镰刀型细胞贫血症基因的检测要领

湖北当阳一中沈满弟限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA 探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA 序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。如：（2005 湖北3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 A.解旋酶 B.DNA 连接酶 C.限制性内切酶 D.RNA 聚合酶解析：根据碱基互补配对原则可采用DNA 分子杂交原理或DNA 探针的方法。采用加热等一定的技术手段将患者的DNA 分子片段与正常人的DNA 分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链。解旋酶的作用是DNA 分子在复制或转录时将DNA 双链解开，在本题中加热也可以解开达到目的，所以不是必须的酶；DNA 连接酶和限制性内切酶都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA 分子的基本骨架上脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，DNA 连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。而RNA 聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成mRNA 分子的酶，本题就是采用限制性内切酶分析法解题的。必须使用的酶就是限制性内切酶，故

选C。根据DNA 分子杂交原理知，将患者的DNA 分子片段与正常人的DNA 分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变

的部位则仍然是两条游离的单链，有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将其切开再杂交呢？回答这个问题我们先看看。2008 天津30-Ⅰ下图为人β -珠蛋白基因与其mRNA 杂交的示意图，①-⑦表示基因的不同功能区。从本题看出基因的单链的编码区与其转录的成熟的mRNA 之间可以杂交形成杂合链，但是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子对应的单链部分——③⑤所含有的上百个核苷酸，mRNA 根本没有对应互补的部分，这就说明它们之间相差很大也能够杂交，只不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因只有一个碱

基发生突变，难道用正常基因转录的mRNA 就不能与只

突变一个碱基的基因杂交形成杂合链吗？应该是肯定可以,如果这样来检测，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因的

检测结果是相同的，就找不到区别，无法鉴别。所以必

须采用限制性内切酶分析法来检测才有效，具体是先找到

一种限制性内切酶，切开控制镰刀型细胞贫血症基因的对应部位的正常基因，这样就形成两短段，也同同一种酶来

切镰刀型细胞贫血症基因，因为镰刀型细胞贫血症基因发

生了一个碱基的突变，这样相同的限制性内切酶就无法切

开，就还是完整的一长段，在用以上三段对应的已标记的mRNA 进行杂交（此过程可以不用任何酶，通过控制温度

来打开氢键和连结氢键），然后电泳，如果出现两短段的

则是正常基因，如果只出现一长段则是突变基因，如果都

有的说明两者都存在，可视为杂合。利用相关知识点命题

的请看如下高考试题。〔2007江苏·38〕单基因遗传病可

以通过核酸杂交技术进行早期诊断。镰刀型细胞贫血症是

一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。已知红细

胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者

的基因型为bb。有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携

带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前

诊断。下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示意图。(1)从图中可见，该基因突变是由于碱基对改变(或A变成T) 引

起的。巧合的是，这个位点的突变使得原来正常基因的限

制酶切割位点丢失。正常基因该区域上有3个酶切位点，

突变基因上只有2个酶切位点，经限制酶切割后，凝胶电

泳分离酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正

常基因显示 2 条，突变基因显示 1 条。(2)DNA或RNA

分子探针要用放射性同位素(或荧光分子等) 等标记。利用

核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷酸序列(…ACGTGTT…)，写出作为探针的核糖核苷酸序列…UGCACAA… 。(3)根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿

是否会患有镰刀型细胞贫血症。这对夫妇4次妊娠的胎儿Ⅱ-l～II-4中基因型BB的个体是Ⅱ一l和Ⅱ一4 ，Bb的个体是Ⅱ一3 ，bb的个体是Ⅱ一2 。解析:比较基因B 和和突变后的基因b 的碱基组成，发现它们的差别仅是B 基因一条链某一位点上的碱基A 突变成b 基因一条链某一位点上的碱基T（实质上对应的另一条链上的碱基也发生了改变）。据图观察，正常基因B 经限制酶切割后，凝胶电泳分裂酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是二条，而突变后的基因b 经限制酶切割后，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是一条。所以，在分析推断胎儿Ⅱ-1～Ⅱ-4 的基因型时，可以这样认为：基因型Bb 的个体同时带有B 基因和b 基因，所以其应同时含有与B 基因对应的二条带谱，与b 基因对应的一条带谱（这也可以从Ⅰ-1 和Ⅰ-2 得到验证）。符合这个条件的仅有Ⅱ-3。同理，基因型为BB 的个体应仅有与B 基因相对应的二条带谱，符合条件的是Ⅱ-1 和Ⅱ-4。bb 的个体是只能是含有与 b 基因相对应的一条带谱，为Ⅱ-2。作为探针的必要条件之一是要易于识别，所以可用放射性同位素或荧光分子等进行标记。既可以用脱氧核苷酸链作探针，也可以用核糖核苷酸链作探针，题干中明确要求用核糖核苷酸链，所以，特别要注意当DNA 链上的碱基是A 时，作探针用的RNA 链上的碱基应为U。通过如上分析可知，限制性

内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA 探针来检测的方法，即是酶切和核酸分子杂交两种技术的综合分析方法。核酸分子杂交技术在体外进行的时候可以不用相关酶，但是限制性内切酶无法用温度等外界环境的控制来代替。限制性内切酶分析法现在的使用很广泛，如：在柯萨奇 B 组病毒B1-B6 型检测及分型中的应用---- 利用GCG 软件对柯萨奇B1-B6 型病毒cDNA 全序列进行了限制性内切酶酶切位点的分析，目前从理论上推测该方法几乎可以检测所有遗传病的变异基因，近几年高考试题也是屡屡出现, 所以特别提醒广大师生在高考复习备考过程中应多加重视。---ACGT ．GTT--- ---ACGAGTT--- 正常的血红蛋白基因B 突变的血红蛋白基因b 图注:↑限制酶酶切点·突变碱基探针杂交区域带谱I II 1 1 2 2 3 4 凝胶电泳分离酶切片与探针杂交显示的带谱