外显子组测序
全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）是指利用序列捕获或者靶向技术将全基因组外显子区域DNA 富集后再进行高通量测序的基因组分析方法。
与全基因组重测序相比，全外显子组测序只需针对外显子区域的基因序列测序，覆盖度更深、数据准确性更高，更加简便、经济、高效。
技术优势
高性价，强分析，快速交付
外显子组测序主要用于识别和研究与疾病相关的编码区的基因组变异。
结合大量的公共数据库提供的外显子数据和正常人群数据库, 有利于更好地排除无害突变及解释变异信息之间的关联和致病机理。
技术路线
技术参数
样本要求。
wes全外显子测序原理
wes全外显子测序原理WES（全外显子组测序）是一种高通量测序技术，可以高效地检测人类基因组中的所有编码蛋白质的外显子区域。
WES的基本原理是使用特定的引物（半万通量、数百个碱基对）引导DNA聚合酶在DNA模板上扩增外显子区域，并将扩增片段测序获取DNA序列信息。
WES使用两个主要的步骤：DNA片段化和文库制备、测序和数据分析。
DNA片段化是WES过程中的第一步。
在这个步骤中，科学家将DNA切割成小片段，以便将其放入文库中。
这些DNA片段通常是相对较小（100-300bp）的，这样可以提高测序的覆盖率和可靠性。
在该步骤中，使用不同的酶切割，例如剪刀酶，谷氨酰胺酰化酶等。
文库制备、测序和数据分析是WES过程的第二步。
在这个步骤中，科学家将切割好的DNA片段与引物匹配，每个引物匹配一个外显子。
一些引物刻意设计为靠近外显子边缘，以提高捕获的精密度和覆盖率，使测序产生的数据内容更为丰富。
在测序过程中，DNA片段经过PCR扩增和链分析，得到大量的读取长度为50nt-300nt的测序数据。
随后，这些测序数据经过对比分析，人们可以重建出原始DNA的序列，从而识别具体基因并分析其序列。
数据分析可以使用各种软件和工具进行。
相对于基因组测序，WES具有一些优势。
首先，外显子仅占人类基因组的1%-2%，相对于基因组，WES测序时间相对较短。
其次，外显子通常比内含子更加功能性，这些区域通常是与特定疾病相关的。
WES可以检测的区域是与人类疾病之间的关联更加密切。
最后，WES通常是更经济和有效的，因为需要处理的DNA量较小。
但是，WES方法也有一些限制。
首先，WES仅限于已知的外显子和靶区域，对于一些变异位于外显子间区域或非编码序列区域，他们将无法被检测到。
其次，WES在检测某些类型的变异时，如重复序列的扩增，G-富集区域和GC含量高的区域时可能不是非常敏感。
最后，由于WES是针对外显子进行测序的，不能覆盖整个基因。
在一些研究中，必要时，研究人员需要选择其他技术或方法来检测某些特定的基因区域。
全外显子测序检验的临床意义与样本要求
全外显子测序检验的临床意义与样本要求在当今医学领域，全外显子测序检验正逐渐成为临床诊断和治疗中不可或缺的重要工具。
全外显子测序是一种高通量的基因组测序技术，能够对所有外显子区域进行全面的检测和分析，从而帮助医生发现患者潜在的遗传变异和突变，为疾病的诊断和治疗提供更精准的信息。
针对全外显子测序检验的临床意义和样本要求，本文将从多个角度进行探讨，并共享个人观点和理解。
一、全外显子测序检验的临床意义1. 诊断和治疗指导：全外显子测序能够为医生提供全面的遗传变异信息，帮助精准诊断疾病类型和确定治疗方案。
尤其对于罕见遗传病、癌症等复杂疾病的诊断和治疗指导具有重要意义。
2. 遗传沟通和家族风险评估：通过全外显子测序检验，可以帮助患者进行遗传沟通，评估患病风险，并为家族成员提供相关遗传信息，帮助他们进行风险评估和健康管理。
3. 个性化医学：全外显子测序检验为个性化医学提供了重要的基础数据，可以根据个体的基因组信息，制定个性化的预防、诊断和治疗方案，实现精准医疗。
二、全外显子测序检验的样本要求1. 样本类型：全外显子测序通常需要采集患者的血液样本，获取其中的DNA进行测序分析。
对于一些特定疾病或研究项目，还可能需要获取肿瘤组织样本等特定样本。
2. 样本质量：样本的质量直接影响着全外显子测序的准确性和可靠性。
在采集和保存样本时，需要注意避免血液凝块和样本污染等情况，保证样本的纯度和完整性。
3. 样本数量：通常情况下，全外显子测序需要一定数量的DNA样本才能进行测序分析。
对于不同的实验项目和测序评台，样本数量的要求可能会有所不同，需要根据具体情况进行调整。
三、个人观点和理解全外显子测序作为一种新型的基因组测序技术，对于临床诊断和治疗具有重要意义。
通过对个体基因组的全面检测，我们能够更好地了解疾病的遗传基础，为精准医学提供数据支持。
然而，在进行全外显子测序检验时，我们也需要考虑样本的要求和质量，以确保测序结果的准确性和可靠性。
外显子测序原理
外显子测序原理
外显子测序是一种基因组测序技术，它的原理是通过对DNA中编码蛋白质的外显子区域进行测序，来揭示个体基因组的遗传信息。
外显子是基因组中编码蛋白质的部分，相对于整个基因组来说，外显子只占据了很小的比例，但却包含了大部分人类疾病相关的变异。
外显子测序的原理主要包括以下几个步骤，DNA提取、文库构建、高通量测序和数据分析。
首先，从样本中提取DNA，然后将DNA片段通过特定的方法构建成文库，接着进行高通量测序，获取大量的DNA序列信息。
最后，利用生物信息学分析软件对测序数据进行分析，鉴定外显子区域的变异信息。
在DNA提取过程中，需要保证提取的DNA质量和纯度，以确保后续测序的准确性和可靠性。
文库构建是将DNA片段连接到载体上，形成文库，这一步骤的关键是要避免DNA片段丢失或错位。
高通量测序是通过高通量测序技术对文库中的DNA片段进行大规模并行测序，产生海量的DNA序列数据。
数据分析是将测序得到的原始数据进行质控、比对、变异检测等一系列生物信息学分析过程，最终得到外显子区域的变异信息。
外显子测序技术的应用非常广泛，它可以用于研究人类疾病的发病机制、遗传变异的关联分析、药物靶点的筛选等领域。
通过对外显子的测序，可以发现与疾病相关的致病基因突变，为疾病的早期诊断和个体化治疗提供重要的依据。
同时，外显子测序也可以用于研究种群遗传结构、演化过程和基因型-表型关联等基因组学研究领域。
总的来说，外显子测序技术以其高通量、高效率、高准确性的特点，成为了当前研究基因组学和临床遗传学的重要工具。
随着测序技术的不断发展和成熟，外显子测序的应用前景将会更加广阔，为人类健康和疾病治疗带来更多的机遇和挑战。
外显子组测序技术
外显子组测序技术一、前言外显子组测序技术是一种高通量测序技术，它可以通过对人类基因组的外显子进行测序，来寻找与疾病相关的基因变异。
本文将详细介绍外显子组测序技术的原理、方法和应用。
二、原理外显子组测序技术是一种全基因组测序的变体，它只对基因组中编码蛋白质的区域（即外显子）进行测序。
这种技术可以检测到与疾病相关的单核苷酸多态性（SNP）、插入/缺失（indel）和结构变异等多种类型的突变。
三、方法1. 样品准备首先需要从患者或正常人身上提取DNA样品，并将其分离成片段。
然后使用特定的酶来切割这些片段，使其只包含编码蛋白质的区域。
2. 库制备接下来需要将这些片段连接到适当大小的DNA片段上，并添加适当的标签以便于后续处理。
这个过程称为库制备。
3. 测序完成库制备之后，需要进行高通量测序。
当前可用于外显子组测序的技术包括Illumina、Ion Torrent和Pacific Biosciences等。
4. 数据分析测序完成后，需要对数据进行处理和分析。
这个过程可以使用各种软件来完成，例如BWA、GATK和SAMtools等。
四、应用外显子组测序技术已经被广泛应用于疾病研究和临床诊断。
例如，在肿瘤学中，它可以检测到肿瘤细胞中的突变，并帮助医生选择最佳的治疗方案。
此外，它还可以用于遗传性疾病的诊断和预测。
五、优缺点1. 优点外显子组测序技术具有高通量、高灵敏度和高特异性等优点。
它可以检测到多种类型的基因变异，并且可以同时对多个样品进行分析。
2. 缺点外显子组测序技术的主要缺点是成本较高，并且需要较长的数据处理时间。
此外，由于只对编码蛋白质区域进行测序，因此无法检测到与非编码RNA相关的突变。
六、总结外显子组测序技术是一种重要的高通量测序技术，它可以用于疾病研究和临床诊断。
虽然它有一些缺点，但随着技术的不断发展，相信它将在未来得到更广泛的应用。
外显子测序 生物学重复-概述说明以及解释
外显子测序生物学重复-概述说明以及解释1.引言1.1 概述外显子测序（exome sequencing）是一种基于高通量测序技术的生物学研究方法，其目的是对生物体中的外显子区域进行快速、准确地测序和分析。
外显子是基因组中编码蛋白质的片段，它们占据了整个基因组的仅0.5至1.5的区域，但却承载着80以上的已知致病突变。
因此，外显子测序被广泛应用于寻找蛋白质编码基因的突变，以及与遗传性疾病、肿瘤和其他复杂疾病相关的致病突变的鉴定和研究。
外显子测序的基本原理是使用高通量测序技术对DNA样本进行测序，然后利用生物信息学方法将测序结果与参考基因组进行比对和分析，从而确定样本中外显子的序列和存在突变的位置。
与全基因组测序相比，外显子测序具有较低的成本和更高的效率，因为外显子相对较小且具有较高的功能重要性，可以更准确地筛选和鉴定潜在致病突变。
外显子测序在生物学研究中的应用广泛而重要。
它不仅可以用于研究人类遗传性疾病和肿瘤突变，还可应用于农业、畜牧业和其他生物领域的基因组学研究。
通过对不同个体的外显子进行测序，我们可以了解个体间的遗传差异、突变积累和遗传进化规律，为人类进化和适应性研究提供重要依据。
然而，外显子测序也面临一些挑战。
首先，由于外显子区域相对较小，它只能提供关于外显子的信息，对非编码区域的突变鉴定有限。
其次，外显子测序在处理复杂疾病和疾病相关基因组变异时可能会遇到困难，因为这些变异可能位于基因的调控区域或与功能相关的非编码RNA中。
此外，外显子测序对测序深度和准确性要求较高，因此需要高质量的测序平台和数据分析方法的支持。
总之，外显子测序作为一种高效、准确的测序技术，在生物学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
随着技术的不断发展和应用的不断扩大，外显子测序将为我们揭示生物体的基因组变异与功能之间的关系，为疾病的早期诊断和个性化治疗提供更多可能性。
同时，对于生物学重复的研究也为我们提供了全新的视角和理解，有助于揭示生命的奥秘和进化的规律。
全外显子组测序常见问题（上）
全外显⼦组测序常见问题（上）1全外显⼦组测序必须要有参考基因组吗？必须有，如果没有参考因组，要提供近缘物种的序列，但不能保证捕获结果的可靠性。
因为捕获探针是根据提供的参考序列来设计的，如果已知⽬标区域与参考基因组⽐有较⼤出⼊，例如⼤⽚段的插⼊缺失，是不推荐的。
2为什么外显⼦测序在分析时需要跟全基因组⽐对，⽽不是直接与⽬标区域⽐对？第⼀，⽬标区域相对于全基因组⼀般较短，⽽且可能不连续，如果将⽬标区域单独提取出来，会影响区域边缘的序列⽐对效果；第⼆，⽆法评估捕获质量，例如脱靶率、on target⽐例等。
3全外显⼦组测序⼀般建议做多少倍的覆盖？⼀般做100×或150×。
较⾼的覆盖倍数，对于测异质性的遗传变质，可以发现⼩⽐例的突变。
另外，外显⼦测序的覆盖是随机的，这样较⾼的平均覆盖率有利于保证⼤部分的区域有⾜够的覆盖倍数。
4全外显⼦组测序深度的意义是什么？测序深度如何换算？测序深度代表了序列被探针组覆盖的次数，次数越⾼，测序结果的识别就越精确，后续的统计分析也就越准确。
如果做肿瘤、低频突变研究，建议测序深度⾄少应达到150×以上。
如果只看经典SNP、⾮低频突变，测序深度也⾄少应该在30×以上。
测序深度换算⽅法：⼀般⽬标区域的捕获效率在60-70%，安捷伦和罗⽒等外显⼦捕获试剂盒的⽬标区域⼤⼩在60Mb左右，即测序深度=10G*60%/60Mb=100×。
5全外显⼦组测序能够测出多⼤的⽚段缺失？⼤致能测出50bp的⽚段缺失。
由于外显⼦测序的覆盖很不平均，所以如果有⼤段的缺失，⽆法判断是因为杂交没有捕获到，还是因为缺失。
⽬前能够测到的，就是在⼀个read中发现的缺失。
⼀个read的长度也就是150bp，所以50bp以下的⽚段缺失可以从外显⼦测序中测出来。
6全外显⼦组测序可以做CNV分析吗？检测CNV的⽅法还有哪些？全外显⼦测序因为有⼀个杂交捕获的过程，这样就会有⼀个杂交捕获效率的问题。
利用外显子组测序检测一个家系突变的分析方法介绍201412
Fastq文件示例>>
第二步：测序质量评估及过滤
• 评估数据产量和质量（Illumina报告示例）， 并根据需要去除接头污染和低质量序列， 如：
– FastQC可对Illumina和ABI SOLiD测序序列质量 进行快速评估（FastQC质量报告示例） – FASTX-Toolkit和Galaxy即可评估序列质量，还 可去除污染碱基和低质量碱基并对序列进行 质量过滤
变异注释工具比较
(Pabinger, et al. Brief in Bioinform, 2013)
实际应用中，具体运用某个特定的软件是可以根据需要调整、优化的
常用注释工具ANNOVAR
• /annovar/
• 较全面的功能注释，广为使用 • 需在本地安装注释数据库，如dbSNP、 1000genomes、SIFT、DGV等，按需灵活使用 • 可基于基因注释、基于区间注释，还可过滤 • 对于SNP和indel，结果包括基因注释、氨基酸 置换预测评分、保守性预测评分、dbSNP ID、 千人基因组变异频率、NHLBI-ESP 6500 个外显 子测序变异频率等 • Annovar注释结果示例
– 目前是验证DNA序列突变的金标准
• 全基因组或全外显子组的第二代测序(Nextgeneration sequencing, NGS)(Illumina: 30-150bp)
– 优点：是通量高，成本较低 – 缺点：需PCR易引入误差，容易在高GC和同聚物的区域 出现错误，无法对高重复区域和单倍体型或杂合子序 列等这些复杂区域进行测序
可在线使用的注释工具 SeattleSeq Annotation
• /SeattleSeqAnnotation137/
• 可接受多种输入格式，如Maq、GFF、CASAVA、VCF、 自定义格式、一行一基因型格式、GATK BED • 可根据NCBI 全基因注释、或CCDS（仅编码区）、 或NCBI和CCDS两者兼有 • 注释的结果内容较SnpEff丰富，但不及ANNOVAR全 面
外显子组测序数据分析流程
外显子组测序数据分析流程外显子组测序（Exome Sequencing）是一种用于测序所有编码蛋白质的外显子区域的技术。
外显子是基因组中编码蛋白质的区域，占据整个基因组的约1-2%。
相较于全基因组测序，外显子组测序可以更加经济高效地研究和发现与疾病相关的基因变异。
以下是外显子组测序数据分析的一般流程：1.数据质控和预处理2.比对和变异调用将预处理后的数据与参考基因组进行比对，可以使用多种比对工具，如BWA、Bowtie等。
比对后，会通过一系列的筛选步骤，利用各种变异检测算法对测序结果进行检测，包括单核苷酸变异（SNV）、小片段插入/缺失（Indel）和结构变异（SV）等。
3.变异注释在进行变异注释时，将检测到的变异与各类公共数据库（如dbSNP、ClinVar等）进行比对，以确定变异的频率和相关的临床信息。
还可以使用预测软件预测变异的功能影响和通路关联等。
4.功能分析和数据解读对于已注释的变异，需要进一步进行功能分析和数据解读。
这包括通过标准化的生物信息学和统计学方法对候选变异进行筛选，确定相关性并验证其是否对目标表型有影响。
可以使用多种工具和软件，如ANNOVAR、Variant Effect Predictor（VEP）等。
5.通路分析和功能富集通路分析和功能富集分析帮助理解变异对细胞、组织或系统功能的影响。
可以使用数据库和工具，如DAVID、GSEA等，通过GO（Gene Ontology）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）路径信息和其他公共基因组学数据库，对变异进行通路富集和功能分析。
6.结果呈现最后，将数据分析结果通过可视化图形、表格和注释报告等形式进行展示和呈现。
这有助于更好地理解分析结果并帮助研究人员做出进一步的研究和决策。
需要注意的是，外显子组测序数据分析流程是根据具体研究目标和实验设计而有所不同的，上述流程仅为一般参考。
最新外显子组测序数据分析报告
目录1, 分析流程和目录信息 (2)1.1分析流程图 (2)1.2目录信息 (2)2, 数据的质控（QC目录） (3)2.1数据质量qc图 (3)2.2数据量统计 (6)3, 序列比对（target目录） (7)3.1比对方法 (7)3.2数据比对统计 (7)4, SNV的识别和计算（raw目录） (11)4.1方法简介 (11)4.2 VCF格式说 (14)4.3 SNV和Indel统计信息 (15)5，变异体的注释和统计(result目录) (17)5.1 注释结果统计 (17)5.2 注释结果详细说明 (21)6，候选位点分析结果 (Candidate目录) (25)6.1 位点筛选标准 (25)6.2 候选位点结果说明 (26)7，参考文献和数据库 (27)7.1 分析软件参考文献 (27)7.2 参考数据库 (27)1, 分析流程和目录信息1.1分析流程图1.21. 外显子测序质控结果2. 捕获区域比对数据与覆盖度等指标统计3. SNV和Indel原始VCF文件4. SNV和Indel注释结果及分布统计5. 候选SNV和Indel结果注意：所有txt，stat，VCF等文本文件都可以用excel打开2, 数据的质控（QC目录）2.1数据质量qc图1，每循环的碱基质量分布图2，不同质量的read数量分布图3，read的长度分布图4，碱基N数目分布统计5，每循环ATCG分布统计6，read的GC含量统计7，每循环的GC比例统计2.2数据量统计Summary文件sample pf read clean read Trim remain% pf base(G) clean base(G) Trim remain% 样本名原始read数有效read数有效read比例原始碱基数（G）有效碱基数（G）有效碱基比例lf002 48661241 47997016 98.63500193 9.829570682 9.58777551 97.54012479 lf003 47690482 47045833 98.64826487 9.633477364 9.396330775 97.53830751 lf004 48179592 47522300 98.63574602 9.732277584 9.493069911 97.54212032 lf005 37943779 36984007 97.47054188 7.664643358 7.337483061 95.7315653 lf006 46440756 45615915 98.2238855 9.381032712 9.040112844 96.36585994 lf007 53829583 52838815 98.15943586 10.87357577 10.47063335 96.29429703 lf008 44526129 43527254 97.7566543 8.994278058 8.629876672 95.94851993, 序列比对（target目录）3.1比对方法参考序列在整个处理过程中使用UCSC hg19版本的人类基因组序列作为参考，注释信息和命名法则均已UCSC为标准，相关数据可以从UCSC网站下载。
人全外显子测序结题报告
人全外显子测序结题报告成都生命基线科技有限公司目录一、分析方法 (3)1.1 全外显子组测序 (3)1.2 生物信息分析概述 (3)1.3 数据过滤 (4)1.4 比对 (4)1.5 InDels 附近区域的局部重比对 (4)1.6 碱基质量值校正(BQSR) (4)1.7 变异检测 (5)1.8 过滤变异结果 (5)1.9 变异结果注释与预测 (5)1.10 网络资源 (5)二、项目流程 (6)2.1 实验流程 (6)2.2 信息分析流程 (6)三、项目结果报告 (7)3.1 测序数据产出 (7)3.2 目标区域上的比对结果统计 (8)3.3 数据质控 (10)3.4 SNP结果 (10)3.5 InDel 结果 (11)四、参考文献 (13)五、帮助 (14)5.1 FASTQ格式说明 (14)5.2 比对结果格式说明 (14)5.3 如何实现基因组变异可视化 (15)5.4 如何选择用于验证的变异 (15)5.5 如何寻找候选变异 (15)5.6 交付目录及结果文件说明 (16)5.7 如何解压缩文件 (16)六、常见问题 (17)一、分析方法1.1 全外显子组测序质量合格的基因组 DNA 样品通过超声波高性能样品处理系统（Covaris）随机打断成主峰是 200bp-300bp 左右的片段。
随后进行 DNA 片段末端修复，3’端加上“A”碱基，两端加上文库接头。
接头连接后的文库进行线性扩增（LM- PCR ）制备成杂交文库。
取适量的杂交文库与外显子芯片进行捕获富集，洗脱掉未富集的片段后进行扩增。
扩增产物经Agilent 2100 bioanalyzer 仪器（Agilent DNA 1000 Reagents）和 QPCR 质控，质控合格后即可上机测序。
我们使用 Illumina HiSeq 系列平台，对每个合格的文库进行高通量测序，并保证每个样品的数据量达标。
测序得到的原始图像数据，经 Illumina 碱基识别软件（Base Calling）转化为原始序列数据（raw reads），即双末端 reads（paired-end reads），数据以 FASTQ 文件格式存储，称之为 raw data。
全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序的具体方法及步骤全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，简称WES）是一种高通量测序技术，用于测定一个个体的所有外显子区域的DNA序列。
外显子是编码蛋白质的基因组区域，占据了人类基因组的约1-2%。
WES可以用于寻找致病基因突变，特别是在遗传性疾病的分子诊断中有广泛的应用。
下面将详细介绍WES的具体方法及步骤。
1.样品准备：-提取DNA：从待测个体的外周血或组织样品中提取总DNA。
-细胞裂解：使用特定组织裂解缓冲液将细胞或组织样品裂解，释放DNA。
-纯化DNA：通过离心等步骤，去除杂质，纯化DNA。
2.外显子库建立：- 靶向捕获：使用外显子组富集探针（baits）将DNA中的外显子区域进行加权，并去除非外显子区域的DNA片段。
-杂交反应：将靶向探针与DNA样品进行杂交反应，使探针与待测DNA的外显子区域发生特异性结合。
-洗涤：将未结合的探针洗掉，保留结合的外显子区域DNA片段。
-PCR扩增：对靶向捕获得到的DNA片段进行PCR扩增，以增加样品中外显子区域的DNA原料。
3.高通量测序：-数据库构建：将PCR扩增得到的外显子DNA片段建立一个DNA文库，用于测序。
- 测序反应：使用高通量测序平台（如Illumina HiSeq X）进行DNA文库的测序，得到大量的短序列片段（reads）。
- 数据处理：通过对这些reads进行去除低质量序列、比对到参考基因组等处理，获得高质量的测序数据。
4.数据分析：- 变异检测：使用专门的变异检测软件对样品中的变异进行分析，包括单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，简称SNPs）和小片段插入缺失等。
-数据解读：将检测到的变异与公开的数据库进行对比，筛选出可能与疾病相关的变异。
-功能注释：对筛选出的变异进行功能注释，评估其潜在影响，进一步缩小候选基因的范围。
- 候选基因验证：对最终候选基因进行进一步的实验验证，如Sanger测序。
外显子测序简介
外显⼦测序简介外显⼦测序，也叫做外显⼦捕获测序。
⾸先利⽤序列捕获技术将外显⼦区域的DNA捕获并富集，然后进⾏⾼通量测序。
外显⼦测序主⽤⽤来分析基因组上的变异位点，包括SNP和INDEL。
外显⼦区域占整个⼈类基因组1%的⽐例，但是却包含了85%左右的已知疾病变异。
相⽐全基因组测序，外显⼦测序成本低，⽽且可以检测到全基因组测序鉴定不到的⼀些SNP位点。
⽬前市场上主流的外显⼦捕获试剂盒是以下3家公司的产品：1. Roche2. Agilent3. IlluminaRoche的Nimblegen SeqCap EZ Exome Kit；Agilent的SureSelect Exome kit; Illumina公司的TrueSeq Exome Kit。
Nimblegen SeqCap EZ Exome Kit⽬前为v3版本，链接如下https:///en/products-solutions/by-category/target-enrichment/hybridization/seqcap-ez-exome-v3-kit.html从下图可以看出，这款试剂盒覆盖的区域是最⼴泛的。
SureSelect Exome kit⽬前为v7版本，链接如下https:///en/SureSelect-DNA-Target-Enrichment-Baits-NEW/SureSelect-Human-All-Exon-V6/?cid=AG-PT-124&tabId=AG-PR-1308V7是今年才出来的最新版，⽬前⼤部分的数据还是基于v6版的。
illumina 是⽬前最⼤的⼆代测序仪⼚商，其外显⼦试剂盒价格⽐较低，应⽤的也很多。
链接如下https:///products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/truseq-exome.html?langsel=/cn/外显⼦区域富集完成之后，就是⾼通量测序了，⽬前主流的测序平台还是illumina, 包括Miseq, Hiseq和Novaseq。
外显子组学
外显子组学全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：外显子组学（exome sequencing）是一种高通量测序技术，通过测定细胞内所有外显子的DNA序列来识别与疾病相关的遗传变异。
外显子是编码蛋白质的DNA序列片段，占全基因组的约1%。
与全基因组测序相比，外显子组测序更便宜、更快速，并且能够准确识别蛋白质编码区域的遗传变异。
外显子组学的发展为遗传疾病的诊断和研究提供了新的机会。
许多遗传性疾病是由外显子中的点突变或小片段插入/缺失引起的，外显子组学可以帮助医生和研究人员快速准确地发现这些变异。
外显子组学还可以用于疾病的早期筛查、药物靶点的发现以及个性化医疗的实施。
外显子组学技术的原理是先将DNA进行复制和片断，再通过测序仪器对DNA序列进行测定，最后通过计算机算法对测定结果进行分析和比对。
这一技术的应用范围非常广泛，可以涵盖从个体基因组到完整种群遗传组成的所有尺度。
外显子组学已经在多种疾病的研究和诊断中取得了成功，比如罕见遗传病、癌症、心血管疾病等。
外显子组学的发展也面临着一些挑战和问题。
首先是数据分析和解释的复杂性，外显子组学测序可以产生大量的数据，如何从中提取有用信息是一个值得研究的问题。
其次是测序结果的准确性和可靠性，虽然外显子组学技术已经非常成熟，但仍然有一定的误差率存在。
外显子组学在临床应用中还需要克服一些道德与法律方面的挑战，比如隐私保护、数据共享等问题。
第二篇示例：外显子指的是基因组中编码蛋白质的DNA序列，而外显子组学则是利用高通量测序技术，对这些外显子进行测序和分析，以寻找与疾病相关的变异。
与全基因组测序相比，外显子组学能够更加精准地筛选出与疾病相关的基因变异，从而为疾病的诊断、治疗和预防提供更为有效的数据支持。
外显子组学的应用领域非常广泛，包括但不限于疾病的遗传机制研究、个体化医学的发展、药物疗效的预测等。
通过外显子组学技术，科学家可以快速准确地识别出与疾病相关的基因变异，为相关疾病的诊断提供重要线索。
panel全外显子组与全基因组测序的全方位对比
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捕获探针供应商
国外较大的提供杂交捕获探针库的供应商
Agilent SureSelect
Roche NimbleGen
IDT xGen™
Twist Bioscience Human Core Exome
国内
迪赢生物
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靶向捕获与冗余数据
液相杂交捕获技术流程图
冗余数据的产生
同源序列
目标序列
同源序列干扰
panel大小约1-2M，约占全外显子的1%-2%左右
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检测范围与测序深度
全基因组测序 全外显子组测序 不孕不育panel
30-40X 100-150X 500X以上
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检测方案的选择
WGS
WES panel
panel和WES，临床上如何选择？
panel具有更低廉的价格，更高的测序深度 WES具有更广泛的检测范围
表型遗传异质性较高，疾病 复杂，难以区分，需要对大 量基因进行筛查，更适合 WES或WGS。
PMID: 29398702
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检测方案的选择
神经系统疾病/发育异常类疾病
精子异常导致的男性不育
智力障碍
小儿癫痫
线粒体病
行为异常 遗传代谢病
神经肌肉病
基因数量多达2000个以上，表型异质性高，症 状难以区分，容易误诊，更适合WES/WGS
WGS包含所有碱基，可以检测 CNV和非编码序列 panel可定制检测范围，可以加 入WES不包含的目标区域
WES测序深度还不足以区分真 假基因，深度更高的panel却有 可能做到。
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安捷伦各版本WES对比
靶标 大小
设计 大小
V8
35.1 Mb 41.6 Mb
全外显子组测序意义
《全外显子组测序意义》1.“全外显子组测序就像给基因世界的一把超级放大镜，能让我们看得更清楚呢。
得知。
比如小李家有遗传病史，一直不知道是哪个基因出了问题，做了全外显子组测序后，发现了那个捣乱的基因，就像在一堆沙子里找到了关键的小石子，多神奇呀。
要是没这技术，那得一直蒙在鼓里吧。
”2.“它像是侦探手里的关键线索，能帮我们解开很多健康谜团，得知。
像小张老是莫名其妙生病，各种检查都做了还是没头绪。
全外显子组测序一查，嘿，找到了隐藏的基因缺陷，这就好比在黑暗中找到了灯的开关。
要是没这个测序，小张还得继续遭罪呢，哼。
”3.“全外显子组测序是疾病诊断的有力武器呀。
得知。
比如小孙的孩子发育有些异常，医生怀疑是基因问题。
通过全外显子组测序，一下子就明确了病因，这就像打靶找到了靶心一样准确。
要是没有这个测序，诊断得多麻烦呀，愁死个人了。
”4.“这测序对药物治疗可有大帮助呢，就像给医生的用药指南加了个导航。
得知。
比如小周得了一种罕见病，用了好多药都不管用。
全外显子组测序结果出来后，医生根据基因信息调整了药物，病情就有了好转。
要是没这测序，就像在迷宫里乱走，啥时候能找到出口呀。
”5.“全外显子组测序能预测疾病风险，这就像天气预报能提前告知风雨一样。
得知。
比如小吴家族有癌症病史，他做了全外显子组测序后，知道了自己患某种癌症的风险比较高，就可以提前预防啦。
要是没这个测序，就只能等生病了才知道，那多被动呀。
”6.“它对研究人类进化也有重要意义呢，就像一本古老的史书。
得知。
比如小郑是研究人类进化的学者，通过分析不同人群的全外显子组测序数据，发现了人类在漫长岁月里基因的变化轨迹，这可比在土里挖化石研究进化有趣多啦。
要是没这测序，研究得多受限呀。
”7.“全外显子组测序在罕见病研究里是个大宝贝，就像沙漠里的绿洲。
得知。
比如小胡研究罕见病多年，一直进展缓慢，全外显子组测序让他找到了很多新的致病基因，这就像打开了一扇新的研究大门。
要是没这个测序，那些罕见病患者得多无助呀。
基因相关名词解释
基因相关名词解释名词解释⼀、⽣物学名称解释1. 什么是⾼通量测序技术？⾼通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为⼀代测序技术）⾰命性的改变, ⼀次对⼏⼗万到⼏百万条核酸分⼦进⾏序列测定, 因此在有些⽂献中称其为下⼀代测序技术(next generation sequencing，NGS )⾜见其划时代的改变, 同时⾼通量测序使得对⼀个物种的转录组和基因组进⾏细致全貌的分析成为可能, 所以⼜被称为深度测序(Deep sequencing)。
2. 什么是Sanger法测序（⼀代测序）？Sanger法测序利⽤⼀种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。
直到掺⼊⼀种链终⽌核苷酸为⽌。
每⼀次序列测定由⼀套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混⼊限量的⼀种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终⽌。
终⽌点由反应中相应的双脱氧⽽定。
每⼀种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到⼀组长⼏百⾄⼏千碱基的链终⽌产物。
它们具有共同的起始点，但终⽌在不同的的核苷酸上，可通过⾼分辨率变性凝胶电泳分离⼤⼩不同的⽚段，凝胶处理后可⽤X-光胶⽚放射⾃显影或⾮同位素标记进⾏检测。
3. 什么是SNP、SNV（单核苷酸位点变异）？单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和单核苷酸位点变异（single nucleotide variants, SNV）。
个体间基因组DNA序列同⼀位置单个核苷酸变异(替代、插⼊或缺失)所引起的多态性。
不同物种、个体基因组DNA序列同⼀位置上的单个核苷酸存在差别的现象。
有这种差别的基因座、DNA序列等可作为基因组作图的标志。
⼈基因组上平均约每1000个核苷酸即可能出现1个单核苷酸多态性的变化，其中有些单核苷酸多态性可能与疾病有关，但可能⼤多数与疾病⽆关。
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［案例三］ 癌症研究：外显子测序研究局限性肺腺癌瘤内异质性[14] 本研究采用多区域取样分析瘤内异质性的研究思路，对11位患者的局限性肺腺癌的48
个肿瘤样品进行了外显子测序。共鉴定出7269个体突变，其中21个是已知的与癌症相关的 基因突变，76% 的体突变及21个已知癌症基因突变中的20个都可以在同一肿瘤的所有区域 样品中检测到，表明对肿瘤的某一区域进行单次活检，以适当的深度对其测序，可以鉴别 出绝大多数突变。而前期关于肾透明细胞癌的研究结果表明，肿瘤不同区域样品的共有突 变仅占突变总数的31%~37%，说明肿瘤异质性在不同癌种间存在差异。
应用方向
孟德尔疾病研究
马布里综合症[1]：发现致病基因PIGV； 逆向性痤疮[2]：发现致病基因NCSTN； 眼皮肤白化病[3]：发现致病基因SLC24A5； 先天性肾脏和尿道畸形[4]：发现致病基因DSTYK;
复杂疾病研究
混合型低脂血症[5]：发现致病 基因ANGPTL3； 孤独症[6]：发现11 个新生突变 ……
[9] Rudin C M, Durinck S, Stawiski E W, et al. Comprehensive genomic analysis identifies SOX2 as a frequently amplified gene in small-cell lung cancer[J]. Nature Genetics, 2012, 44(10): 1111-1116.
技术参数
样品要求 捕获平台 测序策略 测序深度 项目周期
外显子组测序 样品总量：≥1.0 μg DNA （提取自新鲜及冻存样本）
≥1.5 μg DNA （提取自FFPE样本） 样品浓度：≥20 ng/µl
Agilent SureselectXT Custom Kit
HiSeq PE150
1. 单基因病/复杂疾病有效测序深度50X以上 2. 肿瘤有效测序深度100X以上 注：可根据老师研究目的进行更高深度测序
37天
生物信息分析
1. 数据质控：去除接头污染和低质量数据 2. 与参考序列进行比对、统计测序深度及覆盖度
高级信息分析（单基因病）
1. 突变位点过滤 2. 显/隐性遗传模式分析（需老师提供家系信息）
2.1. 显性遗传模式分析 2.2. 隐性遗传模式分析 3. 候选基因功能注释 4. 基因功能及通路分析 5. 家系连锁分析 6. 纯合子区域（ROH）分析
［案例二］ 复杂疾病研究：外显子测序鉴定肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）的致病 基因[13]
肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS），又称为渐冻症，是一种成年型的神经退行性疾 病。本研究选取了47个父母+患病儿的ALS家系，利用全外显子测序寻找 De novo mutation。 发现了25个de novo突变基因，进行功能聚类分析，锁定了1个与染色质包装、神经树突生 长相关的基因CREST，后期通过细胞试验验证了该基因突变会影响神经元的伸展，证实 CREST突变与ALS相关。
[2] Liu Y, Gao M, Lv YM, et al. Confirmation by exome sequencing of the pathogenic role of NCSTN mutations in acne inversa (hidradenitis suppurativa) [J]. Journal of Investigative Dermatology,2011, 131(7): 1570-1572.
[4] Sanna-Cherchi S, Sampogna R V, Papeta N, et al. Mutations in DSTYK and dominant urinary tract malformations[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 369(7): 621-629.
基本信息分析
3. SNP／InDel检测、注释及统计 4. Somatic SNV／InDel检测、注释及统计（成对样本）
高级信息分析（复杂疾病）
1. 突变位点过滤 2. 显/隐性遗传模式分析（需老师提供家系信息）
2.1. 显性遗传模式分析 2.2. 隐性遗传模式分析 3. 候选基因功能注释 4. 新生突变筛选及分析（成三/成四家系） 4.1. de novo mutation 筛选 4.2. 新生突变速率计算 5. 候选基因功能富集 6. 蛋白互作网络分析（PPI） 7. 基因显著性分析 （推荐20对Case/Control or trios样本）
图1 STAG3 基因结构图 （红色箭头为 STAG3 基因突变位置）
图2 ALS家系图及CREST突变功能验证
图3 产生化疗抗性的个体样本中体突变的数量及频率
参考文献
[1] Krawitz PM, Schweiger MR, Rödelsperger C, et al. Identity-by-descent filtering of exome sequence data identifies PIGV mutations in hyperphosphatasia mental retardation syndrome[J]. Nature Genetics, 2010, 42(10): 827-829.
[6] O'Roak B J, Deriziotis P, Lee C, et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations[J]. Nature genetics, 2011, 43(6): 585-589.
[10] Yi X, Liang Y, Huerta-Sanchez E, et al. Sequencing of 50 human exomes reveals adaptation to high altitude[J]. Science, 2010, 329(5987): 75-78. [11] Tennessen J A, Bigham A W, O’Connor T D, et al. Evolution and functional impact of rare coding variation from deep sequencing of human exomes[J].
[8] Yan X J, Xu J, Gu Z H, et al. Exome sequencing identifies somatic mutations of DNA methyltransferase gene DNMT3A in acute monocytic leukemia[J]. Nature Genetics, 2011, 43(4): 309-315.
[5] Musunuru K, Pirruccello J P, Do R, et al. Exome sequencing, ANGPTL3 mutations, and familial combined hypolipidemia[J]. New England Journal of Medicine, 2010, 363(23): 2220-2227.
遗传因素的影响。这项研究利用外显子测序技术首次在中东家系1（MO1DA）的卵巢早衰 病人中发现了减数分裂基因中的STAG3基因突变可以导致隐性遗传卵巢早衰，也在小鼠动 物模型和卵巢早衰病患中得到了证实。为探索卵巢早衰或卵巢功能不全的发生机理，以及 阐明该病的临床高度异质性和遗传病因复杂性开辟了一个新的研究途径。
外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）是利用探针杂交富集外显子区域的DNA序列，通过高通量测序，发现与蛋白质功能变异相关遗传突
变的技术手段。相比于全基因组测序，外显子组测序更加经济、高效。
技术优势
1. 直接对蛋白编码序列进行测序，找出影响蛋白结构的变异 2. 高深度测序，可发现常见变异及频率低于1%的罕见变异 3. 针对外显子组区域测序，约占基因组的1％，有效降低费用，周期和工作量
[7] Jones S, Wang T L, Shih I M, et al. Frequent mutations of chromatin remodeling gene ARID1A in ovarian clear cell carcinoma[J]. Science, 2010, 330(6001): 228-2ID1A； 白血病[8]：发现致癌基因DNMT3A； 小细胞肺癌[9]：发现致癌基因SOX2 ……
群体研究
藏族人高原适应性研究[10]； 深度解析人类罕见遗传变异[11]；
……
案例解析
［案例一］ 单基因病研究：外显子测序解析卵巢早衰的遗传因素[12] 卵巢早衰通常是指女性40岁之前闭经，1%的妇女患有此病，病因复杂，被认为受到
高级信息分析（癌症）
1. 易感基因筛查 2. NMF突变特征及突变频谱分析 3. 已知驱动基因筛选 4. 高频突变基因统计及通路富集分析 5. MRT高频突变基因相关性分析 6. OncodriveCLUST驱动基因预测 7. 高频CNV分布及重现性分析 8. 肿瘤纯度／倍性分析 9. 异质性／克隆结构分析 10. NovoDrug高频突变基因靶向用药预测 11. NovoDR耐药突变筛选 12. 基因组变异Circos图展示