五种电泳技术的比较

五种电泳技术的比较-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

五种电泳技术的比较

SDSPAGE

名词解释：

相对迁移率（Rf）

问答题:

1.简述SDS-PAGE的基本原理。

2.影响SDS电泳的关键因素有哪些

AGE

名词解释

1.迁移率

2.电渗

3.电泳

问答题

1.影响电泳迁移率的因素有哪些？

2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。

CAME

1.CAME的基本原理是什么？

2.CAME分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？

PAGE

名词解释

1.凝胶总浓度

2.交联度

问答题

1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。

2.试比较CAME与PAGE操作的区别。

3.简述不连续PAGE的原理。

1.琼脂糖凝胶电泳Agarose Gel Electrophoresis

Gel Electrophoresis ：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。

特点（characteristic）：

1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。

2. 电泳操作方法简便，电泳速度快。

3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。

4. 适用于生化，免疫等定性定量测定。

（一）优点（advantage)

1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗。

2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。

3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。

4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。

5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定。

6.有热可逆性。

（二）缺点(disadvantage)

1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。

2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。

3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。

4.与PAGE相比，分子筛(molecular sieve)作用小，区带少。

应用

1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化

2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测

3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标

影响迁移的因素

the size of the molecule

conformation of the molecule

the agarose concentration of a gel

Voltage

百分浓度和分辨率限制

Most agarose gels are made with between 0.7% (good separation or

resolution of large 5–10kb DNA fragments) and 2% (good resolution for

small 0.2–1kb fragments) agarose dissolved in electrophoresis buffer.

Up to 3% can be used for separating very tiny fragments but a vertical

polyacrylamide gel 聚丙烯酰胺is more appropriate in this case.

Low percentage gels are very weak and may break when you try to lift them.

High percentage gels are often brittle and do not set evenly. 1% gels are

common for many applications.

琼脂糖凝胶分离血浆脂蛋白

原理：血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。

pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负极到正极；VLDL为圆

形，受阻力小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。

加样槽在负极，由负极到正极分别是CM\LDL\VLDL\HDL

2.醋酸纤维薄膜电泳Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME

特点：低吸附作用，低电渗作用，样本用量少，亲水性

1.Low sorption

2.Low electroosmosis

3.Small sample

4.Hydrophilic

电泳图谱不齐

①点样时血清点加不均匀

②薄膜局部干燥

③电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少

④缓冲液变质

⑤电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行

电泳图谱分理不清

①点样时血清点加不均匀

②薄膜局部干燥

③电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少

④缓冲液变质

⑤电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行

电泳速度慢

电流过低

供给薄膜的液量不足

缓冲液离子强度过高

薄膜中杂质

白蛋白区带中间部分不着色，染色不足

染色时间不够、点样过多

γ球蛋白向反方向移动

电渗现象，可提高缓冲液液面或加大电流量以改进

区带一边长一边短呈扭曲现象

薄膜未紧压在电泳槽的滤纸桥上，使薄膜接触不良而增大了电阻。

区带拖尾或区带过于紧密

缓冲液离子强度＜0.05可出现区带拖尾；离子强度＞0.075可出现区带过于紧密。

血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳Separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis

[原理] CAME是以醋纤膜（CAM）作支持物的一种区带电泳技术。

将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。加样：用加样器蘸取血清约5ul，垂直印在CAM粗糙面，点样区距离边缘约1.5cm，电泳时点样面朝下。加上槽盖平衡5分钟后再通电。电压10~15V/cm膜总宽。电泳40~60分钟，泳动距离约达3.5~4cm时即可断电。

由负极到正极可分为五条条带

γβα2 α1 白蛋白

3.聚丙烯酰胺凝胶电泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE

PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N’-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N’，N’-methylene bisacrylamide，Bis）交联剂通过自由基（ free radicals）聚合而成的一种多孔三维网状结构。

过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（-N,N,N',N'-tetramethylethylene diamine , TEMED）为加速剂。

¬TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合

-分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧

®升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合

PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。

Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性；

＜10 很脆，易碎，不透明；

＞100 糊状不成形，易破碎

常用的标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶