小鼠脑组织病理总结

HE
—70°烤片一夜 ° —二甲苯 个每个 分钟无水乙醇，95%， 二甲苯3个每个 分钟无水乙醇， 二甲苯 个每个10分钟无水乙醇 ， 90%，85%，80%每个 分钟 每个5分钟 ， ， 每个 —苏木素 分 苏木素1-5分 苏木素 —水 水 —盐酸酒精 盐酸酒精 —水 水 —0.5%氨水 氨水
—水 水 —95%酒精 分 酒精2分 酒精 —0.5%醇溶伊红 秒 醇溶伊红1秒 醇溶伊红 —95%酒精 秒 酒精30秒 酒精 —95%酒精，无水乙醇（3个）每个 分 酒精， 酒精 无水乙醇（ 个 每个2分 —二甲苯（2个）每个2分钟 二甲苯（ 个 每个 分钟 二甲苯 —中性树胶封片，吹干 中性树胶封片， 中性树胶封片
病理相关试剂配制
• 4%多聚甲醛：40g多聚甲醛粉末溶于 多聚甲醛： 多聚甲醛粉末溶于 多聚甲醛粉末溶于500ml 多聚甲醛 水（50°左右）黄枪头加一滴 氢氧化钠 °左右）黄枪头加一滴1M氢氧化钠 至澄清，冷却至室温， 至澄清，冷却至室温，与500ml0.2MPBS混 混 滤纸过滤。 合，滤纸过滤。 • 0.2MPB:1000ml 0.2M磷酸氢二钠 磷酸氢二钠810ml称57.996g 磷酸氢二钠 称 0.2M磷酸二氢钠 磷酸二氢钠190ml称5.928g 磷酸二氢钠 称 • 蔗糖：用0.1MPBS配制 蔗糖： 配制 • 生理盐水：0.85%氯化钠溶液 生理盐水： 氯化钠溶液
组化实验设计
1.对常规组织切片进行仔细观察 根据可提供 对常规组织切片进行仔细观察,根据可提供 对常规组织切片进行仔细观察 形态学特点,选择最佳并能反映病变的组织标 形态学特点 选择最佳并能反映病变的组织标 本 2.列出免疫组化的指标 列出免疫组化的指标 3.进行预实验 设立阳性、阴性对照 进行预实验(设立阳性 进行预实验 设立阳性、阴性对照) 4.找出抗体的最佳修复方法、稀释度、孵育 找出抗体的最佳修复方法、 找出抗体的最佳修复方法 稀释度、 温度及孵育时间 5.每张切片应表明抗体名称 防止相互混淆 每张切片应表明抗体名称,防止相互混淆 每张切片应表明抗体名称
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切片
• 石蜡：冷水——温水（54°-56°）—— 石蜡：冷水 温水（ ° ° 温水 烤片（ ° 烤片（80°） 切好烤片后可以室温保存。 切好烤片后可以室温保存。 • 冰冻：切片温度-18°—-20° 冰冻：切片温度-18°—-20° 直接贴 切好于冰冻丙酮中固定5分后 分后-20° 切好于冰冻丙酮中固定 分后 ° 保存。 保存。
—第二日 第二日PBS5分×3 分 第二日 —加二抗 室温 分 加二抗 室温20分 —PBS5分×3 分 —DAB显色 显色 —水冲 水冲5-10分 水冲 分 —苏木素 分 苏木素1-3分 苏木素 —水冲 水冲10-15分 水冲 分 —80%85%90%每个 分 每个3分 每个 —95%（2个）无水乙醇（2个）二甲苯（2个 （ 个 无水乙醇（ 个 二甲苯（ 个 每个5分 ）每个 分 —中性树胶封片。 中性树胶封片。 中性树胶封片
• 石蜡切片：75%，80%，85%，90%，95% 石蜡切片： ， ， ， ， 无水乙醇（ ）中每个4小时 过夜， 小时-过夜 （2个），无水乙醇（2）中每个 小时 过夜， 个），无水乙醇 正丁醇1-2天 二甲苯（ 个 分钟。 正丁醇 天。二甲苯（2个）20-30分钟。 分钟 三个蜡，每个大于2小时 小时。 三个蜡，每个大于 小时。 • 冰冻切片：固定后脱水用 冰冻切片：固定后脱水用10%20%30%蔗糖 蔗糖 小时——过夜， 过夜， （0.1MPBS溶）每个室温下 小时 溶 每个室温下4小时 过夜 OCT包埋，先在锡纸盒冻一层，在中间放组 包埋， 包埋 先在锡纸盒冻一层， 切面朝下，再用OCT将组织没过，尽量 将组织没过， 织，切面朝下，再用 将组织没过 减少气泡，在液氮表面，保持小盒水平， 减少气泡，在液氮表面，保持小盒水平， 待中心尚透明时取出，放于-80° 保存 保存。 待中心尚透明时取出，放于 °C保存。
固定
• 4%多聚甲醛根据不同实验需求要求石蜡切 多聚甲醛根据不同实验需求要求石蜡切 片的固定时间不同，几小时到一周。 片的固定时间不同，几小时到一周。 • 我曾用过 天，可以。 我曾用过2天 可以。 • 冲水，固定的时间越长冲水时间越长，预 冲水，固定的时间越长冲水时间越长， 防甲醛沉积。 防甲醛沉积。
取脑
断头，剪开皮肤拨向两侧暴露颅骨， 断头，剪开皮肤拨向两侧暴露颅骨，从枕 骨大孔处沿正中线剪开露骨， 骨大孔处沿正中线剪开露骨，用镊子掰开 露骨，暴露脑组织， 露骨，暴露脑组织，用弯头镊将脑组织勾 出，在坐标纸上根据小鼠脑图谱取相应脑 区组织， 左右。 区组织，厚3mm左右。 左右
脱水和透明， 脱水和透明，浸蜡
灌注
0.5%戊巴比妥钠 戊巴比妥钠100mg/Kg麻醉小鼠，5分钟 麻醉小鼠， 分钟 戊巴比妥钠 麻醉小鼠 左右小鼠麻醉好，仰卧位固定四肢， 左右小鼠麻醉好，仰卧位固定四肢，用酒 精棉球擦胸腹部毛， 精棉球擦胸腹部毛，前开皮肤暴露胸部肌 肉层，剑突上成V型剪开胸廓 暴露心脏， 型剪开胸廓， 肉层，剑突上成 型剪开胸廓，暴露心脏， 剪掉右心耳（ 剪掉右心耳（即视野下心脏上色暗红组 ），与心尖处 与心尖处30°角刺入左心室， ° 织），与心尖处 °角刺入左心室，37° 左右生理盐水约10ml缓慢注入，冲净血液 缓慢注入， 左右生理盐水约 缓慢注入 多聚甲醛溶液（ °预冷）， ），10止，换4%多聚甲醛溶液（4°预冷）， 多聚甲醛溶液 20分钟，鼠僵硬为好。 分钟， 分钟 鼠僵硬为好。
冰冻切片的制作
• 取材和固定： 灌注后立即切取组织块，并 取材和固定： 灌注后立即切取组织块， 快速投入固定液中，或者处死后直接冷冻。 快速投入固定液中，或者处死后直接冷冻。 • 脱水和透明：梯度蔗糖 脱水和透明： • 包埋：OCT，3%聚乙烯醇。 包埋：OCT，3%聚乙烯醇 聚乙烯醇。 • 切片制作：切片 切片制作： • 贴片：直接贴 贴片： • 固定：冰冻丙酮3-5分 固定：冰冻丙酮3 • 保存：-20°C 保存： 20°
固定方法注意事项
1.组织块大小 组织块大小2cmx2cmx0.5cm 组织块大小 2.组织标本应及时放入固定液中 切忌干涸 组织标本应及时放入固定液中,切忌干涸 组织标本应及时放入固定液中 3.组织固定后必须冲洗 除去多余的固定液 组织固定后必须冲洗,除去多余的固定液 组织固定后必须冲洗 4.一般固定剂温度以室温 某些病毒则须低温 一般固定剂温度以室温,某些病毒则须低温 一般固定剂温度以室温 下处理,用丙酮 度至-40度固定 用丙酮-20度至 度固定30分钟 下处理 用丙酮 度至 度固定 分钟 5.浓度采用 浓度采用10%中性甲醛或 多聚甲醛 中性甲醛或4%多聚甲醛 浓度采用 中性甲醛或 6. 固定液量是标本体积 倍 固定液量是标本体积20倍 7.固定时间不超过 小时 固定时间不超过24小时 固定时间不超过
注意事项
• • • • •
安全 解剖位置 液体配制 染色时间 原因查找
Thank you!
免疫荧光
—PBS5分×3 分 —5%BSA室温封闭 小时 室温封闭1小时 室温封闭 —加一抗，4°过夜或根据说明书时间 加一抗， ° 加一抗 —第二日 第二日PBS5分×3 第二日 分 —加二抗 °孵育 小时 加二抗37°孵育1小时 加二抗 —PBS5分×3 分 —DAPI染色 染色 —PBS2分 分 —丙三醇封片荧光显微镜下观察照相。 丙三醇封片荧光显微镜下观察照相。 丙三醇封片荧光显微镜下观察照相
小鼠脑组织病理实验总结
内容
• • • • • • • 石蜡切片的制作 冰冻切片的制作 免疫组化 免疫荧光 HE 病理相关试剂配制 注意事项
石蜡切片的制作
• 取材和固定： 处死动物后或者灌注后立即 取材和固定： 切取组织块，并快速投入固定液中。 切取组织块，并快速投入固定液中。 • 脱水和透明：梯度酒精和二甲苯 脱水和透明： • 浸蜡和包埋：石蜡 浸蜡和包埋： • 切片制作：切片 切片制作： • 贴片：捞片，展片 贴片：捞片， • 保存：烤片 保存：
• 阻断液：0.3% H2O2 甲醇溶液。30%双氧水 阻断液： 2ml加入甲醇定容至200ml。（现用现配） • 修复液：（ 修复液：（ ：（400ml） ） 柠檬酸0.16g 柠檬酸钠 柠檬酸钠1.18g 柠檬酸 • 苏木素： 苏木素： • 100g硫酸铝钾加热溶于 硫酸铝钾加热溶于1250ml水中 硫酸铝钾加热溶于 水中 • 5g苏木素精粉末溶于 苏木素精粉末溶于100ml无水乙醇中 苏木素精粉末溶于 无水乙醇中 • 溶解后硫酸铝钾稍凉，加入醇溶苏木素煮沸 溶解后硫酸铝钾稍凉， 20-30分，加入 氧化汞煮沸 分钟， 氧化汞煮沸2分钟 分 加入g氧化汞煮沸 分钟，
实验过程
—70°考片一夜 ° —二甲苯 个每个 分钟无水乙醇，95%，90%， 二甲苯3个每个 分钟无水乙醇， 二甲苯 个每个10分钟无水乙醇 ， ， 85%，80%每个 分钟 每个10分钟 ， 每个 —3%双氧水阻断室温 分钟（现配现用） 双氧水阻断室温10分钟 双氧水阻断室温 分钟（现配现用） —抗体修复液（现配，400ml一次一个抗体盒） 抗体修复液（ 一次一个抗体盒） 抗体修复液 现配， 一次一个抗体盒 微波炉高火6-7分 微波炉高火 分 —冷却至室温 冷却至室温 —再修复一次冷却 再修复一次冷却 —PBS5分×3 分 —擦片加一抗，4°过夜 擦片加一抗， ° 擦片加一抗