叶绿素a测定

实验三富营养化湖中藻量的测定（叶绿素a法）

一、实验目的

富营养化湖由于水体受到污染，尤以氮磷为甚，致使其中的藻类旺盛生长。此类水体中代表藻类的叶绿素a浓度常大于10微克/升。

本实验通过测定不同水体中藻类叶绿素a浓度，以考查其富营养化情况。

二、器材与用品

1、分光光度计（波长选择大于750nm，精度为0.5－2nm）。

2、比色杯（1cm；4cm）。

3、台式离心机（3500r/min）

4、离心管（15ml具刻度和塞子）；冰箱

5、匀浆器或小研钵。

6、蔡氏滤器；滤膜（0.45微克，直径47mm）。

7、真空泵（最大压力不超过300kpa）。

8、MgCO3悬液：lg MgCO3细粉悬于100ml蒸馏水中。

9、90％的丙酮溶液：90份丙酮＋10份蒸馏水。

10、水样：两种不同污染程度的湖水水样各2L.

三、方法和步骤

1、按浮游植物采样方法，湖泊、水库采样500ml，池塘300ml。采样点及采水时间同“浮游植物”。

2、清洗玻璃仪器：整个实验中所使用的玻璃仪器应全部用洗涤剂清洗干净，尤其应避免酸性条件下而引起的叶绿素a分解。

3、过滤水样；在蔡氏滤器上装好滤膜，每种测定水样取50－500ml减压过滤。待水样剩余若干毫升之前加入0.2ml MgCO3悬液、摇匀直至抽干水样。加入MgCO3可增进藻细胞滞留在滤膜上，同时还可防止提取过程中叶绿素a被分解。如过滤后的载藻滤膜不能马上进行提取处理，应将其置于干燥器内，放冷（4℃）暗处保存，放置时间最多不能超过48小时。

4、提取；将滤膜放于匀浆器或小研钵内，加2－3ml90％的丙酮溶液，匀浆，以破碎藻细胞。然后用移液管将匀浆液移入刻度离心管中，用5ml90％丙酮冲洗2次，最后向离心管中补加90％丙酮，使管内总体积为10ml。塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物，充分振荡，放冰箱避光提取18－24小时。

5、离心：提取完毕后，置离心管于台式离心机上3500r/min，离心10min，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞上塞子，3500r/min在离心10min。正确记录提取液的体积。

6、测定光密度：藻类叶绿素a具有其独特的吸收光谱（663nm），因此可以用分光光度法测其含量。用移液管将提取液移入1cm比色杯中，以90％的丙酮溶液作为空白，分别在750、663、645、630nm波长下测提取液的光密度值（OD）。注意：样品提取的OD663值要求在0.2与1.0之间，如不在此范围内，应调换比色杯，或改变过滤水样量。OD663小于0.2时，应该用较宽的比色杯或增加水样量；OD663大于1.0时，可稀释提取液或减少水样滤过量，使用1cm比色杯比色。

7、叶绿素a浓度计算：将样品提取液在663、645、630nm波长下的光密度值（OD663OD645OD630）分别减去在750nm下的光密度值（OD750）,，此值为非选择性本底物光吸收校正值。叶绿素a浓度计算公式如下：

（1）样品提取液中的叶绿素a浓度Ca为：

Ca(微克/升)＝11.64（OD663－OD750）－2.16（OD645－OD750）+0.1（OD630－OD750

（1）水样中叶绿素a浓度为：

叶绿素a(微克/升)＝Ca×v/(V×L)

（2）

叶绿素a(微克/升)＝Ca×v/V×L

Ca：样品提取液中叶绿素a浓度(微克/升)

v ：90％丙酮提取液体积(ml)

V：过滤水样的体积（L）

L：比色杯宽度（cm）

四、实验报告

将测定结果记录于表4－1中

表4－1 测定结果

根据测定结果，参照表4－1中指标评价被测水样的富营养化程度。

表4－2 湖泊富营养化的叶绿素a评价标准

五、思考题

1、比较两种水样中的叶绿素a浓度，通过本实验你的结论是什么？

2、如何保证水样叶绿素a浓度测定结果的准确性？主要应注意哪几个方面的问题？