关于小鼠脑冰冻切片
各种组织冰冻切片、取材,染色等具体操作方法(连载一 脑、肠、眼球)
各种组织冰冻切片、取材，染色等具体操作方法(连载一脑、肠、眼球）1.做脑组织的冰冻切片在前期的处理过程中很重要，因为脑组织非常软。
不但要做前固定，最好是做全身灌注固定后，如果不做全身灌注固定，很难取出一个完整的大脑组织。
再段头取脑置4度4％多聚甲醛（或西奈山环保组织固定液）中后固定24小时，然后依次置入剃度PB蔗糖溶液脱水，剃度可以设为15%，20%，30%分别过夜沉底即可。
设剃度脱水是为了避免组织块冰晶的产生。
冰晶在组织片上表现为圆形或椭圆行的空洞，影响实验结果。
在做切片时可以做简单的HE染色即可分辨出是否有冰晶。
防止冰晶的另一实验注意点是在做切片前的包埋过程，要求速冻，一般放-20度下15分钟即可，温度高如室温或者4度是达不到速洞效果的，温度太低如放在液氮罐中又导致组织块的碎裂。
而且产生冰晶。
2.如果想要作出满意的漂亮的实验结果，特别是免疫双标共聚焦，那就要求更高，实验的每一步都要很严格，不是我说法夸张，是因为做共聚焦要避免自发荧光的问题，而实验的每一步都可能产生自发荧光，比如4％多聚甲醛灌注液，PB蔗糖等都可以产生让我们头痛的自发荧光问题，根据我的实验经验，国产的多聚甲醛作实验很容易产生自发荧光，难以避免，不过据我导师讲，他在国外做共聚焦不存在这些问题，所以我个人认为你不妨先做单标试试看，能避免自发荧光，那最大的难题就解决了。
西奈山环保组织固定液可以降低自发荧光背景。
3.是否做漂片还是贴片的问题，脑组织两种方法都可以，唯独共聚焦例外，做共聚焦要求片子一般为30-50um，厚片才能达到三维重建的效果。
一般的贴片文献上提到的是20-30um用漂片，此法要求抗体用量较大，最好买国外原装的浓缩液。
不过我做的脑片切过4um的做一般的普通免疫荧光可以。
楼上的几位同仁说得不错。
就我们实验室的操作方法以及个人的体会说上几点：1.如果灌注固定较好的话，完全可以省去后固定这个步骤。
神经组织常规的固定液为4%的多聚甲醛，如果在其中再加入0.25-0.5%的戊二醛增加其固定时的交联作用，那么固定的效果就会更好些，脑或脊髓标本就会更硬些；我们一般用1000ml多聚甲醛固定至少2小时。
小鼠组织冰冻包埋
实验结果：
将包埋的组织分组分盒存放于-80℃深冻冰箱。
注意事项：
1、用OCT胶包埋组织时要均匀，不要留有气泡；
2、包埋时去额叶半脑按照“冠状切面额极朝上放置并、包埋”，一侧的小脑脑干按照“时装切面，中线面朝上放置、包埋”心肺肝肾等组织按照“水平切面，横截面较小侧向前放置、包埋”；
3、“沉糖”的时间不宜过长。
冰பைடு நூலகம்包埋
实验目的：
将小鼠大脑、前脑、小脑脑干、心脏及肺组织进行冰冻包埋。
实验器材：
液氮、锡箔纸、冰冻切片包埋剂OCT、镊子。
实验步骤：
1、取材当天把所需要包埋的组织放入4%多聚甲醛过夜；
2、将包埋筐放入15%蔗糖溶液过夜（4℃存放），再将包埋筐放入30%蔗糖溶液过夜（4℃存放）；
3、“沉糖”完成后，可进行冰冻包埋；
4、将包埋组织放于托盘中（托盘用锡箔纸包裹）；
5、将托盘放入液氮中，浸没组织，持续3-5s后捞出，如此重复3-4次左右，待脑组织从半透明变为白色即可（组织浸没与液氮的时间不能过长，避免组织碎裂）；
6、组织经液氮速冻后立即用锡箔纸包裹（标注实验编号），放入-80℃；
7、切片之前30min将组织从-80℃冰箱中取出，放入-20℃冰箱中解冻；
脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法的免疫组化效果比较
脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法的免疫组化效果比较钟琴;张燕翔;钱锋;杨波;任伯绪【摘要】目的：：比较脑组织冰冻切片与石蜡切片免疫组化的效果。
方法：健康雄性昆明小鼠20只，腹腔注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态模型。
24h后成功模型小鼠脑灌注固定，断头取脑，随机分别取8只行冰冻切片40μm (A组)与石蜡切片4μm (B组)，采用羊抗鼠 DCX (1：200)抗体，以 SABC 法进行免疫组化染色。
结果：A组阳性神经元数目与B组比较差异有统计学意义(P<0.05)，且 A组镜下视野切片染色更加清晰，对比良好。
结论：脑组织切片免疫组化染色采用冰冻切片漂片法效果更为可靠。
【期刊名称】《长江大学学报（自然版）理工卷》【年(卷),期】2015(000)036【总页数】3页(P95-97)【关键词】冰冻切片;石蜡切片;免疫组化;癫痫【作者】钟琴;张燕翔;钱锋;杨波;任伯绪【作者单位】长江大学医学院，湖北荆州 434023;长江大学医学院，湖北荆州434023;长江大学医学院，湖北荆州 434023;长江大学医学院，湖北荆州434023;长江大学医学院，湖北荆州 434023【正文语种】中文【中图分类】R361随着神经科学的不断发展，脑组织免疫组化技术越来越多地应用于神经学研究。
由于脑组织本身具有柔软、含水量大等特点，其石蜡切片的免疫组化染色结果易出现切片染色不清楚、脱片、假阳性、假阴性等问题[1]，很难得到高质量的脑组织免疫组化切片。
本实验采用癫痫持续状态模型(status epilepticus, SE)，用免疫组化的方法检测海马齿状回下区编码微管相关蛋白(DCX)阳性神经元的表达，对比脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法免疫组化的效果，以期更好的开展实验研究工作。
1.1 对象健康雄性昆明小鼠20只，体质量(30±5)g，由湖北省实验动物研究中心提供；东莨菪碱、匹罗卡品由Sigma公司提供；免疫组化ABC试剂盒、DCX羊抗鼠一抗、驴血清、驴抗羊二抗由Santa cruze公司提供。
免疫组化-小鼠脑切片protocol(改正)
免疫组化实验材料：需要进行观察的脑片存放位置：一抗、二抗、DAPI放在冰箱一层;山羊血清放于冰箱二层。
所用试剂：10%山羊血清；PBST（PBS+%Triton）；一抗（1:1000）；二抗（1:500）；PBS（配制方法：将一个1L的烧杯洗净晾干，称量8g NaCl， KCl, Na2HPO4, KH2PO4放至烧杯中，向烧杯中添加800ml ddwater，放在磁力搅拌器上搅拌，调PH至，后定容至1L）；DAPI（用PBS配制，1:10000）；抗荧光淬灭封片液仪器或器皿：24孔板（洗净晾干，为了便于后续操作，要将24孔板盖子和板子上画一条横线以防止盖子盖错，在盖子上划线对24孔板按照其作用（如：装有洗一抗用的PBST的孔，则标明PBST（洗一抗用））进行分区）；室温摇床实验步骤：1、封闭：将冷冻切片所得的脑片进行封闭，封闭用1ml山羊血清+9ml PBST，每孔加800微升，将脑片用玻璃钩取出放入24孔板中，放于4℃过夜。
2、封闭完成后，用玻璃钩将脑片取出放于添加了一抗（1:1000，一抗用封闭液配制）（rabbit or mouse or chicken）的24孔板中进行孵育，置于室温摇床，8h（记得计时），之后放于4℃过夜。
（一抗有两种，即单克隆抗体和多克隆抗体。
单克隆抗体特异性较强，但亲和性较弱；多克隆抗体特异性较弱，但亲和性较强）3、用一抗孵育后，将脑片用玻璃钩取出，放于添加了800微升PBST的24孔板中进行洗涤，洗3次，每次15分钟，每次洗涤后都要将脑片重新用玻璃钩取出放于添加了新的PBS的24孔板中，放于室温摇床。
4、之后，将脑片从含PBST的24孔板中取出，放入添加了二抗（1:500，一般用封闭液配）的24孔板中，放在室温摇床上孵育2h，每孔加800微升。
（二抗一般根据一抗来选择，如一抗为鼠源的，二抗就选择抗鼠的；一抗为兔源的，二抗就选择抗兔的）5、二抗孵育后，将脑片用玻璃钩取出，放于装有PBST的24孔板中洗5次，每次洗涤都要将脑片取出放于呈有新的PBST的24孔板中，每次15分钟，放于室温摇床。
病毒注射后小鼠组织器官的固定、切片与荧光观察.doc
小鼠组织器官的固定、切片与荧光观察
病毒注射后小鼠组织器官的固定、切片与荧光观察
带GFP/RFP等荧光蛋白的腺相关病毒（AAV）、腺病毒等注射感染动物后，需要对目标脏器进行固定、冰冻切片以观察荧光。
由于动物的血液细胞往往会影响荧光观察的效果，因此，取材脏器时一般需要对小鼠进行灌流排血，然后进行全身灌流固定。
一、灌流排血与固定
1剪开胸腔，暴露心脏。
2吊瓶里装入遇冷生理盐水，将输液针刺入左心室（心尖处），打开输液阀。
3右心房上剪一小口，使血液和灌洗液可以排出。
4灌入约50ml生理盐水后，观察从右心房流出的液体已经变成无色透明，说明血液已经冲洗干净。
5不要从心脏上拔出输液针，换一个装有预冷过的4%多聚甲醛的吊瓶继续输液。
当多聚甲醛输入体内时，小鼠会剧烈抽搐。
6待抽搐停止后，再持续输5分钟，多聚甲醛即可将小鼠体内各脏器充分固定，牵拉四肢有僵硬感。
此时已经固定完毕，可以取材。
注：现在一般也可用灌流泵通过心脏进行全身灌流
二、包埋与冰切：
直接取固定的小鼠肝脏组织放入4%PFA中后固定过夜，20%蔗糖脱水2天，OCT包埋后，冰切成10um切片，然后用封片液封片后观察。
1。
冰冻切片漂片
免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）免疫组化步骤：1.将脑片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；2.吸去双氧水，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4.然后，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃；5.然后，PBS洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。
6.DAB配方为：10mgDAB固体加到20ml0.01MPBS，临用时加100-200微升30%双氧水，注意避光。
7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。
一般3分钟显色就比较明显，如果20分钟仍未显色，则看下面的参考。
8.然后PBS洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。
干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。
9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。
如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。
免疫荧光步骤及注意事项：1，将脑片放到6空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）2，吸去山羊血清，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3，然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48或72小时；5，然后，PBS洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别一、石蜡切片把修好的蜡块装在旋转切片机上，即可进行切片（sectio n）。
切片必须保持切片刀锐利，切片厚度通常为 5〜7um也可根据染色需要切成不同厚度，一般不旋转式切片机超过10um切好的蜡带，放人40C左右的温水中将蜡片展平。
良好的切片应无刀痕、裂痕，切片厚度均一平整。
切片如有上述问题，在进行免疫组织化学染色时会出现假阳性现象。
为能得到平整无皱褶的组织切片。
可采用两次展片，即先将组织切片漂浮在 30%的乙醇溶液中进行第一次展片，然后将切片捞起，再次放人45〜50C的水浴中进行第二次展片，乙醇的浓度和水温可视组织不同和石蜡熔点的高低自行调整。
此过程是利用乙醇溶液与水之间的张力差展开切片的皱褶。
为防止脱片，载玻片要涂黏片剂。
对HE染色的切片, 可在载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，但蛋白甘油因含蛋白易导致非特异性免疫反应，故用于免疫组织化学染色的切片常用多聚赖氨酸、3—氨丙基一乙氧基甲硅烷等处理。
二、冰冻切片冰冻切片（fiozen section）是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法，其最突出的优点是能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。
新鲜组织和已固定的组织均可作冰冻切片。
为了得到高质量的冰冻切片，选择好的冰冻切片机和配套的一次性刀架是保证切片质量的关键。
组织在切片前需要冰冻，而冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，从而影响抗原定位。
一般认为，冰晶体积大而量少时，影响较小；冰晶体积小而量多时，对组织结构损害较大。
含水量较多的组织中较易出现冰晶。
1 •防止组织中冰晶形成的方法（1）速冻：使组织温度骤降，减少冰晶的形成。
方法包括：1）干冰一丙酮（乙醇）法：将150〜200ml丙酮（无水乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70 C,用一小烧杯内装异戊烷约50ml，将此烧杯缓慢置人干冰一丙酮（或无水乙醇）饱和液内，至异戊烷温度-70 C时即可使用。
小鼠vta脑区取材方法
小鼠vta脑区取材方法小鼠VTA脑区取材方法简介脑区取材是研究神经科学中至关重要的步骤之一。
而小鼠VTA（腹侧被盖区）是一个具有重要生理功能的脑区，因此其取材方法尤为重要。
本文将详细介绍几种常用的小鼠VTA脑区取材方法。
方法一：冰冻切片法1.准备工具和材料：小鼠脑，乙醇，刀片，冰冻剂（如乙脑）。
2.将小鼠的脑取出并迅速冷冻。
3.利用刀片将冷冻的小鼠脑切片，切得越薄越好。
4.将切片收集起来放入乙醇中浸泡，以去除残留的冰冻剂。
5.制备好的小鼠VTA脑区切片即可用于后续研究。
方法二：脑电图指导法1.准备工具和材料：小鼠，脑电图仪器，电极。
2.将小鼠进行麻醉操作，将电极植入小鼠脑内。
3.进行脑电图记录，根据脑电图上的信号变化找到VTA脑区的位置。
4.通过电极位置引导，取出VTA脑区样本。
方法三：免疫组织化学法1.准备工具和材料：小鼠脑，加权剂，抗体。
2.将小鼠的脑取出并固定在福尔马林中。
3.进行脱水、透明化等处理，以使脑组织适合免疫组织化学操作。
4.制备适当浓度的抗体，对小鼠脑组织进行免疫染色，以标记VTA脑区。
5.根据免疫染色结果，准确取出VTA脑区进行后续实验。
方法四：多色荧光染色法1.准备工具和材料：小鼠脑，荧光染料。
2.将小鼠的脑取出并固定在福尔马林中。
3.进行脱水、透明化等处理，使脑组织适合染色。
4.制备多种荧光染料的混合液，对小鼠脑组织进行染色，以区分VTA脑区。
5.利用荧光显微镜观察染色结果，准确定位并取出VTA脑区。
方法五：遗传学标记法1.准备工具和材料：转基因小鼠。
2.鉴定具有特定遗传学标记的小鼠品系，如tdTomato表达转基因小鼠。
3.麻醉小鼠，取出脑组织。
4.根据遗传学标记的特异性，轻松找到VTA脑区，取出样本。
总结本文介绍了几种常用的小鼠VTA脑区取材方法，包括冰冻切片法、脑电图指导法、免疫组织化学法、多色荧光染色法和遗传学标记法。
选择合适的方法取样，对于研究VTA脑区的生理功能具有重要意义。
取小鼠脑组织完整版
取小鼠脑组织HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】丁香园上面总结的方法，排版有点乱。
其实过程与大鼠近似，我的经验是：1.?材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等；2.?步骤：处死小鼠，取头颅；剪开皮肤，漏出颅骨；用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。
3.?注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。
做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。
先麻醉小鼠剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。
具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。
然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。
用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。
生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。
然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。
取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。
小鼠大脑神经元的分离方法
小鼠大脑神经元的分离方法
对小鼠大脑神经元进行分离有多种方法，以下是其中一种常用的方法：
1. 麻醉小鼠：使用麻醉药物如氯丙嗪、异氟醚等来使小鼠进入无痛觉状态，以便进行手术操作。
2. 颅骨切除：使用麻醉后，通过手术将小鼠的颅骨切开，暴露出大脑。
3. 大脑组织取样：使用特殊工具，如小型锐器或吸管，小心地取出大脑组织，通常是取得海马或皮层区域。
4. 组织切片：将取得的大脑组织用冷生理盐水或培养液冲洗，并用冷却的切片盐水将其切片成较薄的切片。
5. 酶消化：将切片置于含有特定酶（如胰蛋白酶或Papain等）的酶溶液中，进行一定时间的消化作用，以分离神经元。
6. 分离过滤：将消化后的组织通过一系列滤网筛选，以除去残留的组织块和细胞碎片，得到单个神经元。
7. 细胞培养：分离的神经元可被收集并培养在适当的培养基中，提供必需的营养和生长因子，以促进其生长和存活。
需要注意的是，神经元的分离过程需要严格操作和适当的实验
室设备，以确保获得高质量的神经元。
同时，涉及到动物实验的操作，需要遵循相关伦理和动物保护的规定。
冰冻切片技术
冰冻切片技术1：实验原理：利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻产生一定的硬度进行切片，与石蜡切片相比，冷冻切片不需要脱水处理。
因此制片速度快，是术中进行快速病理争端的良好方法。
2：实验步骤：①取材：从新鲜的小鼠中剖取肝、肺、心、胰腺、肾等组织器官至载玻片上②冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻住头温度和箱内温度调至-20--15℃，将组织器官移到涂了一层耦合剂的组织支承器冻面上，用镊子压平，再挤上一层耦合剂覆盖标本。
放至冰冻机中降温处理③标本冷冻后将组织支承器固定在切片机的机头上，调整机头的位置使其正好位于切片刀的后方。
④以粗修的方式粗修到暴露标本的最大平面，用毛笔清除机头、组织支承器及刀片上的组织碎屑。
⑤确认切片的厚度，一般为4到5vm不等，根据组织的不同可适当调整切片的厚薄。
⑥放下放卷板使其位置恰好与刀片的刀刃完全平行并略突出刀刃⑦以转动大轮推进的方式进行切片，良好的切片将在放卷板的下方形成一张完整平坦无褶的薄片，若切片略有弯曲，可用毛笔轻轻展平。
⑧打开放卷板，将标记好的载玻片平稳的轻压组织，使其平整的吸附到载玻片上。
⑨将切好的标本薄片迅速放入95％的乙醇固定液中进行3min的固定，再经过1min的流水冲洗，进入染色程序⑩按照：苏木素（1min）→流水冲洗（3min）→伊红染液（30s）→流水冲洗（1s）→85％乙醇→95%乙醇（10s）→无水乙醇①（30s）→无水乙醇②（1min）→二甲苯①（1min）→二甲苯②（1min）①将染色完成的标本使用树胶与盖玻片进行封片操作②将标本放到显微镜下，观察拍照记录10×、40×的镜下观3：实验结果：在镜下可观察到小鼠的肝细胞，细胞核被染成蓝色，胞质及细胞间隙被染成淡红色，同时可见大多数细胞中脂肪将细胞核挤到细胞一侧。
4：结果分析及讨论：①切片前先预调好厚度，提前准备好要使用的工具。
②切片时，观察窗不可打开过大，预防温度升高影响切片③在每一次切片之后都应该要注意清理碎屑，以防污染④严格把握染色时间，避免因染色时间太短或太长而影响实验观察5：思考题：①什么时候做冰冻切片：1：在手术:进行中，突然发现病人的病变原及诊断，判断病变是否为肿瘤2：判断肿瘤的良恶性2：了解淋巴结是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其他的治疗措施。
小鼠脑组织冰冻切片步骤
小鼠脑组织冰冻切片步骤
嘿，朋友们！今天咱就来讲讲小鼠脑组织冰冻切片那些事儿！这可是个技术活儿呢！
首先啊，你得把小鼠那小脑袋准备好呀。
就像厨师要准备好食材才能做出美味佳肴一样，咱得把小鼠的脑组织小心地取出来。
这可不是随随便便就能搞定的，得轻点儿、柔点儿，别把脑组织给弄坏喽。
然后呢，把脑组织放到专门的冰冻模具里。
这就好比给脑组织找了个小窝，让它舒舒服服地待着。
接下来，把模具放进液氮里速冻，那速度，可快啦，就像闪电一样！
速冻好了，就该切片啦！这就像是在给脑组织做造型呢，不过可得小心别切坏了。
切片机就像是个神奇的魔法工具，能把脑组织切成薄薄的一片片。
想象一下，那薄得像纸一样的切片，多神奇呀！
切好片后，把它们放到载玻片上。
这就像是给这些小切片找到了它们的舞台，准备开始它们的表演啦。
然后再进行一些处理，让这些切片能更好地展示出它们的秘密。
在这个过程中，每一步都得细心细心再细心，就像走钢丝一样，不能有一点儿马虎。
要是不小心出了差错，那可就前功尽弃啦！你说是不是？
哎呀，这小鼠脑组织冰冻切片可真是个有趣又有挑战的活儿呀！每一步都充满了奥秘和技巧。
只有用心去做，才能做出漂亮的切片，才能更好地去研究那些隐藏在脑组织里的秘密。
所以呀，朋友们，要是你们也对这个感兴趣，可得好好记住这些步骤，大胆地去尝试哦！相信你们一定能做出让自己满意的切片，去探索那些神奇的科学世界！这可不是开玩笑的哟，这是实实在在的技术活呢！加油吧！。
高质量脑组织快速冷冻切片的制作方法
高质量脑组织快速冷冻切片的制作方法一、前言脑组织快速冷冻切片技术是神经科学研究中常用的一种技术手段，它可以保持脑组织的形态结构和生物化学特性，为脑功能研究和神经病理学研究提供了可靠的样本。
本文将介绍高质量脑组织快速冷冻切片的制作方法，包括脑组织的采集、快速冷冻、切片等关键步骤，希望能为相关研究者提供参考。
二、脑组织样本的采集1. 动物模型：首先需要选择适合的动物模型，常见的包括小鼠、大鼠、猴子等。
在动物实验中应严格按照动物伦理学和法律法规的规定进行，确保动物实验的合法性和伦理性。
2. 人体样本：若为人体脑组织样本，应当遵守伦理道德标准，取得合法的医学研究伦理审批文件，并经过病理学专家鉴定和诊断，排除传染病和其他潜在风险。
三、脑组织的快速冷冻处理1. 快速冷冻：将新鲜脑组织迅速冷冻在-80℃以下的乙醇或异丙醇中，或者使用不含氯仿的干冰-异丙醇混合物，使得脑组织迅速达到冷冻状态。
2. 快速包埋：将冷冻处理后的脑组织迅速包裹于冷冻剂中，以防止其在冷冻过程中受到冰晶的损伤。
3. 快速冷冻切片：在液氮中迅速冷冻样本，然后使用快速冷冻微切机或其他切片设备进行薄切片，保持切片过程中的低温条件，以确保切片的高质量。
四、脑组织切片保存与后续处理1. 切片保存：将切好的脑组织切片放入特制的切片盒中，并存放在-80℃的超低温冷冻箱中保存，避免冻融造成切片结构的破坏。
2. 切片染色与分析：根据研究需要，可以对脑组织切片进行不同类型的染色，如Nissl染色、免疫组织化学染色等，然后进行显微镜观察与图像分析。
3. 数据分析：对染色后的切片进行图像采集、数据分析和统计处理，比较不同组的切片结构与生物标记物表达的差异，得出科学结论。
五、安全注意事项1. 实验操作中应遵循生物安全规范，避免感染危险性脑组织样本对人员和环境造成伤害。
2. 使用切片设备时，应严格按照操作规程进行，避免受伤和设备损坏。
3. 严格按照相关法规和标准处理动物样本和人体脑组织样本，确保实验过程的合法性和伦理性。
脑组织冰冻切片
脑组织冰冻切片1、冰冻切片的保存我做的脑组织，直接断头取脑，用OCT胶包裹脑组织，放入异戊烷中在-80度冰箱中速冻1分钟，取出后用锡箔纸包好，冻存于-80度冰箱保存。
切片前-20度回温半小时，即可切片。
冰冻切片也放-80度冰箱保存。
做组化时用4%多聚甲醛放4度固定15分钟。
如果标本量较多，需要保存一段时间后再冰冻切片，我目前是把标本经OCT包埋后，液氮速冻，待OCT完全冻硬变白后，转入-80度保存。
这样处理的标本，切出来的片子很好看！也没有冰晶。
2、作了冰冻切片但不能马上染色，切片应如何保存呢？①如果想第二天做，可以直接放在4度，如果想多放几天，冰冻切片干后以冷丙酮固定10分钟，放入－20度冰箱保存至染色可行。
我曾保存了一个多月都没问题。
染色前，从冰箱取出后4度复温20min，再室温复温15min即可。
用PBS洗后，即可接后续步骤。
②两点个人经验，仅供参考：1、如果切片为40微米或者更厚，放在PBS中，液体要足够多，至少没过组织切片，建议用24或48孔细胞培养板，放好后将培养板四周用胶布或封口膜密封，以确保水份不蒸发，存放两个月不会出问题。
不过在移动细胞培养板时千万要注意保持水平，以免组织切片移到相邻的孔内，那样的话，就搞不清次序了！2、如果切片为20微米或者更薄，先自然干燥，然后放切片盒中室温保存即可。
一般3个月是不会有问题的。
③正常包埋，然后将整个包埋块用封口膜封好，置于－20度或－80度（前者一般2个月没问题，后者时间更长），重点是防止包埋块的风干，当攒齐了不同时间点或者暴露于不同处理因素的标本后，一起切片，一起染色，效果很好。
[设计]尼氏染色步骤
![[设计]尼氏染色步骤](https://img.taocdn.com/s3/m/8e092ac33086bceb19e8b8f67c1cfad6195fe9b3.png)
小鼠脑冰冻切片后，想做尼氏染色，用焦油紫，具体步骤是什么？焦油紫的溶液该如何配制？焦油紫染液的配制：焦油紫/0.1g蒸馏水/99ml1%冰醋酸1ml冰冻切片氯仿中1分钟；无水酒精中1分钟；95%酒精、70%酒精各1分钟，蒸馏水洗片刻；进入焦油紫染液染色30分钟（37度温箱中染色10分钟），蒸馏水洗涤；95%酒精分色；常规脱水、透明、封片。
尼氏体呈紫色，细胞核呈淡紫色，胶质细胞呈淡紫色。
mickeyzq wrote:焦油紫染液的配制：焦油紫/0.1g蒸馏水/99ml1%冰醋酸1ml冰冻切片氯仿中1分钟；无水酒精中1分钟；95%酒精、70%酒精各1分钟，蒸馏水洗片刻；进入焦油紫染液染色30分钟（37度温箱中染色10分钟），蒸馏水洗涤；95%酒精分色；常规脱水、透明、封片。
尼氏体呈紫色，细胞核呈淡紫色，胶质细胞呈淡紫色。
你的没有经过复染，对比也可以这么鲜明啊我用的是1％的甲苯胺蓝，具体步骤是：常规石蜡切片，二甲苯透明，酒精梯度复水，入1％甲苯胺蓝室温下染3min，自来水冲洗，95％酒精分化，0.5％伊红复染1s，水洗，透明封片，但是结果不好，伊红复染后颜色很深，原来的蓝色被覆盖的很严重，不知道该怎么改进换焦油紫看看,焦油紫着色比较深.（二）神经细胞尼氏体染色正常的神经细胞都含有一定数量的尼氏化，它们主要分布于神经细胞的浆中，形状有大有小，如三角形，有的为椭圆形。
这些物质能被大部分的蓝色染料所染色，这些染料如焦油坚牢紫（Cresyl fast violet）亚甲蓝（methylene blue）甲苯胺蓝（toluidine blue）硫董（thionin）等钭其染为蓝色。
但是，当神经细胞受伤后，胞质内的尼氏体更可发生变化，严重的可消失。
焦油坚牢紫显示尼氏体焦油坚牢紫1g蒸馏水100ml*作方法：1、切片脱蜡至水2、用焦油坚牢紫水溶液浸染20-30分钟3、水洗4、用95%酒精分化5、无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶结果：神经细胞单位：紫-蓝色细胞核：紫-蓝色尼氏体：紫-深蓝色注意：1、应用酒精分化切片，要迅速，防止过度分化，将切片上的颜色全部脱掉。
小鼠冷冻切片染色方法
小鼠冷冻切片染色方法冷冻切片是一种常用的组织切片方法，它可以保留组织的形态结构和细胞器的完整性，适用于各种组织类型和研究目的。
小鼠冷冻切片染色是研究小鼠组织形态结构和功能的重要手段之一。
一、准备工作1. 准备小鼠组织样本：选择合适的小鼠品系和年龄，根据需要选择特定的组织进行研究。
2. 取出组织：将小鼠安乐后，迅速取出需要的组织，如肝脏、肺组织等。
3. 组织固定：使用适当的固定剂（如4%的中性缓冲福尔马林），将组织固定一段时间（一般为4-24小时）。
二、冷冻切片1. 组织包埋：将固定的小鼠组织用含有20%蔗糖的缓冲液浸泡数小时以增加切片的易切性。
2. 冷冻切片机准备：将冷冻切片机的切片台温度设置为-20°C或以下，并将切片刀预冷至-20°C。
3. 切片操作：将组织放置在切片台上，并用冷冻剂（如液氮）冷冻组织。
使用预冷的切片刀，将组织切成薄片（一般为10-20 μm厚）。
4. 切片收集：用刷子或刮刀将切片收集到载玻片上，并保持切片的完整性和均匀性。
三、染色方法1. 常规染色：常用的染色方法包括组织学染色（如伊红染色、苏木素-伊红双染色等）和细胞染色（如核染色、胞浆染色等）。
这些染色方法可以直接观察组织的形态结构和细胞器的分布情况。
2. 免疫染色：免疫染色是一种利用抗体特异性结合的原理来标记特定蛋白质的方法。
通过与特定抗体的反应，可以检测和定位特定的蛋白质在组织中的分布情况。
3. 分子标记染色：分子标记染色是一种利用分子探针对特定基因或序列进行染色的方法。
常用的分子标记染色方法有原位杂交和荧光原位杂交等，可以用来检测和定位特定基因的表达情况。
四、结果分析1. 显微镜观察：将染色后的切片放置在显微镜下观察，可以通过放大镜头观察切片的细节和染色的结果。
2. 图像分析：使用图像分析软件对显微镜下观察的图像进行处理和分析，可以获取更加准确和详细的结果。
总结：小鼠冷冻切片染色是一种常用的研究小鼠组织形态结构和功能的方法。
抗冻缓冲液保存冰冻切片的研究
抗冻缓冲液保存冰冻切片的研究雷德亮;罗学港;Peter R. Mouton;Donald K. Ingram【期刊名称】《中南大学学报（医学版）》【年(卷),期】2004(029)002【摘要】目的:研究抗冻缓冲液(anti-freeze buffer, AFB)对冰冻切片的长期保存作用.方法:4只12～15月龄的雌性C57BL/6NIA小鼠常规灌注取脑,50 μm冰冻切片,将切片于-20℃保存于抗冻缓冲液中,分别于切片的当日、切片后3个月、6个月和12个月, 行β-NADPH酶组织化学和GFAP免疫组织化学染色. 结果: 于-20℃冰箱保存在AFB内的冰冻切片,至6个月时,β-NADPH 酶组织化学显示的含一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS) 的神经元和毛细血管与新鲜标本没有区别;至12个月时,GFAP免疫组织化学染色显示的星形胶质细胞与新鲜标本没有区别.结论: AFB可较长时间保存组织切片的抗原成份和酶活性,是形态学研究领域较好的保存冰冻切片的方法.【总页数】4页(P166-169)【作者】雷德亮;罗学港;Peter R. Mouton;Donald K. Ingram【作者单位】中南大学湘雅医学院人体解剖学和神经生物学系,长沙410013;中南大学湘雅医学院人体解剖学和神经生物学系,长沙410013;National Institute of Health, Gerontology Research Center, Baltimore, MD, USA;National Institute of Health, Gerontology Research Center, Baltimore, MD, USA【正文语种】中文【中图分类】R446.8【相关文献】1.旋毛虫肌幼虫冰冻切片保存不同时间后抗原性的观察 [J], 晋雪香;崔晶;王中全2.冷冻保存连续冰冻切片在免疫组化染色中的应用 [J], 赵莹;魏晓晴;崔颖;高颖3.甲状腺冰冻切片与石蜡切片病理诊断价值的对照研究 [J], 付刚4.冰冻切片与石蜡切片诊断甲状腺疾病的临床价值研究 [J], 王洋; 王翠芳5.乳腺肿瘤术中快速冰冻切片与常规石蜡切片病理诊断准确率的比较研究 [J], 彭凤翔因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
冰冻切片漂片
免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）免疫组化步骤：1.将脑片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；2.吸去双氧水，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4.然后，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃；5.然后，PBS洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。
6.DAB配方为：10mgDAB固体加到20ml0.01MPBS，临用时加100-200微升30%双氧水，注意避光。
7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。
一般3分钟显色就比较明显，如果20分钟仍未显色，则看下面的参考。
8.然后PBS洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。
干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。
9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。
如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。
免疫荧光步骤及注意事项：1，将脑片放到6空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）2，吸去山羊血清，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3，然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48或72小时；5，然后，PBS洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1 冰冻切片先固定还是先切片，是否需要置于室温放置30分钟，针对脑组织具体用什么固定剂和固定步骤比较好？
我们实验室鼠脑冰冻切片采用4%的多聚甲醛固定，小鼠直接灌注saline20ml，4%多聚甲醛20ml 经左心室固定然后取材在4度4%多聚甲醛后固定4-6h，浸20%-30%糖沉底，就可以切片，切片首先需要冰冻切片机，我们的leica1900的，不知道lz那里有没有这个机子，还又一种原始的自己刷冻台的那种，比较麻烦，切片厚度大概选择20-40um差不多
2 有人说石蜡切片的清晰度比冰冻切片更高，是否属实？
由于石蜡切片的厚度在4-6um之间，这是冰冻切片远远达不到的境界，这要根据你的实验选择，神经元的直径一般在10-12um之间，这样冰冻切片如果做双标最好选择免疫荧光。
但是冰冻切片抗原保护的比石蜡好。
3 脑组织的冰冻切片怎么保存最好？
冰冻切片一般现切现做，如果实在要保存就浸泡在0.01mpbs4度保存最多一个星期，尽量切完片子就做。