临床PCR试剂盒的选用和质检讲解
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核酸提取的有效性 核酸提取的简便性
影响PCR试剂盒质量的因素： 产物检测
杂交固相 特异探针及其标记物
影响PCR试剂盒质量的因素
内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法 学设计 外在因素：试剂盒的运输和贮存外在因 素：试剂盒的运输和贮存
试剂盒的运输和贮存
PCR试剂盒的有效期一般为6个月，这是 指在适当的贮存温度下。核酸扩增部分 的试剂一般要贮存于-20℃下；产物检测 部分试剂则贮存于2～8℃。 试剂盒从厂家到用户手中，均要经历运 输及运输中的贮存，任一环节的不当， 均会影响试剂盒的临床使用质量。
PCR试剂盒的分类
定性测定：PCR-ELISA、PCR-膜上杂交 （杂交梳）、荧光PCR（分子信标和Taq Man等） 定量测定： PCR-ELISA 、Taq Man和 Amplisensor荧光定量、 Amplicor PCRELISA定量等。
PCR试剂盒的选用原则
参考试剂生产厂家的信息广告 参考同行对有关试剂盒的使用效果 参考有关机构的综合评价 根据使用目的 根据所在实验室的技术特点 根据所在医院患者的承受能力
影响PCR试剂盒质量的因素： 扩增所需的原 材料
寡核苷酸引物和探针 缓冲液和dNTP
聚合酶、逆转录酶等
PCR反应混合物
Mg Mn
2+
和 或
Taq DNA 多 聚 酶 rTth DNA 多 聚 酶 AmpEras e 生物素标记的引 物
2+
和
dCT P dGT P dUT P dATP
寡核苷酸引物和探针
临床PCR试剂盒的选用和质检
卫生部临床检验中心 李金明
PCR或RT-PCR试剂盒的组成
核酸提取试剂
核酸扩增或逆转录-核酸扩增试剂
产物检测试剂（有些使用全自动分析仪 的PCR方法因其核酸扩增和检测同时完成， 故无专门的产物检测试剂）
影响PCR试剂盒质量的因素
内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法 学设计
PCR试剂盒的质检
外包装：厂家名称、检测目的、批准文 号、批号和有效期等。
内包装：试剂瓶是否漏液、真空包装是 否破损以、试剂是否齐全以及是否有使 用说明书等。
PCR试剂盒的质检
Baidu Nhomakorabea
采用血清（样本）盘（Panel）质检： PCR 试剂血清（样本）盘由一定数量的原血清阴、 阳性样本、2～3份纯化核酸（DNA或RNA或 cDNA）样本以及3～5份系列稀释阳性样本所 组成。样本总数可定在20份左右。 原血清样本用于判断试剂盒对特定病原体核酸 检出的特异性、灵敏度和符合率；纯化核酸样 本用于判断DNA扩增或逆转录及DNA扩增的 有效性；系列稀释阳性样本用于判断试剂的测 定下限。
缓冲液：在储存和扩增循环中稳定、作 为聚合酶活性所必须的Mg＋＋（或用于 rTth的Mn＋＋）的浓度以及pH等
逆转录酶、DNA聚合酶
酶的浓度 酶的活性
核酸扩增方法
PCR RT－PCR 转录依赖的扩增（TMA） 连接酶链反应（LCR） 链替代扩增（SDA）等
影响PCR试剂盒质量的因素： 核酸提取
谢 谢!
其对试剂盒质量的影响首先是纯度。纯 度的判断可根据260/280吸光度比值来判 断，如‹2.0，则需重新纯化。另一种方法 是将其在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，如出 现一条以上的带或迁移位置错误，则需 重新纯化。 是否有污染。 结合特异性（浓度）
dNTP和缓冲液
dNTP（包括dATP 、dCTP、 dGTP和 dTTP或 dUTP）的浓度
试剂特异性、灵敏度和符合率 计 算 公 式
血清盘结果 ＋
待检试剂盒 结果＋
血清盘结果 － b d b+d
合 计 a+b c+d a+b+c+d
a c a+c
待检试剂盒 结果－ 合 计
试剂特异性、灵敏度和符合率 计 算 公 式
灵敏度（％）＝ (a / a+c)100% 特异性（％）＝ (d/b+d) 100% 符合率（％）＝ (a+d/a+b+c+d) 100%
影响PCR试剂盒质量的因素： 产物检测
杂交固相 特异探针及其标记物
影响PCR试剂盒质量的因素
内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法 学设计 外在因素：试剂盒的运输和贮存外在因 素：试剂盒的运输和贮存
试剂盒的运输和贮存
PCR试剂盒的有效期一般为6个月，这是 指在适当的贮存温度下。核酸扩增部分 的试剂一般要贮存于-20℃下；产物检测 部分试剂则贮存于2～8℃。 试剂盒从厂家到用户手中，均要经历运 输及运输中的贮存，任一环节的不当， 均会影响试剂盒的临床使用质量。
PCR试剂盒的分类
定性测定：PCR-ELISA、PCR-膜上杂交 （杂交梳）、荧光PCR（分子信标和Taq Man等） 定量测定： PCR-ELISA 、Taq Man和 Amplisensor荧光定量、 Amplicor PCRELISA定量等。
PCR试剂盒的选用原则
参考试剂生产厂家的信息广告 参考同行对有关试剂盒的使用效果 参考有关机构的综合评价 根据使用目的 根据所在实验室的技术特点 根据所在医院患者的承受能力
影响PCR试剂盒质量的因素： 扩增所需的原 材料
寡核苷酸引物和探针 缓冲液和dNTP
聚合酶、逆转录酶等
PCR反应混合物
Mg Mn
2+
和 或
Taq DNA 多 聚 酶 rTth DNA 多 聚 酶 AmpEras e 生物素标记的引 物
2+
和
dCT P dGT P dUT P dATP
寡核苷酸引物和探针
临床PCR试剂盒的选用和质检
卫生部临床检验中心 李金明
PCR或RT-PCR试剂盒的组成
核酸提取试剂
核酸扩增或逆转录-核酸扩增试剂
产物检测试剂（有些使用全自动分析仪 的PCR方法因其核酸扩增和检测同时完成， 故无专门的产物检测试剂）
影响PCR试剂盒质量的因素
内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法 学设计
PCR试剂盒的质检
外包装：厂家名称、检测目的、批准文 号、批号和有效期等。
内包装：试剂瓶是否漏液、真空包装是 否破损以、试剂是否齐全以及是否有使 用说明书等。
PCR试剂盒的质检
Baidu Nhomakorabea
采用血清（样本）盘（Panel）质检： PCR 试剂血清（样本）盘由一定数量的原血清阴、 阳性样本、2～3份纯化核酸（DNA或RNA或 cDNA）样本以及3～5份系列稀释阳性样本所 组成。样本总数可定在20份左右。 原血清样本用于判断试剂盒对特定病原体核酸 检出的特异性、灵敏度和符合率；纯化核酸样 本用于判断DNA扩增或逆转录及DNA扩增的 有效性；系列稀释阳性样本用于判断试剂的测 定下限。
缓冲液：在储存和扩增循环中稳定、作 为聚合酶活性所必须的Mg＋＋（或用于 rTth的Mn＋＋）的浓度以及pH等
逆转录酶、DNA聚合酶
酶的浓度 酶的活性
核酸扩增方法
PCR RT－PCR 转录依赖的扩增（TMA） 连接酶链反应（LCR） 链替代扩增（SDA）等
影响PCR试剂盒质量的因素： 核酸提取
谢 谢!
其对试剂盒质量的影响首先是纯度。纯 度的判断可根据260/280吸光度比值来判 断，如‹2.0，则需重新纯化。另一种方法 是将其在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，如出 现一条以上的带或迁移位置错误，则需 重新纯化。 是否有污染。 结合特异性（浓度）
dNTP和缓冲液
dNTP（包括dATP 、dCTP、 dGTP和 dTTP或 dUTP）的浓度
试剂特异性、灵敏度和符合率 计 算 公 式
血清盘结果 ＋
待检试剂盒 结果＋
血清盘结果 － b d b+d
合 计 a+b c+d a+b+c+d
a c a+c
待检试剂盒 结果－ 合 计
试剂特异性、灵敏度和符合率 计 算 公 式
灵敏度（％）＝ (a / a+c)100% 特异性（％）＝ (d/b+d) 100% 符合率（％）＝ (a+d/a+b+c+d) 100%