外显子组测序
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[3] Wei A H, Zang D J, Zhang Z, et al. Exome sequencing identifies SLC24A5 as a candidate gene for nonsyndromic oculocutaneous albinism[J]. Journal of Investigative Dermatology, 2013, 133(7): 1834-1840.
346: 256-259.
［案例三］ 癌症研究：外显子测序研究局限性肺腺癌瘤内异质性[14] 本研究采用多区域取样分析瘤内异质性的研究思路，对11位患者的局限性肺腺癌的48
个肿瘤样品进行了外显子测序。共鉴定出7269个体突变，其中21个是已知的与癌症相关的 基因突变，76% 的体突变及21个已知癌症基因突变中的20个都可以在同一肿瘤的所有区域 样品中检测到，表明对肿瘤的某一区域进行单次活检，以适当的深度对其测序，可以鉴别 出绝大多数突变。而前期关于肾透明细胞癌的研究结果表明，肿瘤不同区域样品的共有突 变仅占突变总数的31%~37%，说明肿瘤异质性在不同癌种间存在差异。
应用方向
孟德尔疾病研究
马布里综合症[1]：发现致病基因PIGV； 逆向性痤疮[2]：发现致病基因NCSTN； 眼皮肤白化病[3]：发现致病基因SLC24A5； 先天性肾脏和尿道畸形[4]：发现致病基因DSTYK;
复杂疾病研究
混合型低脂血症[5]：发现致病 基因ANGPTL3； 孤独症[6]：发现11 个新生突变 ……
[9] Rudin C M, Durinck S, Stawiski E W, et al. Comprehensive genomic analysis identifies SOX2 as a frequently amplified gene in small-cell lung cancer[J]. Nature Genetics, 2012, 44(10): 1111-1116.
技术参数
样品要求 捕获平台 测序策略 测序深度 项目周期
外显子组测序 样品总量：≥1.0 μg DNA （提取自新鲜及冻存样本）
≥1.5 μg DNA （提取自FFPE样本） 样品浓度：≥20 ng/µl
Agilent SureselectXT Custom Kit
HiSeq PE150
1. 单基因病/复杂疾病有效测序深度50X以上 2. 肿瘤有效测序深度100X以上 注：可根据老师研究目的进行更高深度测序
37天
生物信息分析
1. 数据质控：去除接头污染和低质量数据 2. 与参考序列进行比对、统计测序深度及覆盖度
高级信息分析（单基因病）
1. 突变位点过滤 2. 显/隐性遗传模式分析（需老师提供家系信息）
2.1. 显性遗传模式分析 2.2. 隐性遗传模式分析 3. 候选基因功能注释 4. 基因功能及通路分析 5. 家系连锁分析 6. 纯合子区域（ROH）分析
［案例二］ 复杂疾病研究：外显子测序鉴定肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）的致病 基因[13]
肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS），又称为渐冻症，是一种成年型的神经退行性疾 病。本研究选取了47个父母+患病儿的ALS家系，利用全外显子测序寻找 De novo mutation。 发现了25个de novo突变基因，进行功能聚类分析，锁定了1个与染色质包装、神经树突生 长相关的基因CREST，后期通过细胞试验验证了该基因突变会影响神经元的伸展，证实 CREST突变与ALS相关。
[2] Liu Y, Gao M, Lv YM, et al. Confirmation by exome sequencing of the pathogenic role of NCSTN mutations in acne inversa (hidradenitis suppurativa) [J]. Journal of Investigative Dermatology,2011, 131(7): 1570-1572.
[4] Sanna-Cherchi S, Sampogna R V, Papeta N, et al. Mutations in DSTYK and dominant urinary tract malformations[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 369(7): 621-629.
基本信息分析
3. SNP／InDel检测、注释及统计 4. Somatic SNV／InDel检测、注释及统计（成对样本）
高级信息分析（复杂疾病）
1. 突变位点过滤 2. 显/隐性遗传模式分析（需老师提供家系信息）
2.1. 显性遗传模式分析 2.2. 隐性遗传模式分析 3. 候选基因功能注释 4. 新生突变筛选及分析（成三/成四家系） 4.1. de novo mutation 筛选 4.2. 新生突变速率计算 5. 候选基因功能富集 6. 蛋白互作网络分析（PPI） 7. 基因显著性分析 （推荐20对Case/Control or trios样本）
图1 STAG3 基因结构图 （红色箭头为 STAG3 基因突变位置）
图2 ALS家系图及CREST突变功能验证
图3 产生化疗抗性的个体样本中体突变的数量及频率
参考文献
[1] Krawitz PM, Schweiger MR, Rödelsperger C, et al. Identity-by-descent filtering of exome sequence data identifies PIGV mutations in hyperphosphatasia mental retardation syndrome[J]. Nature Genetics, 2010, 42(10): 827-829.
[6] O'Roak B J, Deriziotis P, Lee C, et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations[J]. Nature genetics, 2011, 43(6): 585-589.
[10] Yi X, Liang Y, Huerta-Sanchez E, et al. Sequencing of 50 human exomes reveals adaptation to high altitude[J]. Science, 2010, 329(5987): 75-78. [11] Tennessen J A, Bigham A W, O’Connor T D, et al. Evolution and functional impact of rare coding variation from deep sequencing of human exomes[J].
[8] Yan X J, Xu J, Gu Z H, et al. Exome sequencing identifies somatic mutations of DNA methyltransferase gene DNMT3A in acute monocytic leukemia[J]. Nature Genetics, 2011, 43(4): 309-315.
[5] Musunuru K, Pirruccello J P, Do R, et al. Exome sequencing, ANGPTL3 mutations, and familial combined hypolipidemia[J]. New England Journal of Medicine, 2010, 363(23): 2220-2227.
遗传因素的影响。这项研究利用外显子测序技术首次在中东家系1（MO1DA）的卵巢早衰 病人中发现了减数分裂基因中的STAG3基因突变可以导致隐性遗传卵巢早衰，也在小鼠动 物模型和卵巢早衰病患中得到了证实。为探索卵巢早衰或卵巢功能不全的发生机理，以及 阐明该病的临床高度异质性和遗传病因复杂性开辟了一个新的研究途径。
外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）是利用探针杂交富集外显子区域的DNA序列，通过高通量测序，发现与蛋白质功能变异相关遗传突
变的技术手段。相比于全基因组测序，外显子组测序更加经济、高效。
技术优势
1. 直接对蛋白编码序列进行测序，找出影响蛋白结构的变异 2. 高深度测序，可发现常见变异及频率低于1%的罕见变异 3. 针对外显子组区域测序，约占基因组的1％，有效降低费用，周期和工作量
[7] Jones S, Wang T L, Shih I M, et al. Frequent mutations of chromatin remodeling gene ARID1A in ovarian clear cell carcinoma[J]. Science, 2010, 330(6001): 228-2ID1A； 白血病[8]：发现致癌基因DNMT3A； 小细胞肺癌[9]：发现致癌基因SOX2 ……
群体研究
藏族人高原适应性研究[10]； 深度解析人类罕见遗传变异[11]；
……
案例解析
［案例一］ 单基因病研究：外显子测序解析卵巢早衰的遗传因素[12] 卵巢早衰通常是指女性40岁之前闭经，1%的妇女患有此病，病因复杂，被认为受到
高级信息分析（癌症）
1. 易感基因筛查 2. NMF突变特征及突变频谱分析 3. 已知驱动基因筛选 4. 高频突变基因统计及通路富集分析 5. MRT高频突变基因相关性分析 6. OncodriveCLUST驱动基因预测 7. 高频CNV分布及重现性分析 8. 肿瘤纯度／倍性分析 9. 异质性／克隆结构分析 10. NovoDrug高频突变基因靶向用药预测 11. NovoDR耐药突变筛选 12. 基因组变异Circos图展示
Science, 2012, 337(6090): 64-69. [12] Caburet S, Arboleda V A, Llano E, et al. Mutant cohesin in premature ovarian failure[J]. New England Journal of Medicine, 2014, 370(10): 943-949. [13] Chesi A, Staahl B T, Jovicic A, et al. Exome sequencing to identify de novo mutations in sporadic ALS trios[J]. Nature Neuroscience, 2013, 16(7): 851-855. [14] Zhang J, Fujimoto J, Zhang J, et al. Intratumor heterogeneity in localized lung adenocarcinomas delineated by multi region sequencing[J]. Science, 2014,
346: 256-259.
［案例三］ 癌症研究：外显子测序研究局限性肺腺癌瘤内异质性[14] 本研究采用多区域取样分析瘤内异质性的研究思路，对11位患者的局限性肺腺癌的48
个肿瘤样品进行了外显子测序。共鉴定出7269个体突变，其中21个是已知的与癌症相关的 基因突变，76% 的体突变及21个已知癌症基因突变中的20个都可以在同一肿瘤的所有区域 样品中检测到，表明对肿瘤的某一区域进行单次活检，以适当的深度对其测序，可以鉴别 出绝大多数突变。而前期关于肾透明细胞癌的研究结果表明，肿瘤不同区域样品的共有突 变仅占突变总数的31%~37%，说明肿瘤异质性在不同癌种间存在差异。
应用方向
孟德尔疾病研究
马布里综合症[1]：发现致病基因PIGV； 逆向性痤疮[2]：发现致病基因NCSTN； 眼皮肤白化病[3]：发现致病基因SLC24A5； 先天性肾脏和尿道畸形[4]：发现致病基因DSTYK;
复杂疾病研究
混合型低脂血症[5]：发现致病 基因ANGPTL3； 孤独症[6]：发现11 个新生突变 ……
[9] Rudin C M, Durinck S, Stawiski E W, et al. Comprehensive genomic analysis identifies SOX2 as a frequently amplified gene in small-cell lung cancer[J]. Nature Genetics, 2012, 44(10): 1111-1116.
技术参数
样品要求 捕获平台 测序策略 测序深度 项目周期
外显子组测序 样品总量：≥1.0 μg DNA （提取自新鲜及冻存样本）
≥1.5 μg DNA （提取自FFPE样本） 样品浓度：≥20 ng/µl
Agilent SureselectXT Custom Kit
HiSeq PE150
1. 单基因病/复杂疾病有效测序深度50X以上 2. 肿瘤有效测序深度100X以上 注：可根据老师研究目的进行更高深度测序
37天
生物信息分析
1. 数据质控：去除接头污染和低质量数据 2. 与参考序列进行比对、统计测序深度及覆盖度
高级信息分析（单基因病）
1. 突变位点过滤 2. 显/隐性遗传模式分析（需老师提供家系信息）
2.1. 显性遗传模式分析 2.2. 隐性遗传模式分析 3. 候选基因功能注释 4. 基因功能及通路分析 5. 家系连锁分析 6. 纯合子区域（ROH）分析
［案例二］ 复杂疾病研究：外显子测序鉴定肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）的致病 基因[13]
肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS），又称为渐冻症，是一种成年型的神经退行性疾 病。本研究选取了47个父母+患病儿的ALS家系，利用全外显子测序寻找 De novo mutation。 发现了25个de novo突变基因，进行功能聚类分析，锁定了1个与染色质包装、神经树突生 长相关的基因CREST，后期通过细胞试验验证了该基因突变会影响神经元的伸展，证实 CREST突变与ALS相关。
[2] Liu Y, Gao M, Lv YM, et al. Confirmation by exome sequencing of the pathogenic role of NCSTN mutations in acne inversa (hidradenitis suppurativa) [J]. Journal of Investigative Dermatology,2011, 131(7): 1570-1572.
[4] Sanna-Cherchi S, Sampogna R V, Papeta N, et al. Mutations in DSTYK and dominant urinary tract malformations[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 369(7): 621-629.
基本信息分析
3. SNP／InDel检测、注释及统计 4. Somatic SNV／InDel检测、注释及统计（成对样本）
高级信息分析（复杂疾病）
1. 突变位点过滤 2. 显/隐性遗传模式分析（需老师提供家系信息）
2.1. 显性遗传模式分析 2.2. 隐性遗传模式分析 3. 候选基因功能注释 4. 新生突变筛选及分析（成三/成四家系） 4.1. de novo mutation 筛选 4.2. 新生突变速率计算 5. 候选基因功能富集 6. 蛋白互作网络分析（PPI） 7. 基因显著性分析 （推荐20对Case/Control or trios样本）
图1 STAG3 基因结构图 （红色箭头为 STAG3 基因突变位置）
图2 ALS家系图及CREST突变功能验证
图3 产生化疗抗性的个体样本中体突变的数量及频率
参考文献
[1] Krawitz PM, Schweiger MR, Rödelsperger C, et al. Identity-by-descent filtering of exome sequence data identifies PIGV mutations in hyperphosphatasia mental retardation syndrome[J]. Nature Genetics, 2010, 42(10): 827-829.
[6] O'Roak B J, Deriziotis P, Lee C, et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations[J]. Nature genetics, 2011, 43(6): 585-589.
[10] Yi X, Liang Y, Huerta-Sanchez E, et al. Sequencing of 50 human exomes reveals adaptation to high altitude[J]. Science, 2010, 329(5987): 75-78. [11] Tennessen J A, Bigham A W, O’Connor T D, et al. Evolution and functional impact of rare coding variation from deep sequencing of human exomes[J].
[8] Yan X J, Xu J, Gu Z H, et al. Exome sequencing identifies somatic mutations of DNA methyltransferase gene DNMT3A in acute monocytic leukemia[J]. Nature Genetics, 2011, 43(4): 309-315.
[5] Musunuru K, Pirruccello J P, Do R, et al. Exome sequencing, ANGPTL3 mutations, and familial combined hypolipidemia[J]. New England Journal of Medicine, 2010, 363(23): 2220-2227.
遗传因素的影响。这项研究利用外显子测序技术首次在中东家系1（MO1DA）的卵巢早衰 病人中发现了减数分裂基因中的STAG3基因突变可以导致隐性遗传卵巢早衰，也在小鼠动 物模型和卵巢早衰病患中得到了证实。为探索卵巢早衰或卵巢功能不全的发生机理，以及 阐明该病的临床高度异质性和遗传病因复杂性开辟了一个新的研究途径。
外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）是利用探针杂交富集外显子区域的DNA序列，通过高通量测序，发现与蛋白质功能变异相关遗传突
变的技术手段。相比于全基因组测序，外显子组测序更加经济、高效。
技术优势
1. 直接对蛋白编码序列进行测序，找出影响蛋白结构的变异 2. 高深度测序，可发现常见变异及频率低于1%的罕见变异 3. 针对外显子组区域测序，约占基因组的1％，有效降低费用，周期和工作量
[7] Jones S, Wang T L, Shih I M, et al. Frequent mutations of chromatin remodeling gene ARID1A in ovarian clear cell carcinoma[J]. Science, 2010, 330(6001): 228-2ID1A； 白血病[8]：发现致癌基因DNMT3A； 小细胞肺癌[9]：发现致癌基因SOX2 ……
群体研究
藏族人高原适应性研究[10]； 深度解析人类罕见遗传变异[11]；
……
案例解析
［案例一］ 单基因病研究：外显子测序解析卵巢早衰的遗传因素[12] 卵巢早衰通常是指女性40岁之前闭经，1%的妇女患有此病，病因复杂，被认为受到
高级信息分析（癌症）
1. 易感基因筛查 2. NMF突变特征及突变频谱分析 3. 已知驱动基因筛选 4. 高频突变基因统计及通路富集分析 5. MRT高频突变基因相关性分析 6. OncodriveCLUST驱动基因预测 7. 高频CNV分布及重现性分析 8. 肿瘤纯度／倍性分析 9. 异质性／克隆结构分析 10. NovoDrug高频突变基因靶向用药预测 11. NovoDR耐药突变筛选 12. 基因组变异Circos图展示
Science, 2012, 337(6090): 64-69. [12] Caburet S, Arboleda V A, Llano E, et al. Mutant cohesin in premature ovarian failure[J]. New England Journal of Medicine, 2014, 370(10): 943-949. [13] Chesi A, Staahl B T, Jovicic A, et al. Exome sequencing to identify de novo mutations in sporadic ALS trios[J]. Nature Neuroscience, 2013, 16(7): 851-855. [14] Zhang J, Fujimoto J, Zhang J, et al. Intratumor heterogeneity in localized lung adenocarcinomas delineated by multi region sequencing[J]. Science, 2014,