关于小鼠脑冰冻切片
冷冻切片protocol
冷冻切片
实验材料：固定好的鼠脑
试剂：30%蔗糖；包埋剂；1*PBS
用品与仪器：冷冻切片机；刀片；24孔板
实验步骤：（切片的地点在1楼和6楼，1楼的切片机在使用前需要预约）
1、将前一天放于4%PFA中固定的鼠脑样品取出放入30%蔗糖中进行固定。（鼠脑刚放入时会浮在液面上，放置过夜，待沉淀后可进行切片操作）
2、进行切片操作之前要进行一些准备工作，首先，在24孔板（每个鼠脑大概需要2个24孔板）每个孔中加入1ml PBS，用来舒展脑片。其次，具有自带荧光的鼠脑的切片需要使用包有锡纸的24孔板，防止其荧光淬灭
3、开切片机，将CT和OT温度都调节为-20℃，切片厚度设定为40μm。
4、用包埋剂包埋底座，凝固后将底座置于切片机相应位置上，调整好底座的位置，使之与刀片平行，转动切片转轮，将底座切平，注意不要让底座的厚度太大，根据切口的情况调整切片机使之运作良好。（注意切片的转轮要在每一次切片完成后锁定，防止切伤手指）
5、沿与冠状切平行的方向将鼠脑的小脑部分切除，将剩余的脑放置在底座上（注意鼠脑的中缝线要对准底座上的豁口），底座平行放置于-20℃环境下，可看到鼠脑由底座部分向上逐渐变白。
6、待鼠脑完全变白后，向鼠脑上添加包埋剂，等待鼠脑包埋好。（如发现部分鼠脑未包埋住或包埋不充分，需要向该部位再次添加包埋剂）
7、鼠脑包埋好后，将底座上流出的多余包埋剂切除，然后将样品连同底座放至切片机上进行切片。
8、放好样品后，先按后退键，将盛放样品的基座向后放，目测使刀片不能切到样品的位置。
9、转动切片机，使样品慢慢接近刀片，继续转动切片机进行切片，直至看到嗅球部位的脑组织，清理掉嗅球之前切下的切片。
小鼠脑冰冻切片的染色注意事项
小鼠脑冰冻切片的染色注意事项
对于小鼠脑冰冻切片的染色，需要注意以下几点：
1. 组织固定：在进行切片前，需要对小鼠脑组织进行固定，以保持其形态结构。常用的方法包括冷冻、乙醛固定、福尔马林固定等。
2. 切片厚度：对于小鼠脑切片的染色，切片的厚度是非常重要的。一般来说，切片的厚度应该在20-30μm之间，过厚或过薄都会影响染色效果。
3. 染色方法：小鼠脑冰冻切片的染色有许多方法，如免疫组化、荧光染色等。需要根据实验的需要选择合适的染色方法。
4. 试剂的选择：选择合适的试剂可以提高染色效果。例如，对于免疫组化染色，需要选择能够与目标蛋白特异结合的抗体。
5. 染色时间：染色时间也是影响染色效果的重要因素。染色时间过短可能导致染色不充分，过长则可能影响细胞结构。
综上所述，小鼠脑冰冻切片的染色需要注意上述几点，以保证染色效果的准确性和可重复性。
小鼠脑组织病理总结ppt课件
• 阻断液：0.3% H2O2 甲醇溶液。30%双氧水 2ml加入甲醇定容至200ml。（现用现配） • 修复液：（400ml） 柠檬酸0.16g 柠檬酸钠1.18g • 苏木素： • 100g硫酸铝钾加热溶于1250ml水中 • 5g苏木素精粉末溶于100ml无水乙醇中 • 溶解后硫酸铝钾稍凉，加入醇溶苏木素煮沸 20-30分，加入g氧化汞煮沸2分钟，
HE
—70°烤片一夜 —二甲苯3个每个10分钟无水乙醇，95%， 90%，85%，80%每个5分钟 —苏木素1-5分 —水 —盐酸酒精 —水 —0.5%氨水
—水 —95%酒精2分 —0.5%醇溶伊红1秒 —95%酒精30秒 —95%酒精，无水乙醇（3个）每个2分 —二甲苯（2个）每个2分钟 —中性树胶封片，吹干
固定
• 4%多聚甲醛根据不同实验需求要求石蜡切 片的固定时间不同，几小时到一周。 • 我曾用过2天，可以。 • 冲水，固定的时间越长冲水时间越长，预 防甲醛沉积。
取脑
断头，剪开皮肤拨向两侧暴露颅骨，从枕 骨大孔处沿正中线剪开露骨，用镊子掰开 露骨，暴露脑组织，用弯头镊将脑组织勾 出，在坐标纸上根据小鼠脑图谱取相应脑 区组织，厚3mm左右。
每张切片应表明抗体名称防止相互混淆111270考片一夜二甲苯3个每个10分钟无水乙醇95908580每个10分钟3双氧水阻断室温10分钟现配现用抗体修复液现配400ml一次一个抗体盒微波炉高火67分冷却至室温再修复一次冷却pbs5分313第二日pbs5分3室温20分pbs5分3dab显色水冲510分苏木素13分水冲1015分808590每个3分952个无水乙醇2个二甲苯2个每个5分中性树胶封片
各种组织冰冻切片、取材,染色等具体操作方法(连载一 脑、肠、眼球)
各种组织冰冻切片、取材，染色等具体操作方法(连载一脑、肠、眼球）
1.做脑组织的冰冻切片在前期的处理过程中很重要，因为脑组织非常软。不但要做前固定，最好是做全身灌注固定后，如果不做全身灌注固定，很难取出一个完整的大脑组织。再段头取脑置4度4％多聚甲醛（或西奈山环保组织固定液）中后固定24小时，然后依次置入剃度PB蔗糖溶液脱水，剃度可以设为15%，20%，30%分别过夜沉底即可。设剃度脱水是为了避免组织块冰晶的产生。冰晶在组织片上表现为圆形或椭圆行的空洞，影响实验结果。在做切片时可以做简单的HE染色即可分辨出是否有冰晶。防止冰晶的另一实验注意点是在做切片前的包埋过程，要求速冻，一般放-20度下15分钟即可，温度高如室温或者4度是达不到速洞效果的，温度太低如放在液氮罐中又导致组织块的碎裂。而且产生冰晶。
2.如果想要作出满意的漂亮的实验结果，特别是免疫双标共聚焦，那就要求更高，实验的每一步都要很严格，不是我说法夸张，是因为做共聚焦要避免自发荧光的问题，而实验的每一步都可能产生自发荧光，比如4％多聚甲醛灌注液，PB蔗糖等都可以产生让我们头痛的自发荧光问题，根据我的实验经验，国产的多聚甲醛作实验很容易产生自发荧光，难以避免，不过据我导师讲，他在国外做共聚焦不存在这些问题，所以我个人认为你不妨先做单标试试看，能避免自发荧光，那最大的难题就解决了。西奈山环保组织固定液可以降低自发荧光背景。
3.是否做漂片还是贴片的问题，脑组织两种方法都可以，唯独共聚焦例外，做共聚焦要求片子一般为30-50um，厚片才能达到三维重建的效果。一般的贴片文献上提到的是20-30um用漂片，此法要求抗体用量较大，最好买国外原装的浓缩液。不过我做的脑片切过4um的做一般的普通免疫荧光可以。
胎鼠脑组织 病理切片 步骤
胎鼠脑组织病理切片步骤引言概述：
胎鼠脑组织病理切片是一项重要的实验技术，用于研究胎儿发育过程中的神经系统疾病。通过对胎鼠脑组织进行病理切片，可以观察和分析组织的形态结构、细胞组织学和病理学变化，为研究胎儿神经系统疾病提供重要的依据。本文将从胎鼠脑组织病理切片的步骤、技术要点、切片染色、显微镜观察和结果分析等方面进行详细阐述。
正文内容：
1. 步骤
1.1. 选取合适的胎鼠
在进行胎鼠脑组织病理切片前，首先需要选择合适的胎鼠。一般选择胎龄较大的胎鼠，以确保其神经系统已经发育到一定程度。
1.2. 组织固定
将选取的胎鼠脑组织进行固定处理，常用的固定剂包括10%的中性缓冲福尔马林和4%的聚乙烯醇。固定时间一般为24-48小时，以确保组织充分固定。
1.3. 组织处理
固定后的胎鼠脑组织需要进行脱水、透明化和浸渍等处理。脱水处理常用乙醇梯度浓度，透明化处理常用甘油和二甲苯等溶剂。
1.4. 切片制备
将经过处理的胎鼠脑组织进行切片制备。常用的方法有冰冻切片和石蜡包埋切片两种，选择合适的方法根据实验需要和设备条件来决定。
1.5. 切片染色
制备好的切片需要进行染色处理，以增强组织结构的对比度。常用的染色方法有血液学染色、组织学染色和免疫组织化学染色等。
2. 技术要点
2.1. 切片厚度
胎鼠脑组织切片的厚度一般为4-6μm，厚度的选择需要根据实验需求和显微镜的分辨率来决定。
2.2. 切片方向
切片方向的选择也十分重要，一般选择垂直于组织结构的方向进行切片，以获得更准确的组织形态信息。
2.3. 切片保存
制备好的切片需要进行保存，常用的方法是将切片放置在玻片上，用封片剂密封，然后存放在干燥、阴凉的地方。
大鼠冰冻切片操作方法
大鼠冰冻切片操作方法
大鼠冰冻切片操作方法
【操作步骤】（含溶液配置）
1．小鼠的灌注固定：动物经麻醉后开胸暴露心脏，经左心室先快速灌注生理盐水(50mL左右)至流出液变清亮，然后换4％多聚甲醛继续灌注大约100ml至组织变硬。
2．取材：小心剥离脑组织，置广口瓶中用4％多聚甲醛后固定12～24h。
3．脱水：将标本移入30%蔗糖溶液（用4％多聚甲醛配制），4℃放置至组织块沉底
4．将少量包埋剂OCT滴加到标本台，放入恒冷箱切片机内至变白，然后取出快速将表面用单面刀片修平。
5．用安全刀片将标本底部修平后迅速粘附于标本台，然后置入-24℃恒冷箱切片机的冷冻台。待组织略微发白时用OCT在标本表面涂一薄层，继续冷冻20min。
6．调好切片厚度后开始切片。如果是采用漂片，切片厚度一般20～30μm，切好的片子可以连续收集也可以每隔5～6片收集一片，移入含4％多聚甲醛的6孔板、24孔板或别的容器。如果是准备做贴片，片厚一般10μm；可以连续裱片，也可以每隔5片或10片裱一片，贴好后放切片盒，50度左右烤片1小时使其贴牢.
7．将切好的片子放4℃保存备用。
注意事项：
1.做室旁核的话可以将脑袋反过来，在腹侧面，大概切掉视交叉前和下丘脑之后的部分、只保留中间部分然后连续切片就可以了。如果是漂片，室旁核的部分切不了很多；如果贴片那切出来的要多一点。做免疫组化的话漂片就可以了。
2.液氮或低温冰箱里的冻存必须要有防冻液，否则必然切片会碎掉。
免疫组化-切片
免疫组化——切片
包埋
1、剪取小鼠的整个耳部组织放入1XHBSS中，解剖出颞骨，放入4%PFA中固定（1ml
16%PFA+3ml 1XPBS），在颞骨的顶端打孔，用注射器分别从圆窗、椭圆窗处注射4%的PFA，shake 1-2h,4°过夜
2、如果小鼠大于8天，把颞骨放入0.5M EDTA中脱钙1-3天
P8-P15，1天
P15-P30，2天
大于P30，3天
3、1X PBST洗3次，每次3分钟
4、把颞骨转入15%的蔗糖溶液中，真空1h,4°过夜
5、把颞骨放入20%蔗糖溶液中，真空1h，之后转入30%蔗糖溶液中，真空1h，4°过夜
6、把颞骨放入50% 30%蔗糖溶液+50% OCT中，真空1h,4°过夜
7、把颞骨放入30% 30%蔗糖溶液+70% OCT中，真空1h,把颞骨放入15% 30%蔗糖溶液+85%
OCT中，真空1h,把颞骨放入100% OCT中，调整位置，圆窗、椭圆窗着地，真空1h,4°过夜
8、把放入100%OCT的颞骨继续真空1h,调整位置，放入冰冻切片机中速冻20min,再放入-80°
冰箱。
9、切片,切好的片子先放入-20°，过夜，再放入4°
实验前一天准备好玻片：用10%的多聚赖氨酸涂玻片，放在实验桌上晾干。
提前半小时调冰冻切片机：刀片温度和机内温度调至-20°，切片子时刀片要用新的，切好的片子在切片机的玻璃上烤30min-1h.当天切的片子一般第二天才可以用。
染色
1、挑选切好的片子，在staining box中用PBST洗涤3次（为防止sample脱落，每次都是先倒入PBST再放片子，洗完片子，用无纸屑的纸巾擦干玻片之后再加试剂）
小鼠脑组织病理总结
• 阻断液：0.3% H2O2 甲醇溶液。30%双氧 水2ml加入甲醇定容至200ml。（现用现配 ）
• 修复液：（400ml）
柠檬酸0.16g 柠檬酸钠1.18g
• 苏木素：
• 100g硫酸铝钾加热溶于1250ml水中
• 5g苏木素精粉末溶于100ml无水乙醇中
• 溶解后硫酸铝钾稍凉，加入醇溶苏木素煮沸 20-30分，加入g氧化汞煮沸2分钟，
• 脱水和透明：梯度酒精和二甲苯 • 浸蜡和包埋：石蜡 • 切片制作：切片 • 贴片：捞片，展片 • 保存：烤片
冰冻切片的制作
• 取材和固定： 灌注后立即切取组织块，并 快速投入固定液中，或者处死后直接冷冻 。
• 脱水和透明：梯度蔗糖 • 包埋：OCT，3%聚乙烯醇。 • 切片制作：切片 • 贴片：直接贴 • 固定：冰冻丙酮3-5分 • 保存：-20°C
下处理,用丙酮-20度至-40度固定30分钟 5.浓度采用10%中性甲醛或4%多聚甲醛 6. 固定液量是标本体积20倍 7.固定时间不超过24小时
组化实验设计
1.对常规组织切片进行仔细观察,根据可提供 形态学特点,选择最佳并能反映病变的组织 标本
2.列出免疫组化的指标 3.进行预实验(设立阳性、阴性对照) 4.找出抗体的最佳修复方法、稀释度、孵育
温度及孵育时间 5.每张切片应表明抗体名称,防止相互混淆
实验过程
取小鼠脑组织
取小鼠脑组织
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。
其实过程与大鼠近似，我的经验是：
1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等；
2. 步骤：处死小鼠，取头颅；
剪开皮肤，漏出颅骨；
用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；
再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；
当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；
然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。
3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；
用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；
去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；
取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；
若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。
做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。先麻醉小鼠
剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳
先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了
再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬
小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚
免疫组化-小鼠脑切片protocol（改正）
免疫组化-小鼠脑切片protocol（改正）
免疫组化
实验材料：需要进行观察的脑片
存放位置：一抗、二抗、DAPI放在冰箱一层;山羊血清放于冰箱二层。
所用试剂：10%山羊血清；PBST（PBS+0.7%Triton）；一抗（1:1000）；二抗（1:500）；PBS（配制方法：将一个1L的烧杯洗净晾干，称量8gNaCl，0.2gKCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4放至烧杯中，向烧杯中添加800ml ddwater，放在磁力搅拌器上搅拌，调PH至7.2，后定容至1L）；DAPI（用PBS配制，1:10000）；抗荧光淬灭封片液
仪器或器皿：24孔板（洗净晾干，为了便于后续操作，要将24孔板盖子和板子上画一条横线以防止盖子盖错，在盖子上划线对24孔板按照其作用（如：装有洗一抗用的PBST的孔，则标明PBST（洗一抗用））进行分区）；室温摇床
实验步骤：
1、封闭：将冷冻切片所得的脑片进行封闭，封闭用1ml山羊血清+9ml PBST，每孔加800微升，将脑片用玻璃钩取出放入24孔板中，放于4℃过夜。
2、封闭完成后，用玻璃钩将脑片取出放于添加了一抗（1:1000，一抗用封闭液配制）（rabbit or mouse or chicken）的24孔板中进行
孵育，置于室温摇床，8h（记得计时），之后放于4℃过夜。（一抗有两种，即单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体特异性较强，但亲和性较弱；多克隆抗体特异性较弱，但亲和性较强）
3、用一抗孵育后，将脑片用玻璃钩取出，放于添加了800微升PBST 的24孔板中进行洗涤，洗3次，每次15分钟，每次洗涤后都要将脑片重新用玻璃钩取出放于添加了新的PBS的24孔板中，放于室温摇床。
冰冻切片漂片
免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）
免疫组化步骤：
1.将脑片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；
2.吸去双氧水，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；
3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；
4.然后，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃；
5.然后，PBS洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。
6.DAB配方为：10mgDAB固体加到20ml0.01MPBS，临用时加100-200微升30%双氧水，注意避光。
7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。一般3分钟显色就比较明显，如果20分钟仍未显色，则看下面的参考。
8.然后PBS洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。
9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。
免疫荧光步骤及注意事项：
1，将脑片放到6空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）
2，吸去山羊血清，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；
小鼠脑组织病理总结ppt课件
• 阻断液：0.3% H2O2 甲醇溶液。30%双氧水 2ml加入甲醇定容至200ml。（现用现配） • 修复液：（400ml） 柠檬酸0.16g 柠檬酸钠1.18g • 苏木素： • 100g硫酸铝钾加热溶于1250ml水中 • 5g苏木素精粉末溶于100ml无水乙醇中 • 溶解后硫酸铝钾稍凉，加入醇溶苏木素煮沸 20-30分，加入g氧化汞煮沸2分钟，
小鼠脑组织病理 总结
内容
• • • • • • • 石蜡切片的制作 冰冻切片的制作 免疫组化 免疫荧光 HE 病理相关试剂配制 注意事项
石蜡切片的制作
• 取材和固定： 处死动物后或者灌注后立即 切取组织块，并快速投入固定液中。 • 脱水和透明：梯度酒精和二甲苯 • 浸蜡和包埋：石蜡 • 切片制作：切片 • 贴片：捞片，展片 • 保存：烤片
固定
• 4%多聚甲醛根据不同实验需求要求石蜡切 片的固定时间不同，几小时到一周。 • 我曾用过2天，可以。 • 冲水，固定的时间越长冲水时间越长，预 防甲醛沉积。
取脑
断头，剪开皮肤拨向两侧暴露颅骨，从枕 骨大孔处沿正中线剪开露骨，用镊子掰开 露骨，暴露脑组织，用弯头镊将脑组织勾 出，在坐标纸上根据小鼠脑图谱取相应脑 区组织，厚3mm左右。
注意事项
• • • • • 安全 解剖位置 液体配制 染色时间 原因查找
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冰冻切片的制作
小鼠vta脑区取材方法
小鼠vta脑区取材方法
小鼠VTA脑区取材方法
简介
脑区取材是研究神经科学中至关重要的步骤之一。而小鼠VTA
（腹侧被盖区）是一个具有重要生理功能的脑区，因此其取材方法尤
为重要。本文将详细介绍几种常用的小鼠VTA脑区取材方法。
方法一：冰冻切片法
1.准备工具和材料：小鼠脑，乙醇，刀片，冰冻剂（如乙脑）。
2.将小鼠的脑取出并迅速冷冻。
3.利用刀片将冷冻的小鼠脑切片，切得越薄越好。
4.将切片收集起来放入乙醇中浸泡，以去除残留的冰冻剂。
5.制备好的小鼠VTA脑区切片即可用于后续研究。
方法二：脑电图指导法
1.准备工具和材料：小鼠，脑电图仪器，电极。
2.将小鼠进行麻醉操作，将电极植入小鼠脑内。
3.进行脑电图记录，根据脑电图上的信号变化找到VTA脑区的位置。
4.通过电极位置引导，取出VTA脑区样本。
方法三：免疫组织化学法
1.准备工具和材料：小鼠脑，加权剂，抗体。
2.将小鼠的脑取出并固定在福尔马林中。
3.进行脱水、透明化等处理，以使脑组织适合免疫组织化学操作。
4.制备适当浓度的抗体，对小鼠脑组织进行免疫染色，以标记VTA
脑区。
5.根据免疫染色结果，准确取出VTA脑区进行后续实验。
方法四：多色荧光染色法
1.准备工具和材料：小鼠脑，荧光染料。
2.将小鼠的脑取出并固定在福尔马林中。
3.进行脱水、透明化等处理，使脑组织适合染色。
4.制备多种荧光染料的混合液，对小鼠脑组织进行染色，以区分
VTA脑区。
5.利用荧光显微镜观察染色结果，准确定位并取出VTA脑区。
方法五：遗传学标记法
1.准备工具和材料：转基因小鼠。
2.鉴定具有特定遗传学标记的小鼠品系，如tdTomato表达转基因
小鼠组织冰冻包埋
冰冻包埋
实验目的：
将小鼠大脑、前脑、小脑脑干、心脏及肺组织进行冰冻包埋。
实验器材：
液氮、锡箔纸、冰冻切片包埋剂OCT、镊子。
实验步骤：
1、取材当天把所需要包埋的组织放入4%多聚甲醛过夜；
2、将包埋筐放入15%蔗糖溶液过夜（4℃存放），再将包埋筐放入30%蔗糖溶液过夜（4℃存放）；
3、“沉糖”完成后，可进行冰冻包埋；
4、将包埋组织放于托盘中（托盘用锡箔纸包裹）；
5、将托盘放入液氮中，浸没组织，持续3-5s后捞出，如此重复3-4次左右，待脑组织从半透明变为白色即可（组织浸没与液氮的时间不能过长，避免组织碎裂）；
6、组织经液氮速冻后立即用锡箔纸包裹（标注实验编号），放入-80℃；
7、切片之前30min将组织从-80℃冰箱中取出，放入-20℃冰箱中解冻；
8、解冻后用OCT胶包埋组织（包埋时确保需要切片的那一面朝上），放入冰冻包埋机中，20min左右后即可切片。
实验结果：
将包埋的组织分组分盒存放于-80℃深冻冰箱。
注意事项：
1、用OCT胶包埋组织时要均匀，不要留有气泡；
2、包埋时去额叶半脑按照“冠状切面额极朝上放置并、包埋”，一侧的小脑脑干按照“时装切面，中线面朝上放置、包埋”心肺肝肾等组织按照“水平切面，横截面较小侧向前放置、包埋”；
3、“沉糖”的时间不宜过长。
大脑切片实验操作流程
大脑切片实验操作流程
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冰冻切片protocol1
冰冻切⽚protocol1
冰冻切⽚protocol
1.材料及⽅法
1.1实验材料冰冻切⽚
1.2主要试剂
0.1moL/L PH=7.4的PBS缓冲液
4%多聚甲醛溶液
50%蔗糖溶液（现⽤现配）
组织冰冻切⽚包埋剂
20%氨基甲酸⼄酯
多聚赖氨酸
包恩⽒液
1.3⽤品与仪器烧杯（1000ml 100ml 50ml），量筒（1000ml 10ml），漏⽃，滤纸，玻璃棒，载玻⽚，盖玻⽚，滴管，镊⼦，标签纸，玻璃分针、⼿术⼑⽚、⼿术剪、眼科剪、⽑剪⼑、托盘、灌注针头、注射器（50ml）、三通接头、表⾯⽫。仪器见表1所⽰。
1.4实验⽅法将昆明⼩⿏通过注射乌拉坦（氨基甲酸⼄酯）⿇醉后，进⾏⼼脏灌注⽣理盐⽔和多聚甲醛，分别取其胰腺和坐⾻神经、脑，⽤包恩⽒液和4%多聚甲醛两种⽅法来固定，然后进⾏HE染⾊，最后⽤显微镜进⾏镜检观察分析。
2 实验步骤流程
2.1 组织的取材与固定
2.1.1固定液的配制
1、包恩⽒液（共配200ml）：
2、0.1mol/LPBS缓冲液：
3、多聚甲醛（共配200ml）
4、脱⽔30%蔗糖
2.1.2⼿术取材及固定
将昆明⼩⿏进⾏腹腔注射乌拉坦(100g/ml)⿇醉后，进⾏⼼脏灌注,⽣理盐⽔（50ml）和多聚甲醛（50ml），分离坐⾻神经、脑和胰腺，PBS洗3次，各5分钟（或洗⼀次20分钟），将坐⾻神经包进⼤脑，⽤4%多聚甲醛固定坐⾻神经（2h以上），包恩⽒液固定胰腺（3h以上），PBS洗3次，各5分钟（或洗⼀次20分钟）。
2.2 脱⽔
脱⽔是应⽤脱⽔剂将组织内的⽔分置换出来，同时组织⼜不出现收缩变形等⼈⼯改变。我们选择蔗糖为脱⽔剂。
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1 冰冻切片先固定还是先切片，是否需要置于室温放置30分钟，针对脑组织具体用什么固定剂和固定步骤比较好？
我们实验室鼠脑冰冻切片采用4%的多聚甲醛固定，小鼠直接灌注saline20ml，4%多聚甲醛20ml 经左心室固定然后取材在4度4%多聚甲醛后固定4-6h，浸20%-30%糖沉底，就可以切片，切片首先需要冰冻切片机，我们的leica1900的，不知道lz那里有没有这个机子，还又一种原始的自己刷冻台的那种，比较麻烦，切片厚度大概选择20-40um差不多
2 有人说石蜡切片的清晰度比冰冻切片更高，是否属实？
由于石蜡切片的厚度在4-6um之间，这是冰冻切片远远达不到的境界，这要根据你的实验选择，神经元的直径一般在10-12um之间，这样冰冻切片如果做双标最好选择免疫荧光。但是冰冻切片抗原保护的比石蜡好。
3 脑组织的冰冻切片怎么保存最好？
冰冻切片一般现切现做，如果实在要保存就浸泡在0.01mpbs4度保存最多一个星期，尽量切完片子就做。