯化钾、乙酸钠25.0ml×1瓶1 PCR扩增试剂HCV RT-PCR 反应液引物、探针、脱氧核糖核苷三磷酸、镁离子0.95ml×2管2 HCV酶混合液M-MLV逆转录酶、DNA聚合酶100μl×1管3校准品HCV校准品①（1.0～3.0）×106IU/ml 定值HCV阳性血清样本（已灭活）0.35 ml×1管4 HCV校准品②（1.0～3.0）×105IU/ml 定值HCV阳性血清样本（已灭活）0.35 ml×1管5 HCV校准品③（1.0～3.0）×104IU/ml 定值HCV阳性血清样本（已灭活）0.35 ml×1管6 HCV校准品④（1.0～3.0）×103IU/ml 定值HCV阳性血清样本（已灭活）0.35 ml×1管7质控品HCV强阳性质控品（0.5～5.0）×104IU/ml HCV阳性混合血清样本（已灭活）0.35 ml×1管8 HCV弱阳性质控品（100～700）IU/ml HCV阳性混合血清样本（已灭活）0.35 ml×1管9 HCV 阴性质控品HCV阴性混合血清样本（已灭活）0.35 ml×1管10 内标HCV内标内标核酸模板60μl×1管备注：a.校准品①～④的参数和强阳、弱阳性质控品的定值存在批间差异（均在以上范围内）。

沙眼衣原体荧光PCR试剂盒的研制及临床考核

ＡｓａｔＯｂｅｔｅｂｔｃ：【ｊｃｉ】ＵｓｅＦＰＩｔｏｏｄｖｌｈａｄｒｃｏｔＣＴｉｇｏｔｉｎｅｔｉｔｒｕｈｒｖｅａｎｗ＿（ｍｅｈｄｔｅｅｐａｃｌｍｙｉｔｈｍａｉＲｏａａｓ（）ｄａｎｓｉｋｔｄｔｈｏｇｃ，ａｓｔｃｎｃｌｒｌｎｍｐｒｔｔｅｉｎｔｔｏｓＭｅｈｄｌｉｉｄｃａｅｉｗｉｏｈｒｄａｏｉｍｅｈｄ．【ｔｏ】Ａｌｉｌｄｇｏｔｉｆｒｉａｔａａｏｔｈｇｓｃｃｎｃｉｎｉｌｔｏｉａａｓｃ【ｖａｅｅｐｄｗｔ — ＣｄｓｄｖｌｅｈＦＰＲ．ｏｉ
聚合酶链式反应（ｏｙｒｓｈｉｅｃｉｎｐｌｍｅａｅｃａｎｒａｔ，ｏＰＲ）Ｃ已广泛用于核酸分析，传学测试和临床检遗测，有灵敏、速、确、便等特点。不足之处具迅准方主要可归结为：由于采用电泳检测，引起ＰＲ产易Ｃ物的交叉污染，假阳性结果；色剂溴乙锭是强有染烈致癌物，能危害操作人员及污染环境。荧光可ＰＲ方法（ｕｒｓｅｃＣＣｌｆｏｅｃｎｅＰＲ，ＦＰＲ）１采用荧光 —Ｃ［－技术和闭管检测，有抗交叉污染性强、量准确、具定自动化分析、作简便和安全无害等优点，一种操是先进的分子定量检测技术，全克服了前述常规完

检测中心荧光定量PCR检测试剂盒验收细则

检测中心荧光定量PCR检测试剂盒验收细则一、引言荧光定量聚合酶链反应（PCR）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于医学、生物学和农业等领域。

在检测中心中，正确使用和验收PCR试剂盒对确保检测结果的准确性和可靠性至关重要。

本细则旨在规范检测中心对PCR试剂盒的验收工作。

二、验收前的准备工作1.阅读试剂盒说明书，了解试剂盒的基本信息、存储条件和使用方法。

2.确保试剂盒未过期，检查试剂盒上的生产日期和有效期限。

三、试剂盒物品清点1.打开试剂盒包装，对照说明书上的清单，确认试剂盒所含物品是否齐全。

2.检查试剂盒内的试剂、标准品和控制品的外观是否正常，如颜色、透明度、凝聚物等。

3.检查试剂盒内的试剂、标准品和控制品的容量是否符合标注要求，比较标贴上的容量和体积。

四、试剂盒存储条件和有效期检查1.检查试剂盒包装上的存储条件是否符合实验室的存储环境。

2.检查试剂盒上的有效期是否仍在有效期范围内，避免使用过期试剂进行实验。

五、试剂试验1.使用空白样品（无样本）进行试剂试验，检查试剂盒的表现如何。

2.检查试剂盒的放大效果，使用适当的阳性对照进行检测，并与实验室标准结果进行比对。

六、数据分析1.将试剂盒试验结果录入实验数据管理系统，并与试剂盒说明书和实验室标准结果进行比对。

2.检查试剂盒试验结果的准确性和可靠性，评估试剂盒在实验室中的适应性和性能。

七、实验记录1.记录试剂盒的验收日期、试验结果和验收结论。

2.如有问题或异常情况，记录并及时向上级主管报告。

八、试剂盒处置1.将已经使用完毕的试剂盒及时处理，按照实验室的废弃物管理规定进行处置。

2.未使用的试剂盒按照包装说明妥善保存，避免存放环境受潮、暴露于阳光直射等不良条件。

九、验收报告1.编写试剂盒验收报告，包括试剂盒信息、试验结果和验收结论等内容。

2.将验收报告归档并交由实验室主管保存。

总结：以上是对检测中心荧光定量PCR检测试剂盒的验收细则进行规范的一份详细说明。

临床_PCR_实验室质量管理体系的建立

临床PCR实验室质量管理体系的建立卫生部临床检验中心李金明《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）是到目前为止卫生部针对一项检验技术的临床应用管理下发的第一个法规性文件，要求临床PCR实验室，不但在实验室设置及仪器设备等硬件上要满足开展临床检验的条件，而且要求实验室在日常工作要有文件化的工作程序。

对于临床实验室来说，这是从来没有过的。

我们的检验科多少年来遵循的都是一种固定的经验管理模式，对日常检验工作，通常缺乏一个文件化的程序，只是购买到商品试剂盒以后，按照试剂盒的说明书去进行检验，对试剂盒本身也缺乏相应的质检，日常检验基本上是完成即可，至于完成的质量怎么样，心中无数，只能从临床大夫和患者投诉的多少来做判断。

做得好一点的检验科，还多少有一点室内质控，或是参加了室间质评，做得差的，很多检验项目根本就没有室内质控。

但近年来，随着临床实验室质量保证的概念逐步地进入我们的临床检验实践，我国临床检验正进入到一个规范化和标准化的时代，尤其是临床PCR实验室，起到了一个很好的领头和示范作用。

在全国，一大批从事临床PCR检验的专家和同道，在他们的日常工作和申请实验室验收过程中，总结经验，建立了不但在形式而且在实质上符合当今实验室质量管理模式的临床PCR实验室。

本处的许多叙述，有本人的一些体会和理解，但很多的概念应该说是来自于我们全国各实验室的同行们实际工作经验的启发。

一、实验室质量管理概述实验室质量管理是说起来容易，做起来难。

要说吧，其基本内容也就四句话，就是写你所应做的，做你所写的，记录你已做的和分析你已做的。

所谓写你所应做的，就是将在实验室检测中要做的事以文件化的形式表述出来，形成一个实验室的质量管理文件，通常包括质量手册、质量体系程序文件和标准操作程序（SOP）等。

质量手册的基本定义是：阐明一个实验室的质量方针，并描述其质量体系的文件。

其主要内容包括目录、批准页、前言、质量方针、组织结构、人员职责、实验室设施环境、仪器设备、溯源性、检验方法、标本管理、记录、报告等，是对上述各方面质量管理的一般性描述。

pcr质控介绍

通常质控规则以符号AL来表示，其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用均值或均值±1～3SD来表示。当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失控。
常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值±3s，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值±3s范围，即可将该批测定判为失控。
根据泊松分布的概率计算
在血液筛查检测中，许多实验室或检测项目如 HCV RNA 、CT、结核杆菌、淋球菌的阳性结果率均较低，这时虽然可以使用公式（1）计算概率，但如果标本量很大，使用泊松分布来估计二项式分布是一种更为简便的方法。。根据泊松分布，可使用下式计算概率： P(X=k) =(np)ke-np/k! (2) P(X=k)5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳性标本在查清原因后重做。
在增加一倍阴性质控样本的情况下重新检测。
可能的几种失控表现

曲线向上漂移：提示出现污染，污染可能是由于某一天操作上的失误导致实验室被污染如标本泄漏，产物泄漏，试剂被污染等向上的趋势性变化：可能存在累积性的产物污染，实验室扩增产物逐渐累积，从而使病人结果的阳性率逐渐增高。此时实验室需要进行彻底清洁。
标本间交叉污染的概率计算

如在一次检测100个标本的HBV DNA检测中，所有两个阳性结果连续出现的概率为： P=(100-2+1)/[100!/2!(100-2)!]=99/4950=0.02 概率为2.0%。因此，如在100个标本中，连续出现两个为阳性次数有3次，即概率为3.0%，则为失控。而在一次检测100个标本，所有三个阳性结果连续出现的概率为： P=(100-3+1)/[100!/3!(100-3)!]=98/161700=0.0006 概率为 0.06%。因此，如果如在100个标本中，连续出现三个为阳性次数有1次，即概率为1.0%，为失控。

如何选择PCR试剂和试剂盒

PCR试剂和试剂盒PCR即聚合酶链式反应，几乎是每个分子生物学实验室的支柱技术。

这种方法简单、易用，可将DNA特定片段扩增几个数量级。

我们针对各种PCR、qPCR和RT-PCR应用提供贯穿整个PCR流程的专用试剂盒。

此外，我们还提供全面的PCR相关资源，包括PCR标准实验方案和PCR预混液计算工具。

热启动PCR热启动PCR技术可在反应构建过程中抑制热启动Taq聚合酶活性或修饰dNTP聚合，直至热激活步骤启动。

热启动PCR允许室温构建反应，不会出现非特异性扩增和引物二聚体形成。

浏览我们丰富的热启动PCR酶选择，包括KOD、FastStart™、JumpStart™和AptaTaq。

更多有关热启动PCR、产品和实验方案的信息，请访问默克sigma-aldrich ®的PCR选择指南，并根据您的研究需要选择对应的产品。

罗氏PCR、QPCR、RT-PCR和RT-QPCR试剂、实验方案和资源为推动分子生物学研究进展，必须最大限度提高基因组学、蛋白质组学和细胞分析等多个领域的工作流程效率。

作为基因组学和PCR技术的开创者，罗氏提供经反复优化的齐全试剂和试剂盒产品，减少实验室实操时间、加快数据采集和关键工具开发，可针对最复杂的生物学假设开展检验。

我们秉持共同的产品质量追求和科学卓越理念与罗氏建立合作关系——可应您的研究所需，全程提供罗氏产品解决方案。

访问罗氏产品和分子学解决方案资源页面，浏览所有罗氏PCR相关试剂盒和实验方案。

定量PCR(QPCR)试剂定量PCR(qPCR)利用DNA扩增的线性原理，测定样品中已知序列的绝对或相对量。

此类反应使用荧光报告基团，可以实时测定DNA产量。

qPCR会监测每个PCR循环中的DNA扩增。

当DNA处于对数线性扩增阶段时，荧光量相对于背景增加。

荧光积累至可测的那一点称为阈值循环(CT)或交叉点。

通过使用已知量的标准DNA的多次稀释，可以产生对比CT的对数浓度的标准曲线。

新型冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒性能验证

· 医学诊疗技术 ·1452020年　第24期自2019年底新型冠状病毒爆发以来，各地积极响应政府号召，在不断增强各地防护措施的同时，增加对于新型冠状病毒的认知[1]。

在临床检验诊断中实时荧光定量PCR 检测核酸更是目前已知的检测新型冠状病毒最为准确、广泛的方法[2]。

本实验室选用高灵敏度的湖南圣湘生物有限公司提供的检测试剂盒，在最低200拷贝浓度时即可检出病毒，因此对于检测试剂盒的性能质量，显得尤为重要。

1　材料和方法1.1检测样本：所有阳性样本和阴性样本均采用试剂盒配套的阳性对照和阴性对照（批号：2020129）1.1.1试剂：湖南圣湘生物生产的2019新型冠状病毒2019-nCoV 核酸检测试剂盒（荧光PCR 法），检测扩增试剂批号：2020129；仪器：扩增仪-ABI QuantStudio5；1.2操作程序：将PCR 反应管放入扩增仪样品槽。

荧光检测通道选择：选择FAM 和ROX 通道检测2019-nCoV 病毒核酸；选择HEX 通道检测内标。

推荐的循环参数设定如下表1：表1　推荐的循环参数设定步骤温度时间循环数1逆转录50℃30分钟12cDNA 预变性95℃1分钟13变性95℃15秒45退火，延伸及荧光采集60℃30秒4仪器冷却25℃10秒11.3结果曲线判定标准：（1）ORF 与N 基因为典型的S 型扩增曲线，且Ct ≤40的样本，报告为病毒阳性；（2）ORF 与N 基因未检测到典型的S 型扩增曲线，或Ct ＞40，内标有扩增曲线，且Ct ≤40的样本，报告为病毒阴性；（3）对于三通道均未检测到典型的S 型扩增曲线（No Ct），或Ct ＞40，该样本的检测结果无效。

1.4性能验证及提取仪适配性评估方法及指标1.4.1精密度：用模拟阳性样本和阴性样本。

分5天检测，每次4个复孔，计算每通道的符合率及CV 值，要求CV 值≤5%。

1.4.2最低检出限：用已知浓度的模拟阳性标本，通过倍比稀释的方法，复孔实验，直至无法检测出阳性基因为止，要求最低检测限满足200copies/ml。

pcr 鉴定菌种试剂盒原理

聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的技术，用于放大特定的DNA序列。

PCR是一种强大的工具，用于鉴定和表征微生物种类，并且广泛用于微生物诊断和研究。

PCR的一个关键应用是鉴定细菌和真菌物种。

基于PCR的鉴定涉及使用特定引物，这些引物靶向微生物基因组的保守区域，从而使特定物种的DNA序列得到放大。

这使得可以直接从各种样本（如临床标本、环境样本和食品产品）中检测和鉴定微生物。

执行PCR-based鉴定微生物物种时，通常使用专门的试剂盒和试剂。

这些试剂盒通常包含PCR的所有必需成分，包括DNA聚合酶、核苷酸、缓冲液和特定于目标微生物物种的引物。

选择适当的PCR试剂盒对于成功鉴定微生物物种至关重要，因为它确保了PCR反应的特异性和灵敏性。

基于PCR的微生物物种鉴定的原理涉及几个关键步骤。

从样本中提取DNA并纯化以去除可能干扰PCR反应的杂质和抑制剂。

然后将纯化后的DNA用作PCR反应的模板，PCR反应包括多个循环的DNA变性、引物结合和DNA延伸。

这样会放大与感兴趣的微生物物种特异性的目标DNA序列。

PCR-based鉴定微生物物种应用的一个例子是在传染病诊断中。

在临床微生物学中，广泛使用PCR快速准确地检测病原微生物，包括细菌、病毒和真菌，从患者样本中。

基于PCR的鉴定可为临床医生提供有价值的信息，以便及时和有针对性地治疗传染病，从而改善患者的预后。

除了临床诊断，基于PCR的微生物物种鉴定还用于环境微生物学，用于监测和监测各种生态系统中的微生物裙落。

通过鉴定和表征环境样本中存在的微生物物种，研究人员可以深入了解微生物裙落的多样性和功能，以及它们与环境的相互作用。

基于PCR的微生物物种鉴定是一种强大而多功能的工具，在微生物学中应用广泛。

具体试剂盒和试剂的使用，结合PCR的原理，可以准确和敏感地从各种样本中鉴定细菌和真菌物种。

无论在临床诊断、环境监测还是研究中，基于PCR的鉴定在推动我们对微生物多样性及其对人类健康和环境的影响的理解方面起着至关重要的作用。

临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法

过晚都可能会出现假阴性结果）
标本采集部位的准备（适度消毒）标本的类型和采集量（衣原体上皮细胞）采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）

采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂）标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院陈文学
检验误差的发生率

1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期，而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%

试剂准备 ①裂解液：50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 ②玻璃珠：（直径：425-600um）
乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清脂质和沉淀用750ul裂解液重悬重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌煮沸5min，离心14000rpm，3min 650ul上清转移到另一离心管中，等体积异丙醇沉淀
IgG
IgG的抑制作用是由于其与单链DNA
的相互作用，使得靶DNA不能与DNA 聚合酶相互作用
使用煮沸作为标本处理方法或使用
PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反应的抑制
去除或减轻抑制的一些方法
NaOH处理可中和临床标本中的Taq
DNA聚合酶抑制剂，但这种方法不适用于DNA含量低的标本，因为NaOH处理可使DNA大量丢失。

PCR荧光检测试剂盒生产质控规程完整

PCR荧光检测试剂盒生产质量控制规程一. 微量加样器的使用规定1．微量加样器校正：: 使用微量加样器吸10μl 10次是否为100μl。

2．加样前吸头润湿：当吸头排空时，仍会有一些残留的液体以薄膜的形式吸附在吸头里面，所以，在加样时先吸打液体数次，充分润湿吸头管腔,以保证加样的一致性。

3．加样时吸头应靠试管壁：加样时吸头的液体顺着管壁流出，防止液滴的形成由于其表面张力的作用而阻止样本的释放。

4．吸头是否与加样器上吸头套筒密封：样器上吸头与套筒密封完好。

5．加样时注意第一停点和第二停点：吸液是应注意大拇指按下按钮至第一停点，缓慢慢慢吸入液体。

停留1s，然后将吸头提离液面。

用吸纸抹去吸嘴外面可能黏附的液滴。

放液时经过第一停点，停1-2s后，继续按压到第二停点，排出残余液体。

6．PCR反应原液由于有甘油在冷的状态较黏稠,易于1次吸取数人份，慢一些。

7．边加边看,直观估计,防止跳管。

8．低温冷藏批量DNA提取液、PCR反应液A和B取出时是否充分混匀后,分装使用，PCR反应液A和B是否避光低温冷藏和使用。

9．配PCR反应液应先加缓冲液再加PCR反应液充分混匀,必要时倒置混匀,再离心,或用灭菌吸头上下吸几次。

10．PCR反应液（包括样品）应充分混匀:保证PCR反应曲线呈S形，全阴性样品呈近似水平曲线。

二．PCR试验操作规程**血清稀释液：全阴性血清再加2倍HBV DNA提取液混匀, 5000rpm，离心1分钟，混匀血清98℃ 5分钟变性,12000rpm，离心10分钟,吸取上清液。

三.超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作规程1.目的建立一个超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作程序，使操作过程标2.职责质量部QC负责本文件的起草，质量部及QC检验人员负责本标准的实施。

3.范围本标准适用于超净工作台的使用、维护和保养与清洁。

4.内容4.1超净工作台的主要组成部分：高效过滤器、中效过滤器、通风机、电气控制及排气管道部分。

pcr试剂盒生产工艺

pcr试剂盒生产工艺PCR试剂盒是用于聚合酶链反应（PCR）的试剂，其中包含PCR反应所需的各种材料和试剂。

现今PCR试剂盒常见的产品包括PCR Master Mix、PCR标准物质、PCR探针、PCR酶、模板DNA等。

以下将介绍PCR试剂盒的生产工艺。

1. 原材料准备：根据产品的需求，准备PCR试剂盒所需的原材料，包括PCR反应条件中的缓冲液、dNTPs、MgCl2等，以及其他辅助试剂如PCR酶、探针等。

同时，检查原材料是否符合要求，如检测dNTPs的纯度、PCR酶的活性等。

2. 缓冲液配制：将所需的缓冲液配制好，一般采用称量法或浓度法进行配制，并严格控制缓冲液的pH值和溶液浓度。

在配制过程中需要注意杂质的混入，因此需要使用纯净的试剂和洁净的容器。

3. PCR酶生产：PCR试剂盒中最关键的部分是PCR酶。

PCR酶一般是通过基因工程技术从热稳定酶的产生菌株中得到，然后经过清除杂质、纯化和浓缩等步骤得到纯净的PCR酶。

生产过程中需要注意PCR酶的保存条件和使用条件，以确保酶的活性和稳定性。

4. 校正反应条件：根据产品要求，进行PCR反应条件的确定和校正。

这包括PCR反应的温度、时间、循环次数等参数的优化，并通过实验进行验证。

如需添加PCR探针，则需要进行探针的序列设计和验证，以及PCR反应条件的优化和验证。

5. 产品包装：将生产好的PCR试剂盒进行包装，一般采用密封袋或密封管进行包装。

在包装过程中需要注意卫生和无菌条件，以确保产品的质量和稳定性。

6. 质量控制：对生产好的PCR试剂盒进行质量控制，包括外观检查、产品标签检查、产品成分和浓度检查等。

同时进行PCR反应的性能验证，如PCR的灵敏度、特异性等，以确保产品质量符合要求。

7. 产品存储和运输：将生产好的PCR试剂盒进行适当的存储和运输。

一般来说，PCR试剂盒需要存放在低温条件下，避免光照和震动。

在运输过程中，需要采取适当的包装和保护措施，以避免产品的损坏和污染。

临床聚合酶链反应试剂盒的选用和质检

PCR或RT-PCR试剂盒得组成
●核酸提取试剂 ●核酸扩增或反转录－核酸扩增试剂 ●产物检测试剂
影响PCR试剂盒质量得因素
●标本处理(核酸提取)方法、用于核酸扩增得原材料及方法学设计
●运输和贮存中所存在得问题
核酸提取方法
●经典方法:酚－氯仿抽提法,提取效率高、纯度好, 但过程繁琐,易增加标本间相互污染得机会
●简便方法:煮沸裂解法、玻璃粉或硅吸附法等核酸提取除了要求操作简便外,更重要得就是提取得效率及纯度,因此煮沸裂解法已被核酸纯化方法替代。
ห้องสมุดไป่ตู้酸提取得效率及纯度得检测
使用已知阳性(包括病毒含量)得溶血和脂血血清标本,用试剂盒提供得标本处理方法提取核酸后扩增检测,与无溶血和脂血得血清标本比较,观察测定结果得差异,从而判断提取方法得优劣。
扩增缓冲液和dNTP
●缓冲液包括:Tris-HCL(pH8、3~8、8),KCl或 NaCl ,酶保护剂如小牛血清蛋白、明胶、Tween20或 DTT ● Mg2+ ,过高或过低镁离子浓度均不利于扩增 ●四种dNTP得终浓度应相等
Taq酶以及反转录酶
●酶浓度太高,则会出现非特异扩增;过低时,则靶序列产量很低。
●试剂盒测定性能得检验(采用“血清盘”进行 )
●血清盘就是由一定数量得原血清阴阳性样本、以及3-5份系列稀释阳性样本所组成
●原血清样本可用于判断PCR试剂盒对特定病原体核酸检出得特异性、灵敏度和符合率;系列稀释阳性样本用于判断试剂得测定下限
质检时,用待检PCR试剂盒测定血清盘中得各份样本,以血清盘得结果为标准,计算被检PCR试剂盒得灵敏度、特异性和符合率。
●有效期:在适当得贮存温度下,PCR试剂盒得一般为 6个月

曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒 (PCR 荧光探针法)说明书

曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）说明书【产品名称】通用名称：曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）【包装规格】24人份/盒，48人份/盒【预期用途】本试剂盒用于体外定性检测人痰液样本中曲霉菌属、新型隐球菌和耶氏肺孢子菌的核酸DNA。

本试剂用于肺部曲霉菌属、新型隐球菌和耶氏肺孢子菌真菌感染的辅助诊断，不能单独作为确诊的依据。

适用人群主要为免疫低下、免疫缺陷人群，其他人群应有肺部真菌感染相关指征。

真菌感染常见于免疫低下或缺陷人群，具有较高的发病率和死亡率，其临床症状表现不具有特异性，易被细菌、病毒等感染掩盖，临床上致病菌包括曲霉菌属、隐球菌、耶氏肺孢子菌等，检测多重真菌可用于辅助临床诊断。

本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状、体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

该产品检测阳性不能确定标本中有活病原菌，检测结果应结合其他临床诊断综合判断。

本产品对于曲霉菌属的检测不能确认具体菌种，如有必要临床应考虑对于曲霉菌属阳性结果进一步确认感染的菌种。

【检验原理】本试剂盒分别选取曲霉菌属18s rRNA基因、新型隐球菌ITS基因和耶氏肺孢子菌mtLSUrRNA基因中保守的区域设计特异性引物和探针，在样本DNA核酸纯化之后采用荧光PCR对DNA进行检测。

本试剂盒采用实时荧光定量PCR技术，PCR扩增过程中，探针与模板结合，其5’端报告基团被Taq酶5’→3’外切核酸酶活性切断，使报告基团远离淬灭基团，产生荧光信号。

荧光定量PCR仪器根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，并计算出样本Ct值（每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）。

曲霉菌属、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌荧光标记分别为FAM、VIC、CY5。

本试剂盒反应体系含有dUTP-UDG防污染措施，避免操作产生的假阳性结果；采用内源性内标质控体系，通过内标对待测样本的采集、运输和提取过程进行监控，避免检测结果的假阴性，内标基因选择人源管家基因RP，荧光标记为ROX。

临床基因扩增PCR实验室SOP标准操作程序文件(32项)

临床基因扩增实验室标准操作程序编写人：审核人：批准人：启用日期：年月日XXX医院前言为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检验质量，严格按照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》要求，制定本实验室管理文件，本实验室任何实验均需遵循本管理文件中规定执行。

临床基因扩增检验技术指以临床诊断治疗为目的，以扩增检测DNA或RNA 为方法的检测技术，快速、可靠、准确、安全、收费合理方式下，以规范的操作对临床标本进行分析。

本室采用经国家药品监督管理局批准的试剂盒。

开展的检测项目：1、乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测2、人巨细胞病毒（HCMV）核酸定量检测标准操作程序文件1.目的：为了分子实验室的规范管理，特制订本程序。

2.范围：分子实验室。

3.职责：3.1临床PCR检验实验室工作人员共同遵守、相互督促。

3.2因科研活动需要，进入实验区域（试剂准备区、样本准备区、PCR扩增区）的非本室人员需首先熟悉本程序的各项规定并严格遵守执行。

4.实验室设置：4.1实验室设计为：专用走廊、试剂准备区、样本制备区、PCR扩增区组成。

三个区域各有一个缓冲间。

（见设置图）4.2三个工作区各配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服，并有明显的区分标识。

试剂准备区—白色、样品处理区—兰色、基因扩增区—红色。

4.3工作区的配置、功能、内务管理制度见各工作区文件。

4.4 实验室须严格遵守试剂区→样本区→扩增区的流向制度，严禁误入和逆进入各工作区。

4.5实验室流程：1）PCR室工作人员上班后，由过道走廊→试剂区→样本区→扩增区流向，打开排风、光源、温控装置。

2）标本接收区接收标本、验收登记后离心（不开盖），由内走廊入口将标本送入标本制备区缓冲间（标本制备区内门关闭）。

3）PCR工作人员按从试剂区→样本区→扩增区更衣开始流水操作。

临床PCR试剂盒的选用和质检

检测方法
本章包括三条。标准操作程序（SOP）：仪器设备
操作和校准程序；标本收集处理程序；扩增检测工作程序；仪器试剂的选购和质检程序；消耗性材料的购买、验收、质检和贮存程序。 SOP应现行有效及便于使用。
标本管理
本章包括五条。建立唯一编号识别系统，避免标本混淆；标本采集、运送和保存程序；标本接收时的状态记录；标本的适用性和充分性；标本贮存的标准操作程序及贮存温度控制措施; 标本接收及安全处置程序；维护实验室诚实性的必要措施。
核酸扩增方法
PCR RT－PCR 转录依赖的扩增（TMA）连接酶链反应（LCR）链替代扩增（SDA）等
影响PCR试剂盒质量的因素：核酸提取
核酸提取的有效性核酸提取的简便性
影响PCR试剂盒质量的因素：产物检测
杂交固相
特异探针及其标记物
影响PCR试剂盒质量的因素
以拷贝数/ml或IU/ ml报告；避免二者之间的混淆；每份报告应包括以下信息：标题、唯一标识、检测标本说明、标本特性和状态、标本接收日期和检测日期、检测方法、检测和校核人员签字及发出日期、参考结果或范围；如对报告有效性有疑问，实验室应立即通知临床相关科室予以改正的程序；有报告的发放程序：用电话、传真、电子邮件报
技术验收的其它内容
就有关实验室质量管理方面与具体工作有关的内容进行口试和/ 或笔试；
已知HBV DNA和/或HCV RNA 血清盘的实际检测和结果报告。
谢谢!
是否有污染。
结合特异性（浓度）
dNTP和缓冲液
dNTP（包括dATP 、dCTP、 dGTP和 dTTP或 dUTP）的浓度

PCR质量控制2012.3

维护保养：75%乙醇擦拭校准：转速、温度
耗材、试剂
耗材带滤芯吸头、离心管爆管和抑制物质检试剂盒的质检包括外观质检和性能质检选择或更换试剂品牌：试剂性能评估更换试剂批号：评价核酸提取效率和扩增效率
更换试剂批号质检
设置空白对照、阴性对照、低值阳性对照试剂不合格 1)低值阳性对照和标准品均未检出，或低值阳性对照未检出而标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。 2)低值阳性对照未检出，标准品检测正常，提示样品提取液存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。 3) 阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。 4)低值阳性对照检出，标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT值偏大5个循环以上，提示阳性标准品存在问题。
使用玻璃器皿，必须为密闭的、必须经高压灭菌，以使可能存在的RNase永久性失活。
标本验收、拒收
血液标本：溶血、严重脂血等应拒收泌尿生殖道分泌物：镜下观察到上皮细胞存在。痰液：镜下观察上皮细胞很少，一般<10个，白细胞一般>25个。
标本运送
实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条件（温度、时间）作出相应规定。靶核酸为DNA的标本，如在无菌条件下，则可以在室温下运送，建议采集后8h之内送至实验室；靶核酸为RNA的标本，如在无菌条件下，可在室温下运送，如为较长时间，则应在加冰条件下运送，建议采集后4h之内送至实验室；所有标本采集后送至实验室之前，所有临床标本在采集后送至实验室前，均应放2－8℃临时保存。淋病奈瑟菌有自溶的特性，标本采集后应立即送检。
-2S
-3S
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
4） R4S 在同一批中两个控制结果差超出4S范围，其中有一个超出了+2S限值，另一个超出了2S 限值。或其中一个超出了＋1.5S，另一个超出了－2.5S限值属随机误差过大，为失控。