取小鼠脑组织

丁香园上面总结得方法,排版有点乱、

其实过程与大鼠近似,我得经验就是:ﻫ1。材料准备;大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等;ﻫ2。步骤:处死小鼠,取头颅;

剪开皮肤,漏出颅骨;ﻫ用大尖镊子夹住两侧眼眶,用眼科剪稍剪除颅骨中线;ﻫ再

用眼科镊夹住颅骨从内向外夹,从下向上逐步去除颅骨;

当全脑露出时,再用眼科镊去除脑膜与血管;ﻫ然后用竹签从嗅球处向下取出全脑,即可。

3。注意事项:用力轻柔,否则容易弄破脑部;ﻫ用剪刀剪颅骨时,一定要贴壁向上剪,否则容易剪破脑部;ﻫ去除脑膜时,不能硬拉,否则容易弄破大脑;ﻫ取出全脑时应把头顶朝下,用竹签轻轻取出,离桌面也不要太远、高;ﻫ若留病理,建议一定要取完整无损得大脑。

做免疫组化得话,稍微麻烦一点儿,因为脑组织含水量多,要固定得好,就需要先灌注。ﻫ先麻醉小鼠ﻫ剪开胸腔,找到心脏,从心尖入针,剪开右心耳

先用生理盐水灌注直到从心耳流出来得水清亮了ﻫ再改用固定液(一般就是４%多聚甲醛)灌注至小鼠四肢僵硬

小鼠只需要用注射器就行了,我做得25～3５g得小鼠一般用50mLNＳ+3０mL多聚甲醛。具体步骤:常规麻醉小鼠,将其固定,用剪刀剪开胸部皮肤,暴露出皮下组织,剪开时注意钝性分离,以免误伤。然后用镊子提起剑突,用剪刀剪开胸腔,剪断两侧肋骨,暴露整个胸腔,小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜,暴露心脏,用眼科剪剪开右心耳,然后提起心尖将准备好得生理盐水注射器插入左心室,注射,注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺与肝得颜色都变成灰白色即可、然后用多聚甲醛灌流,针孔最好就是同一个,多聚灌流时小鼠四肢会抽搐,待抽搐结束,小鼠僵硬即可。取下小鼠,用剪刀在颈部离断头颅,用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀,将两边皮肤向下翻用手捏住,暴露整个颅骨,用眼科剪从脊髓端插入椎孔,沿着颅正中线剪开颅骨,注意剪刀向上翘一些,以免误伤脑组织,剪开后用弯眼科镊分离颅骨,小心分离,直至暴露整个大脑,然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经,就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。

具体操作如下:ﻫ实验操作步骤:ﻫ1) 小鼠称重,以每克小鼠０、00２5ｍl 4％戊巴比妥钠剂量得实施腹腔麻醉、也可以用10％得水合氯醛,3－5ｕl/g腹腔注射麻醉。ﻫ２) 将麻醉得小鼠仰放在操作台上,去毛、

3) 解剖小鼠,暴露心脏。

4) 找到心尖部,左手用镊子提起心尖部,右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约 0.5cｍ(最好就是用小点得针头,用止血钳固定针尖,剪开右心耳、ﻫ

５) 将灌流器得导管部开口放到生理盐水中里,打开灌流器灌流,直到从右心耳流出得液体为无色,同时小鼠肝脏色淡,肠管肿胀为止,停止灌流。没有灌流器得用注射器或者吊瓶都可以。ﻫ6) 将灌流器得导管小心得移至4%多聚甲醛或２、5%戊二醛中,注意不要产生气泡,开始灌流。此时如果瞧到小鼠四肢突然紧张,尾部卷曲,说明达到固定效果。

7) 灌流大约5分钟,灌流液用量约150毫升左右结束、(小鼠得用量没这么多)ﻫ８) 取材、取实验所需得标本、

９) 将取出得材料放到事先准备得多聚甲醛(戊二醛)中固定2—-4小时后移至3０%蔗糖中4度冰箱保存过夜。

我们实验室鼠脑冰冻切片采用4％得多聚甲醛固定,小鼠直接灌注sａlｉnｅ20ｍl,4％多聚甲醛2０ml经左心室固定然后取材在4度４％多聚甲醛后固定4－６h,浸20%－30%糖沉底,就可以切片,切片首先需要冰冻切片机,我们得leｉｃ

a1900得,不知道ｌz那里有没有这个机子,还有一种原始得自己刷冻台得那种,比较麻烦,切片厚度大概选择2０-40um差不多ﻫﻫ开胸时要把肋骨提起,大U字剪开左右肋弓后掀起,血管钳固定一下(以免挡遮视野);平头针插入后稍许打开输液器开关并迅速剪开充盈得右心耳(可见血涌出),用血管钳将心室与平头针一起钳夹固定再推(但滴速也不能太快以免血管被冲破,使灌流液流进肺里)。另:开胸时动作尽量要快;针头可以不插入主动脉,留置于左室也行。ﻫ

试剂名称:4%多聚甲醛-磷酸二氢钠／氢氧化钠ﻫ所需药品及剂量:A液:多聚甲醛４0g

蒸馏水４00ml

B液:Na2ＨPO４·2H２O 6、88g

蒸馏水 30０mlﻫC液:NａOH ３。86g

蒸馏水2０0m

操作过程:Ａ液最好在500ml得三角烧瓶中配制,至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意,在溶解多聚甲醛时,要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液与C液配制好后,将B液倒入C液中,混合后再加入Ａ液,以1ｎＮaOH或1Ｎ HＣｌ将pH 调至7。２～7、4,最后,补充蒸馏水至１０00ml充分混合ﻫ应用范围:光镜与电镜免疫细胞化学研究,用于免疫电镜时,最好加入少量新鲜配制得戊二醛

保存期限及温度:4℃冰箱保存备用,长期保存

我在很多方面就是个新手,经常在园子里逛,学到了很多东西,但同时也瞧到了关于同一个问题有很多不同得回答,我想结合自己得实验,希望各位老师能就我提出得问题说说自己得经验瞧法,给我启示,因为很多自己未做过,怕自己哪里操作不恰当而影响实验结果,非常感谢各位老师得不啻赐教!

ﻫ首先,我做得就是大鼠(体重约２30—2５0g),模型就是大脑中动脉栓塞,在不同得时间点取脑标本,准备做荧光实时定量PCR、Wesｔern bｌot与冰冻切片,我提得问题主要就是在于脑标本得取与存方面。

问题如下:

荧光实时定量ＰＣＲ方面:ﻫ1、标本需要灌注么,有战友说不需要,您就是怎么做得,有灌注得话什么溶液灌注,温度？ﻫ2、标本取下后液氮速冻,然后转-80度冰箱,这样保存一般可以多久?ﻫ3、抽提后得中RNA放-８0度冰箱会很容易降解么,还就是说要放液氮？

ﻫＷesterｎ blot方面:ﻫ4、标本用什么溶液灌注,温度?

5、同一个标本可以同时用于ＲT—ＰCR与Wesｔerｎｂlot检测么？(如果灌注手段一样得话)

冰冻切片方面:ﻫ6、灌注冲血用什么溶液,温度？ﻫ7、4％多聚甲醛灌注固定一般灌注多常时间？多少毫升？ﻫ8、4％多聚甲醛后固定时间就是多久为宜?

9、蔗糖梯度脱水,蔗糖就是用什么配置得,PBＳ还就是PB,浓度就是多大得?蔗糖梯度就是1５％到20%再30%么?在每种浓度里沉底后就换另一种还就是?

10、我试做过一次,做法为:常规多聚甲醛灌注固定后,再多聚甲醛后固定过夜,然后３０%得蔗糖脱水,这些都就是用0。1Ｍ得ＰBＳ配得,结果发现蔗糖脱水3