乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测标准操作规程

乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测标准操作规程（PCR-荧光探针法）

1.目的: 规范乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测操作流程，保证检测结果的准确性。

2.应用范围: HBV DNA 荧光定量检测。

3.职责:

3.1 文件编写：实验室技术员。

3.2 文件审核：实验室主管。

3.3 文件审批：实验室主任。

3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。

4. 参考文献：

4.1 中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书。

4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书。

5. 内容：

5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。

5.2 实验原理：用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而定量检测乙型肝炎病毒DNA。

5.3 性能参数：

5.3.1 精密度：检测下限为5.0x102IU/ml。

5.3.2 线性范围：1.0x103～1.0x108IU/ml。

5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集

5.4.1 标本类型：血清。

5.4.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。

5.4.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月，应避免反复冻融。

5.4.4 运送条件：标本运送采用0℃冰壶。

5.4.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。

5.5 设备和试剂：

5.5.1 设备： DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。

5.5.2 试剂：

5.5.2.1 试剂品牌：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

5.5.2.2 试剂批准文号：国食药监械（准）字2014第3400032号。

5.5.2.3 试剂组成：

5.5.2.4 试剂保存和有效期：保存于-20±5o C；有效期9个月。

5.5.2.6 质控品：由康切斯坦购买质控品。质控水平S4。

5.6 操作过程：

5.6.1 血清标本与质控品的处理：待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界阳性质控品进行同步处理。

5.6.1.1 打开恒温水浴箱或干式恒温器，设定温度100℃。

5.6.1.2从试剂盒中取出DNA提取液I、内标溶液、阴性质控品、HBV阳性定量参考品。从冰箱取出阳性质控品，让其在室温下完全融化。

5.6.1.3 取450ul DNA提取液I和4ul内标溶液，分别加到1.5ml的灭菌离心管中并编号。

5.6.1.4 将DNA提取液I、阴性质控品于振荡混匀器振荡5s，6,000rpm离心5s。

5.6.1.5 往装有450ul DNA提取液I和内标溶液的灭菌离心管中加入待测样本血清和阳性质控品各200ul，用振荡器剧烈振荡混匀15s，瞬时离心数秒。100℃恒温处理10min。

5.6.1.6 12,000rpm离心5min,2～8℃保存备用（如需长期保存请放置-20℃）。

5.6.1.9 排版：根据样本数量编写《PCR实验室DA－7600取试剂、加样、扩增对照图面版表》，注意添加阴性质控，阳性质控及阳性定量参考品。

5.6.1.10 加样：从-20℃冰箱取出HBV-PCR 反应管若干管转移至加样区，根据《PCR实验室DA 7600取试剂、加样、扩增对照图面版表》的位置放好后，直接加入处理好的样本DNA和阴性质控品、阳性质控品，阳性定量参考品各20μL，盖紧管盖，瞬时离心以将液态离如管底。

5.6.2 DA7600仪器操作与结果分析：参见《达安7600荧光定量PCR仪操作、校准及保养规程》及《基因扩增检测及结果分析规程》。

5.6.3 记录实验数据。

5.6.4 取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩

增管破裂而导致污染。

5.6.5 关闭扩增仪电源和计算机电源。

5.7 干扰和交叉反应：

5.7.1 样本存在溶血可导致检测结果升高。

5.7.2 某些药物可干扰检测，使检测结果降低，如拉米夫定，因此需避免用药期间采样检测。

5.8 临床意义：直接反映人体内乙肝病毒是否存在及病毒复制活跃程度，可作HBV病毒感染的辅助诊断及其疗效监测的标准。

5.9 安全防护措施：

5.9.1 试剂处理：

5.9.1.1 使用或更换试剂时，务必戴手套；不要用身体直接接触试剂，以免损伤皮肤。

5.9.1.2 如果皮肤接触了试剂，立即用大量清水冲洗并消毒。

5.9.1.3 如果眼睛接触了试剂，立即用喷淋器冲洗，并紧急就医。

5.9.2 仪器使用：

5.9.2.1 仪器运转中不要触摸加样机构、试剂分注机构、搅拌机构、反应容器清洗机构等可动部分。

5.9.2.2 仪器通电时不能打开仪器上面、背面、侧面的盖板，不能触摸光源灯的玻璃面。

5.9.3 生物安全防护：参见《生物安全防护手册》

5.10 注意事项：

5.10.1 PCR荧光定量检测法容易受污染，所以实验过程中应避免反复开盖。

5.10.2 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融。

5.10.3 试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。

5.10.4 实验完毕应用有效氯含量为1000mg/L的84消毒液擦拭桌面，打开紫外线灯消毒30分钟以上。

6.相关记录表格：

6.1 LAB-SOP-PCR-005-T01-001《PCR实验室实验、交接班记录表》