镰刀型细胞贫血症基因的检测要领
镰刀贫血
症状分析:1.双侧大腿和臀部疼痛(疼痛危象是SCA 最严重的并发症之一，镰刀变性的红细胞堵塞小血管形成血栓而导致疼痛危象的发生。
疼痛多发肌肉、骨骼、四肢关节及胸腹部)2.布洛芬（用于缓解轻至中度疼痛如头痛、关节痛、偏头痛、牙痛、肌肉痛、神经痛等）不能解除其疼痛症状3.最近没有外伤和剧烈运动史4.感觉疲乏（贫血常引起疲乏，糖尿病、慢性肾炎等疾病都会引起疲乏）和小便时尿道经常有烧灼感(尿道有炎症)5患者既往有症状6体温正常，没有急性疼痛、家族其他成员没有类似表现（镰刀形细胞贫血是一种常染色体隐性遗传病 ）。
7结膜和口腔粘膜稍微苍白（由于红细胞的主要功能时携带氧气，贫血时，血氧含量减少而呈低血氧症状，各器官或系统的生理功能都发生障碍，特别是循环、呼吸、神经、消化系统和造血器官均有改变。
一般表现为皮肤、粘膜苍白或苍黄为突出表现 ），有非特异性的大腿前部疼痛8白细胞（4000～10000/mm3)计数升高，为17,000/mm3，而其血红蛋白含量降低（在HbS中，由于带负电的极性亲水谷氨酸被不带电的非极性疏水缬氨酸所代替，致使血红蛋白的溶解度下降 ），为71g/L （一般成年男性血红蛋白<120g/L,成年女性血红蛋白<110g/L 为贫血）。
尿液分析显示有大量的白细胞。
病因:1. 血红蛋白的α-链和β-链的空间结构有何特点？维持血红蛋白四级空间结构的力量包括哪些化学键？血红蛋白是由四条多肽链组成的─二条α链(每条α链含141个氨基酸残基)和二条β链(每条β链含146个氨基酸残基)。
每条多肽链的螺旋结构形成一个疏水性的空间，可保护血红素分子不与水接触，Fe2+不被氧化。
Fe2+位于血红素卟啉环的中央，与卟啉环的4个吡咯基、O2及多肽链上的组氨酸形成六配位体。
每个血红蛋白分子可逆结合4个氧分子，每克血红蛋白可结合1.34 mL 氧气。
（2）范德华力、氢键、离子键和疏水键作用还有亚基间二硫键。
2、镰刀细胞性贫血的分子基础是什么（基因和蛋白质改变）？用什么方法可以诊断？正常的血红蛋白是由两条α链和两条β链构成的四聚体，其中每条肽链都以非共价键与一个血红蛋白相连接。
镰刀贫血
4.患者产生症状（贫血、疼痛等）的病理生理学基 4.患者产生症状（贫血、疼痛等）的病理生理学基 础是什么？
贫血: 基因发生单一碱基突变 正常β基因第 贫血: β基因发生单一碱基突变，正常 基因第 个密码子 基因发生单一碱基突变， 基因第6个密码子 为GAG，编译谷氨酸突变后变为 ，编译谷氨酸突变后变为GTG编译缬氨酸 ，谷氨 编译缬氨酸 酸是一个亲水氨基酸，氨基酸位点位于血红蛋白分子外部， 酸是一个亲水氨基酸，氨基酸位点位于血红蛋白分子外部， 易与水结合。但是缬氨酸是一个疏水氨基酸， 易与水结合。但是缬氨酸是一个疏水氨基酸，由于这样的 疏水作用，血红蛋白分子的这个位点不易与水结合， 疏水作用，血红蛋白分子的这个位点不易与水结合，水溶 性降低，众多的血红蛋白分子相互聚集沉淀， 性降低，众多的血红蛋白分子相互聚集沉淀，形成纤维状 的纤维沉淀。使得红细胞的形态结构发生变化，产生贫血。 的纤维沉淀。使得红细胞的形态结构发生变化，产生贫血。 疼痛： HbS中 疼痛：在HbS中,由于带负电的极性亲水谷氨酸被不带电的 非极性疏水缬氨酸所代替,致使血红蛋白的溶解度下降。 非极性疏水缬氨酸所代替,致使血红蛋白的溶解度下降。 在氧张力低的毛细血管区,HbS形成管状凝胶结构( ,HbS形成管状凝胶结构 在氧张力低的毛细血管区,HbS形成管状凝胶结构(如棒状 结构),导致红细胞扭曲成镰刀状(即镰变) ),导致红细胞扭曲成镰刀状 结构),导致红细胞扭曲成镰刀状(即镰变)。这种僵硬的镰 状红细胞不能通过毛细血管,加上HbS HbS的凝胶化使血液的黏 状红细胞不能通过毛细血管,加上HbS的凝胶化使血液的黏 滞度增大,阻塞毛细血管,引起局部组织器官缺血缺氧, 滞度增大,阻塞毛细血管,引起局部组织器官缺血缺氧,产 生疼痛
1. 血红蛋白的α-链和β-链的空间结构有何特点？ 血红蛋白的α 链和β 维持血红蛋白四级空间结构的力量包括哪些化学键？
红细胞镰变试验
「参考值」正常无镰状红细胞出现「临床意义」经温育后出现镰状红细胞提示有HbS，出现镰状红细胞的多少与HbS的含量有关，一般HbS平均浓度超过7%时即可有镰状红细胞出现。
因此该实验不能区别HbS特征和镰状红细胞贫血。
但也有人报导：如果HbS占100%为纯合子，称镰状红细胞贫血。
HbS占50%为杂合子，称镰状红细胞特征。
附HbS 外，HbI、Hb、Bart′s、HbC、Georgetown（HbC Harlem）HbAlexandra、Hb Memphis/s亦可出现镰状红细胞但数量很少，必要时可进一步检查。
有HbS基因的新生儿，在出生后两个月内此试验为阴性，因此时其红细胞内主要成分是HbF。
镰刀型细胞贫血病指南(罕见病诊疗指南)
106.镰刀型细胞贫血病概述镰刀型细胞贫血病（sickle cell disease，SCD）是一种常染色体显性遗传血红蛋白（Hb）病。
由于β-肽链第6位的谷氨酸被缬氨酸替代，使血红蛋白S （hemoglobin S，HbS）异常，以致红细胞呈镰刀状得名。
临床表现为慢性溶血性贫血、慢性局部缺血导致器官组织损害、易感染和再发性疼痛危象（以前也称为镰状细胞危象）。
镰状细胞综合征通常用于描述与链状细胞改变现象有关的所有疾病，包括纯合子状态、杂合子状态、HbS与其他异常血红蛋白的双杂合子状态3种主要表现形式，而镰状细胞贫血病这一术语则通常用于描述HbS的纯合状态。
病因和流行病学镰状细胞贫血病是1949年世界上发现的第一个分子病，由此开创了疾病分子生物学。
正常成人血红蛋白是由两条α链和两条β链相互结合成的四聚体，α链和β链分别由141和146个氨基酸顺序连接构成。
镰状细胞贫血患者因β链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替，形成了异常HbS，取代了正常血红蛋白（HbA），在脱氧状态时HbS分子间相互作用，聚集成为溶解度很低的螺旋形多聚体，使红细胞扭曲成镰状细胞（镰变）。
这种多聚体形似长绳状，由于其HbS的β链与邻近的β链通过疏水链连接，结构非常稳定，水溶性较氧合HbS 降低5倍以上。
纤维状多聚体与细胞膜平行紧密接触，也常与其他纤维连成线，所以当有足够多的多聚体形成时，红细胞即由正常的双凹圆盘状扭曲变为典型的新月形或镰刀形，并导致红细胞变形性显著下降。
脱氧HbS的聚合是慢性缺血、血管阻塞现象的必要条件。
红细胞内HbS浓度、脱氧程度、酸中毒、红细胞脱水程度等许多因素与红细胞镰变有关。
红细胞镰变的初期是可逆的，给予氧即可逆转镰变过程。
但当镰变已严重损害红细胞膜后，镰变就变为不可逆，即使将这种细胞置于有氧条件下，红细胞仍保持镰状。
镰变的红细胞僵硬，变形性差，可受血管的机制破坏和单核巨噬系统吞噬而发生溶血。
镰变的红细胞还可使血液黏滞性增加，血流缓慢，加之变形性差，易堵塞毛细血管引起局部缺氧和炎症反应导致相应部位产生疼痛危象，多发生于肌肉、骨骼、四肢关节、胸腹部，尤以关节和胸腹部为常见。
镰状细胞贫血症的PCR-RFLP检验
CCTNAGG GGANTCC
突变为CCTGTGG导致原有MstⅡ酶位点缺失
镰刀型细胞贫血症的PCR-RFLP检验
β珠蛋白基因的扩增产物经Mst II限制酶酶切 对酶切片段进行电泳分析 根据电泳条带的数量和大小 作出诊断
镰刀型细胞贫血症 的PCR-RFLP检验
镰刀型细胞贫血症 的PCR-RFLP检验
镰刀型细胞贫血症 ——世界上首个被揭示的“分子病”
常染色体隐性遗传病
发现于广东、广西、福建、浙江等地
临床表现：
慢性溶血性贫血 易感染 再发性疼痛危象
镰刀型细胞贫血症的病因分析
…
……
…
β珠蛋 G A G
GT G
白基因… C
TC
C AC
……
根本原因：
‘
…
第6位密码子
氨基酸 … 谷氨酸 …GAG→GT…G 缬氨酸 …
蛋白质 正常血红蛋白(HbA) 镰状血红蛋白(HbS)
红细胞
镰刀型细胞贫血症的分子检测
基于PCR技术
1. PCR-RFLP(限制性片段长度多态性分析) 2. PCR-ASO(等位基因特异性寡核苷酸探针杂交) 3. PCR-DNA测序
镰刀型细胞贫血症的PCR-RFLP检验
GCCTAG+GATCGC 粘端切口
PCR-RFLP
基因突变可能在基因结构中产生新的限制酶 酶切位点或使原有限制酶酶切位点消失
因此突变基因的扩增产物经相应的限制酶水 解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变， 根据这些改变可以判断突变是否存在
镰刀型细胞贫血症
Mst II识别位点：
β珠蛋白基因中CCTGAGG
Mst II： Monilia sitophila/好食念珠菌 中被发现的第二种限制酶
镰刀型贫血症的基因
镰刀型贫血症的基因英文回答：Hemolytic anemia is a condition characterized by the destruction of red blood cells at a rate that exceeds the body's ability to produce new ones. One specific type of hemolytic anemia is called sickle cell anemia, also known as sickle cell disease. This genetic disorder is caused by a mutation in the gene that codes for the protein hemoglobin, which is responsible for carrying oxygen in the red blood cells.In sickle cell anemia, a single nucleotide change in the gene leads to the production of an abnormal form of hemoglobin called hemoglobin S. This abnormal hemoglobin causes the red blood cells to become stiff and crescent-shaped, resembling a sickle or a crescent moon. Thesesickle-shaped cells are more prone to getting stuck in blood vessels, leading to blockages and reduced blood flow.The gene responsible for sickle cell anemia is called HBB, which stands for hemoglobin beta. It is located on chromosome 11. The mutation that causes sickle cell anemia is a substitution of the nucleotide adenine (A) with thymine (T) in the HBB gene. This change results in the substitution of the amino acid glutamic acid with valine in the hemoglobin protein.Sickle cell anemia is an inherited disorder, which means it is passed down from parents to their children. To develop sickle cell anemia, a person must inherit two copies of the mutated HBB gene, one from each parent. If a person inherits only one copy of the mutated gene, theywill have sickle cell trait, which is a milder form of the disease.中文回答：镰刀型贫血症是一种特定类型的溶血性贫血，其特点是红细胞的破坏速度超过了身体产生新红细胞的能力。
镰刀形细胞贫血症
明(红细胞)镰变的过程可能是与红细胞内
血红蛋白的状态和性质密切相关的。鲍林
将正常人、镰刀型细胞贫血症患者和镰刀
型细胞贫血症基因携带者的血红蛋白,分
别放在一定的缓冲溶液中电泳,发现正常
人和患者的血红蛋白的电泳图谱明显不同,
而携带者的血红蛋白的电泳图谱,与由正 鲍林是著名的量子化学
常人的和患者的血红蛋白以1:1的比例配 家，他在化学的多个领
格拉德温等人１０日在网络版《自然医学》杂志发 表论文指出，一氧化氮能够通过松弛血管而调节血压， 当它被自由循环的血红蛋白“清除”后，血管可能产生 不必要的收缩，从而进一步加重患者的病痛。
这一新结果意味着，吸入一氧化氮气体，也许可以 缓解镰刀形红细胞贫血症患者的痛感。
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美国国家卫生研究所格拉德温等人的最新研究发现， 对这种痛感起重要作用的可能还有由变形红细胞释放进 入血液的血红蛋白。血红蛋白存在于极易碎裂的红细胞 中，其功能是运送氧到血液中去。研究人员发现，当这 些血红蛋白以自由状态进入血液循环后，其与一氧化氮 产生反应的速度，将比在红细胞中时快出上千倍，一氧 化氮因此而被过度“清除”。
预防方法
• 镰刀型贫血症只会出现于夫妇俩人皆为镰 刀形细胞贫血症携带者的家庭。因此，建 议所有的镰刀形细胞贫血症携带者均应接 受遗传咨询(非洲裔美国人为携带者的机率 为1/12)。
• 对胎儿进行镰刀型贫血症的产前诊断也是 一个很有效的方法。
• 对于镰刀型红细胞贫血症患者而言，在受 到感染时给予及时的治疗、维持适当的氧 气量及避免脱水的状况，如此可以避免红 血球细胞受到更大的伤害。
一氧化氮或可减轻镰刀形红细胞贫血症 患者痛感
镰刀型细胞贫血症遗传方式
镰刀型细胞贫血症遗传方式镰刀型细胞贫血症，听上去是不是有点复杂？其实这个病就是因为一种基因问题，让你的红细胞变得像镰刀一样弯曲，没错，不是普通的圆圆的，而是像个小镰刀，真是让人哭笑不得。
想象一下，原本应该在血液中流畅游动的细胞，结果却变得“拐弯抹角”，这可不是什么好消息。
正常情况下，红细胞就像小船一样，顺顺利利地在血管里游来游去。
但一旦你有了镰刀型细胞贫血，哎呀，这些小船就开始“撞墙”了，真的让人心烦。
这个病的遗传方式其实挺简单的。
如果你爸爸妈妈都是镰刀型细胞的携带者，那么你就有可能“继承”这一遗传。
可是你想啊，他们并不一定得病。
就像彩票一样，买了不一定中，很多人携带基因却生活得好好的。
所以，镰刀型细胞贫血症的遗传方式是一种常染色体隐性遗传，听起来有点儿高深，但说白了就是你得两个“坏基因”才能真正得病。
如果只得了一个，那你就成了“携带者”，但是身体没啥感觉。
这个病的症状嘛，通常就是感觉疲惫，容易感到疼痛，时不时还得去医院跑个几趟，医生一看就知道你是“镰刀户”。
还记得有个朋友，老是说自己“心累”，结果去医院检查，哎呀，被诊断出来镰刀型细胞贫血，真是让人哭笑不得。
不过，虽然这个病不容易，但现代医学的发展真是让人感到希望。
各种治疗手段层出不穷，有些人甚至可以通过骨髓移植获得新生，简直是“逆袭”人生。
说到这里，很多人可能会想：这病怎么治啊？治疗方法主要有几种。
比如说，药物治疗就是一个选择，医生会根据你的情况来开不同的药物，帮助你缓解症状，增加红细胞的数量。
还有就是定期输血，这就像是给身体加油，帮助它更好地运转。
保持健康的生活方式也很重要，多吃点绿色蔬菜，少熬夜，别让自己太累，免得病情加重。
就算生活再忙，也得给自己留点儿时间“充电”。
面对这种病，心理健康也不可忽视。
很多人因为这个病变得焦虑、抑郁，觉得生活失去了光彩。
跟朋友聊聊，参加一些支持小组，能够有效帮助你走出阴霾。
生活中要有乐趣，多做自己喜欢的事情，培养一些爱好，打打球、听听音乐，笑笑和朋友们聚会，别让自己一直沉浸在病痛中。
镰刀型细胞贫血突变位点
镰刀型细胞贫血突变位点镰刀型细胞贫血是一种常见的遗传性血液疾病，其特征是红细胞形态异常，呈现出镰刀状的形态。
这种形态变化会导致血细胞的黏附性增加，从而引发一系列严重的健康问题。
在研究中发现，镰刀型细胞贫血与一种特定的基因突变有关，这个突变位点是在基因的第六个碱基对中。
当一个人携带了这个基因突变，他们就有可能患上镰刀型细胞贫血。
这种突变会影响到一种叫做血红蛋白的蛋白质，在正常情况下，血红蛋白能够运输氧气到身体各处。
然而，基因突变会让血红蛋白的结构发生变化，导致它变得不稳定，容易聚集在一起形成红细胞内的长链状物质。
这些链状物质会引起红细胞改变形态，变得尖锐而且刚硬，就像一把镰刀一样。
由于这种变形，镰刀型红细胞很难通过细小的血管，导致血液供应不畅。
这时，红细胞就会在血管中阻塞，引发疼痛和组织缺氧。
此外，这些变形的红细胞寿命较短，正常红细胞寿命大约120天，而镰刀型红细胞仅为10到20天，导致患者的贫血状况加重。
然而，镰刀型细胞贫血不仅仅是一种血液疾病，它也会对整个身体产生影响。
例如，患者可能经常出现疼痛发作，这是由于红细胞堵塞血管引发的。
这些疼痛发作不仅令人痛苦，还会严重影响患者的生活质量。
此外，由于组织缺氧，患者还可能出现溃疡、感染、脑卒中等并发症。
针对镰刀型细胞贫血的治疗主要包括缓解疼痛、预防疾病发作和改善贫血状况。
对于疼痛发作，可通过镇痛药来缓解患者的不适；预防发作需采取一些措施，如保持充足的水分摄取、避免过度疲劳、避免高海拔和低氧环境等；对于贫血，可通过输血和药物治疗来提高红细胞的数量和质量，改善患者的贫血状况。
然而，随着科技的进步，基因治疗正逐渐成为治疗镰刀型细胞贫血的新思路。
通过干细胞移植和基因编辑技术，可以修复患者体内的异常基因，使红细胞恢复正常形态，从而治愈这种疾病。
这种治疗方法尚处于探索阶段，但已经给人们带来了希望。
总的来说，镰刀型细胞贫血是一种严重的遗传性血液疾病，其突变位点位于基因的第六个碱基对。
镰状细胞贫血诊断与治疗PPT
镰状细胞贫血诊断 与治疗
汇报人：
时间：20XX-XX-XX
目录
01
02
03
04
05
镰状细胞贫 血的诊断
镰状细胞贫 血的治疗
镰状细胞贫 血的预防
镰状细胞贫 血的护理与 康复
镰状细胞贫 血的并发症 及其处理
PART 1
镰状细胞贫血的诊断
临床表现
贫血：面色苍白、乏力、心悸等
感染：易发生感染，如肺炎、尿 路感染等
重程度
诊断标准
血红蛋白S（HbS）基因突变
镰状细胞贫血基因的连锁不平衡
血红蛋白S（HbS）基因与血红蛋 白C（HbC）基因的复合突变
镰状细胞贫血基因的连锁不平衡 与血红蛋白S（HbS）基因的复合 突变
鉴别诊断
红细胞形态学检查：观察红细胞形态，判断是 否为镰状细胞贫血
血红蛋白电泳：检测血红蛋白类型，判断是否 为镰状细胞贫血
镰状细胞危象：红细胞变形，导致血管阻 塞
镰状细胞肾病：红细胞变形，导致肾脏损 伤
镰状细胞肺病：红细胞变形，导致肺部损 伤
镰状细胞骨病：红细胞变形，导致骨骼损 伤
并发症处理原则
预防感染：保持良好的卫生习惯，避免接触感染源 控制疼痛：使用止痛药，如非甾体抗炎药或阿片类药物 预防血栓：使用抗凝血药物，如肝素或华法林 预防肾衰竭：定期监测肾功能，及时调整药物剂量 预防心肺并发症：定期进行心肺功能检查，及时治疗心肺疾病 预防眼部并发症：定期进行眼科检查，及时治疗眼部疾病
基因检测：检测镰状细胞贫血相关基因，判断 是否为镰状细胞贫血
骨髓检查：观察骨髓中红细胞形态，判断是否 为镰状细胞贫血
家族史调查：了解家族中是否有镰状细胞贫血 病史，判断是否为镰状细胞贫血
镰刀型细胞贫血症的遗传机制_概述及解释说明
镰刀型细胞贫血症的遗传机制概述及解释说明引言是文章的开场白，它对主题进行了概述并介绍了文章的结构和目的。
在这篇关于镰刀型细胞贫血症遗传机制的长文中，引言将包括以下内容：1.1 概述：镰刀型细胞贫血症（Sickle Cell Anemia，简称SCA）是一种常见的遗传性血液疾病，它主要影响到人体内的红细胞，并导致氧气供应不足。
SCA在全球范围内广泛存在，在一些地区甚至呈高发态势。
其严重程度因个体而异，但患者通常会经历严重的疼痛发作、溶血性贫血以及各种可能损害脏器功能的并发症。
1.2 文章结构：本文将从三个方面来阐述镰刀型细胞贫血症遗传机制：首先介绍镰刀型细胞贫血症的基本情况和相关知识；接着分析该疾病的遗传基础以及造成发生过程变化的分子机制；最后对已有成果进行总结并展望未来的研究方向，同时给出临床管理方面的建议。
1.3 目的：本文旨在提供一个关于镰刀型细胞贫血症遗传机制的综述，并通过深入剖析该疾病相关基因及分子过程来促进对其治疗和预防方法的进一步研究。
同时，本文希望为临床医生和患者提供一些建议以更好地管理镰刀型细胞贫血症患者的健康。
以上是“1. 引言”部分内容的详细清晰撰写。
2. 镰刀型细胞贫血症介绍:2.1 定义与历史背景:镰刀型细胞贫血症是一种遗传性血液疾病，主要影响红细胞的形态和功能。
它最早被描述于20世纪初，在非洲地中海沿岸地区首次发现。
镰刀型细胞贫血症得名于其引起的异常红细胞形态，这些受影响的红细胞呈半月形或弯曲的外观，类似于锚爪中的镰刀。
2.2 病因和发病机制:镰刀型细胞贫血症是由基因突变引起的遗传疾病。
正常情况下，红细胞内含有一种称为血红蛋白（Hb）的蛋白质，它们帮助携带氧输送到身体各个部位。
然而，在镰刀型细胞贫血症患者中，出现了一种称为HbS的异常变异形式，这导致了正常Hb结构的改变。
当体内氧气水平降低或在高度负荷的情况下，HbS会聚集并形成红细胞内的不稳定链。
这种聚集导致红细胞变得更加脆弱和易碎。
镰状细胞贫血基因
镰状细胞贫血是一种由基因突变引起的疾病。
正常的血红蛋白是由4条肽链构成的一种蛋白质，其中肽链由氨基酸组成。
在镰状细胞贫血患者体内，组成血红蛋白分子的多肽链上发生了一个氨基酸的替换，而这一氨基酸的变化是由于控制合成血红蛋白分子的DNA的碱基序列发生了改变。
这种基因突变可以来自父母遗传，也可以是新发生的突变。
镰状细胞贫血症患者的红细胞会由正常的圆饼状变为弯曲的镰刀状，这使得红细胞极易破裂，从而导致患者发生溶血性贫血，严重时甚至会导致死亡。
到目前为止，镰状细胞贫血还没有有效的治疗方法，但随着基因工程技术的发展，人们可以建立相应转基因小鼠模型，用于测试各种治疗方法，以期摸索出一套治疗方案。
镰状细胞贫血症的点杂交检验 ppt
镰状细胞贫血症的点杂交检验摘要：什么是点杂交技术？什么是反向点杂交技术？它们是如何来诊断镰状细胞贫血症的呢？知识点：点杂交、ASO探针、反向点杂交（RDB）镰状细胞贫血症( Sicklemia )的分子致病机制图片源于网络非原创β珠蛋白基因 根本原因： 第6位密码子 GAG→GTG G C G C A T … … … … G C G C T A … …… … … 谷氨酸 … … 缬氨酸 … 正常血红蛋白(HbA) 镰状血红蛋白(HbS) 氨基酸 蛋白质 红细胞 镰状细胞贫血症的病因分析镰状细胞贫血症的检验1. Southern 印迹杂交（简悦威, 1978）2. 点杂交（dot blot）——印迹杂交将核酸变性后直接点样于固相支持物上，然后与特异性探针进行杂交并检测3. ……镰状细胞贫血症的点杂交检验等位基因特异寡核苷酸探针(allele-specific oligonucleotide probe, ASO probe) 野生型探针突变型探针镰状细胞贫血症的点杂交检验样本1 2 3结果分析：β珠蛋白基因是否正常镰状细胞贫血患者是纯合子还是杂合子？判读结果等位基因特异寡核苷酸(ASO)探针杂交技术针对突变位点已知的基因，设计一对寡核苷酸探针，一条为野生型探针，其与正常序列互补；一条为突变型探针（突变碱基位于探针中央），其与突变序列互补，用二者分别与受检者DNA 进行分子杂交ASO探针杂交技术（野生型探针N & 突变型探针M）1. 样本只与M杂交，表明为纯合子；2. 样本与N、M都能杂交，表明为杂合子；3. 样本只与N杂交，表明？4. 样本与N、M都不杂交，表明？点杂交 (dot blot)将核酸变性后点样于固相支持物上，然后与特异性探针进行杂交并检测反向点杂交(reverse dot blot, RDB) 将多种探针点样于固相支持物上，然后与待测样本进行杂交并检测RDB可一次性筛查多种靶核酸序列反向点杂交(reverse dot blot, RDB) 项目名称标本类型检测方法地中海贫血基因突变检测全套(α+β) EDTA抗凝血Gap-PCRPCR-RDBα地中海贫血基因突变检测EDTA抗凝血Gap-PCRPCR-RDBβ地中海贫血基因突变检测EDTA抗凝血PCR-RDB反向点杂交的临床应用1. 遗传性疾病检验地中海贫血症、苯丙酮尿症……2. 感染性疾病检验乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒……3. ……镰状细胞贫血症的点杂交检验。
镰刀型细胞贫血症基因的检测方法
湖北当阳一中沈满弟限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA 探针来检测是否存在基因变异。
当待测DNA 序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。
如：（2005 湖北3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。
检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 A.解旋酶B.DNA 连接酶C.限制性内切酶D.RNA 聚合酶解析：根据碱基互补配对原则可采用DNA 分子杂交原理或DNA 探针的方法。
采用加热等一定的技术手段将患者的DNA 分子片段与正常人的DNA 分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链。
解旋酶的作用是DNA 分子在复制或转录时将DNA 双链解开，在本题中加热也可以解开达到目的，所以不是必须的酶；DNA 连接酶和限制性内切酶都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA 分子的基本骨架上脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，DNA 连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。
而RNA 聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成mRNA 分子的酶，本题就是采用限制性内切酶分析法解题的。
必须使用的酶就是限制性内切酶，故选C。
根据DNA 分子杂交原理知，将患者的DNA 分子片段与正常人的DNA 分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链，有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将其切开再杂交呢？回答这个问题我们先看看。
2008 天津30-Ⅰ下图为人β -珠蛋白基因与其mRNA 杂交的示意图，①-⑦表示基因的不同功能区。
从本题看出基因的单链的编码区与其转录的成熟的mRNA 之间可以杂交形成杂合链，但是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子对应的单链部分——③⑤所含有的上百个核苷酸，mRNA 根本没有对应互补的部分，这就说明它们之间相差很大也能够杂交，只不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因只有一个碱基发生突变，难道用正常基因转录的mRNA 就不能与只突变一个碱基的基因杂交形成杂合链吗？应该是肯定可以,如果这样来检测，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因的检测结果是相同的，就找不到区别，无法鉴别。
镰状细胞贫血症的Southern印迹杂交检验 ppt
镰状细胞贫血症的Southern印迹检验摘要：Southern印迹是如何来诊断镰状细胞贫血症的呢？知识点：镰状细胞贫血症限制性核酸内切酶、Mst II、回文结构Southern印迹杂交技术流程图图片源于网络非原创应用Southern印迹杂交技术诊断镰状细胞贫血症 (Sicklemia ) ？镰状细胞贫血症（ Sicklemia ）？镰状细胞贫血症常染色体隐性遗传病发现于广东、广西、福建、浙江等地临床表现：慢性溶血性贫血发病机制？易感染再发性疼痛危象β珠蛋白基因 根本原因： 第6位密码子 GAG→GTG G C G C A T … … … … G C G C T A … …… … … 谷氨酸 … … 缬氨酸 … 正常血红蛋白(HbA) 镰状血红蛋白(HbS) 氨基酸 蛋白质 红细胞 镰状细胞贫血症的病因分析镰状细胞贫血症缺失1个Mst II 位点Mst II ： M onilia s i t ophila 好食念珠菌中被发现的第二种限制性核酸内切酶β珠蛋白基因：在镰状细胞HbS 基因中消失Mst II酶切位点（回文结构）：C C T N A G GG G A N T C C正常HbA基因：C C T G A G G异常HbS 基因：C C TGT G GMst II图片源于网络非原创提取全基因组DNA用Mst II消化基因组DNA与特异性探针杂交应用Southern 印迹技术诊断镰状细胞贫血症1. 提取待检者全基因组DNA并用Mst II进行消化，2. 消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离，3. 凝胶上DNA经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定，5. 膜经预杂交后与β珠蛋白基因特异探针进行杂交，6. 洗涤去除未杂交的探针后进行放射性自显影，7.通过显影片段长度的多态性明确被检基因是否含有突变镰状细胞贫血症的Southern印迹检验。
12-4-镰状细胞贫血病的基因诊断
N：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）
P 13 kb 7.6 kb
10
思考题：
基于镰状细胞贫血病的发生，还可以 利用哪些基因诊断技术？并依此设计
实验方案。
11
0.2 kb
正常 纯合
突变 杂合
突变 纯合
6
MstⅡ酶切位点（ 5´- CCTNAGG-3´） (CCT GAG G)
5′
3′
1.15 kb 0.2kb
正常基因
(CCT GTG G)
5′
3′
1.35 kb
突变基因
7
3. 镰状细胞贫血病的的PCR-RFLP分析
【插入PCR-RFLP动画】
8
3. 镰状细胞贫血病的的PCR-RFLP分析
正常人的扩增产物经 Mst Ⅱ消化可生成54 bp和56 bp两个片段（1），而 镰状细胞贫血症患者的DNA片段不被酶切，仍为110 bp（2），杂合子 可见三条带（3）
9
4. 镰状细胞贫血病的间接基因诊断：
RFLP标记的连锁分析
7.6 kb
HpaⅠ
正
常
*
β RFLP
NH
13 kFLP
A
B
C
A
B
C
正常 纯合
突变 杂合
突变 纯合
N：正常；M：突变
4
2. 镰状细胞贫血病的Sourthern Blot分析
MstⅡ酶切位点（ 5´- CCTNAGG-3´） (CCT GAG G)
5′
3′
1.15 kb 0.2kb
正常基因
(CCT GTG G)
5′
3′
1.35 kb
突变基因
5
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湖北当阳一中沈满弟限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA 探针来检测是否存在基因变异。
当待测DNA 序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。
如：（2005 湖北3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。
检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 A.解旋酶 B.DNA 连接酶 C.限制性内切酶 D.RNA 聚合酶解析：根据碱基互补配对原则可采用DNA 分子杂交原理或DNA 探针的方法。
采用加热等一定的技术手段将患者的DNA 分子片段与正常人的DNA 分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链。
解旋酶的作用是DNA 分子在复制或转录时将DNA 双链解开，在本题中加热也可以解开达到目的，所以不是必须的酶；DNA 连接酶和限制性内切酶都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA 分子的基本骨架上脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，DNA 连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。
而RNA 聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成mRNA 分子的酶，本题就是采用限制性内切酶分析法解题的。
必须使用的酶就是限制性内切酶，故
选C。
根据DNA 分子杂交原理知，将患者的DNA 分子片段与正常人的DNA 分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变
的部位则仍然是两条游离的单链，有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将其切开再杂交呢？回答这个问题我们先看看。
2008 天津30-Ⅰ下图为人β -珠蛋白基因与其mRNA 杂交的示意图，①-⑦表示基因的不同功能区。
从本题看出基因的单链的编码区与其转录的成熟的mRNA 之间可以杂交形成杂合链，但是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子对应的单链部分——③⑤所含有的上百个核苷酸，mRNA 根本没有对应互补的部分，这就说明它们之间相差很大也能够杂交，只不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因只有一个碱
基发生突变，难道用正常基因转录的mRNA 就不能与只
突变一个碱基的基因杂交形成杂合链吗？应该是肯定可以,如果这样来检测，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因的
检测结果是相同的，就找不到区别，无法鉴别。
所以必
须采用限制性内切酶分析法来检测才有效，具体是先找到
一种限制性内切酶，切开控制镰刀型细胞贫血症基因的对应部位的正常基因，这样就形成两短段，也同同一种酶来
切镰刀型细胞贫血症基因，因为镰刀型细胞贫血症基因发
生了一个碱基的突变，这样相同的限制性内切酶就无法切
开，就还是完整的一长段，在用以上三段对应的已标记的mRNA 进行杂交（此过程可以不用任何酶，通过控制温度
来打开氢键和连结氢键），然后电泳，如果出现两短段的
则是正常基因，如果只出现一长段则是突变基因，如果都
有的说明两者都存在，可视为杂合。
利用相关知识点命题
的请看如下高考试题。
〔2007江苏·38〕单基因遗传病可
以通过核酸杂交技术进行早期诊断。
镰刀型细胞贫血症是
一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。
已知红细
胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者
的基因型为bb。
有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携
带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前
诊断。
下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示意图。
(1)从图中可见，该基因突变是由于碱基对改变(或A变成T) 引
起的。
巧合的是，这个位点的突变使得原来正常基因的限
制酶切割位点丢失。
正常基因该区域上有3个酶切位点，
突变基因上只有2个酶切位点，经限制酶切割后，凝胶电
泳分离酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正
常基因显示 2 条，突变基因显示 1 条。
(2)DNA或RNA
分子探针要用放射性同位素(或荧光分子等) 等标记。
利用
核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷酸序列(…ACGTGTT…)，写出作为探针的核糖核苷酸序列…UGCACAA… 。
(3)根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿
是否会患有镰刀型细胞贫血症。
这对夫妇4次妊娠的胎儿Ⅱ-l～II-4中基因型BB的个体是Ⅱ一l和Ⅱ一4 ，Bb的个体是Ⅱ一3 ，bb的个体是Ⅱ一2 。
解析:比较基因B 和和突变后的基因b 的碱基组成，发现它们的差别仅是B 基因一条链某一位点上的碱基A 突变成b 基因一条链某一位点上的碱基T（实质上对应的另一条链上的碱基也发生了改变）。
据图观察，正常基因B 经限制酶切割后，凝胶电泳分裂酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是二条，而突变后的基因b 经限制酶切割后，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是一条。
所以，在分析推断胎儿Ⅱ-1～Ⅱ-4 的基因型时，可以这样认为：基因型Bb 的个体同时带有B 基因和b 基因，所以其应同时含有与B 基因对应的二条带谱，与b 基因对应的一条带谱（这也可以从Ⅰ-1 和Ⅰ-2 得到验证）。
符合这个条件的仅有Ⅱ-3。
同理，基因型为BB 的个体应仅有与B 基因相对应的二条带谱，符合条件的是Ⅱ-1 和Ⅱ-4。
bb 的个体是只能是含有与 b 基因相对应的一条带谱，为Ⅱ-2。
作为探针的必要条件之一是要易于识别，所以可用放射性同位素或荧光分子等进行标记。
既可以用脱氧核苷酸链作探针，也可以用核糖核苷酸链作探针，题干中明确要求用核糖核苷酸链，所以，特别要注意当DNA 链上的碱基是A 时，作探针用的RNA 链上的碱基应为U。
通过如上分析可知，限制性
内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA 探针来检测的方法，即是酶切和核酸分子杂交两种技术的综合分析方法。
核酸分子杂交技术在体外进行的时候可以不用相关酶，但是限制性内切酶无法用温度等外界环境的控制来代替。
限制性内切酶分析法现在的使用很广泛，如：在柯萨奇 B 组病毒B1-B6 型检测及分型中的应用---- 利用GCG 软件对柯萨奇B1-B6 型病毒cDNA 全序列进行了限制性内切酶酶切位点的分析，目前从理论上推测该方法几乎可以检测所有遗传病的变异基因，近几年高考试题也是屡屡出现, 所以特别提醒广大师生在高考复习备考过程中应多加重视。
---ACGT ．GTT--- ---ACGAGTT--- 正常的血红蛋白基因B 突变的血红蛋白基因b 图注:↑限制酶酶切点·突变碱基探针杂交区域带谱I II 1 1 2 2 3 4 凝胶电泳分离酶切片与探针杂交显示的带谱。