实验六叶绿素A、B 含量的测定
叶绿素a测定实验报告
叶绿素a测定实验报告（一）实验目的及意义水体富营养化可以通过跟踪监测水中叶绿素的含量来实现，其中叶绿素a是所有叶绿素中含量最高的，因此叶绿素a的测定能示踪水体的富营养化程度。
（二）水样的采集与保存1.确定具体采样点的位置2.在采样点将采样瓶及瓶盖用待测水体的水冲洗3-5遍3.将采样瓶下放到距水面0.5-1m处采集水样2.5L4.在采样瓶中加保存试剂，每升水样中加1%碳酸镁悬浊液1mL5.将采样瓶拧上并编号6.用GPS同步定位采样点的位置（三）仪器及试剂仪器：1.分光光度计2.比色池：10mm3.过滤装置：过滤器、微孔滤膜（孔径0.45μm，直径60mm）4.研钵5.常用实验设备试剂：1.碳酸镁悬浮液：1%。
称取1.0g细粉末碳酸镁悬浮于100mL蒸馏水中。
每次使用时要充分摇匀2.乙醇溶液（四）实验原理将一定量的试样用微孔滤膜过滤，叶绿素会留在滤膜上，可用乙醇溶液提取。
将提取液离心分离后，测定750、663、645、630mm的吸光度，计算叶绿素的浓度。
（五）实验步骤1.浓缩：在一定量的试样中添加0.2mL碳酸镁悬浮液，充分搅匀后，用直径60mm 的微孔滤膜吸滤.过滤器内无水分后,还要继续抽吸几分钟.如果要延时提取,可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。
2. 提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入7mL乙醇溶液至滤纸浸湿的程度,把滤膜研碎,再少量地加乙醇溶液，把滤膜完全研碎，然后用乙醇溶液将已磨碎的滤膜和乙醇溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离心管内提取液的总体积不超过10mL，盖上管塞，置于的暗处浸泡24h。
3.离心：将离心管放入离心机中，以4000r/min速度离心分离20min。
将上清液移入标定过的10mL具塞刻度管中，加少量乙醇于原提取液的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。
此操作重复2-3次，直至沉淀不含色素为止，最后将上清液定容至10mL。
4.测定：取上清液于10mm的比色池中，以乙醇溶液为对照溶液，读取波长750,663,645和630mm的吸光度。
植物生理学实验讲稿
实验一
植物蒸腾强度的测定
一、植物蒸腾强度的测定 （钴纸法，p.14） 蒸腾作用是植物根系吸水的主要动力，蒸腾强度的大小 在一定程度上反映了植物生命活动（代谢）的强弱。测定 方法较多，其中钴纸法较为简单、适用。也可用光合蒸腾 仪测定，精确度更高。 1. 原 理： 单位面积的氯化钴纸吸收水量一定。 2. 氯化钴纸的制备 5 %CoCl2浸泡滤纸，60～80℃烘干，干燥皿中保存。 3. 钴纸标化：标准吸水量（X）=0.023 g/dm2 4. 材 料：红苕、天竺葵等（叶片） 5. 测 定： 用二玻片夹住叶片，橡皮筋固定。测定上、下表皮上的 钴纸由蓝色变为粉红色的时间（秒），重复3次。吸水变红 的钴纸，用电吹风吹干后再用。
4、测定准备。把连接参考气源的长塑料管子连接到面板上的“IN”接 气嘴上，并把手柄上的两根标有“IN2”、“OUT2”的管子分别与面 板上的“IN2”、“OUT2”接气嘴相连；同时，把手柄上传感器电缆 的插头插到面板上的“手柄连接”插座上，并拧紧。 5、测定。按下“参/初”键，待显示器（8）的 CO2 浓度值相对稳定 后，按下“测/终”键（CO2 初始值确定，待测CO2 最终值）；把 待测叶片夹到叶室上（叶片面积必须大于叶室面积，且使叶室密 封），当显示器（9）显示的 CO2浓度值相对稳定后，按下“完成” 键（CO2 最终值确定）。记下各显示器的数值。 6、更换叶片，重复上述第 “5” 步测定，共 3 次。 7、测定完毕，按回“开/闭路”测量键、“气泵”键、“电源”键， 结束开路测量。 8、将所得各显示器的数值，按要求输入本仪器自带软件，得到样品 的（净）光合速率（和蒸腾速率），计算3次平均值。
分子量no6作业计算材料由kno1fw193处理01moll磷酸缓冲液ph755ml蒸馏水5ml01moll磷酸缓冲液ph755ml02mollknoml4实验步骤材料0304处理液三角瓶抽气5min30酶促反应30min反应液1ml显色30min测定od5205标准曲线的制作nano取各标准液1ml于试管中加磺胺试剂2ml摇匀加萘胺试剂2ml摇匀30显色30min测定od5206作业计算材料由kno1fw20实验五叶绿体色素的提取分离及理化性质的鉴定一层析用叶绿体色素的提取及色素分离1原理叶绿体色素各组分的脂溶性和分子量不同可用有机溶剂层析分离
不同环境条件下植物叶绿素a、b含量的比较(分光光度法测定)
一、实验课题名称不同环境条件下植物叶绿素a、b含量的比较（分光光度法测定）二、文献综述1.叶绿素a的生物合成过程起始物是谷氨酸，之后为5-氨基酮戊酸，两分子的ALA缩合形成胆色素原(PBG),4分子PBG相互连结形成原中卟啉IX.原卟啉IX与Mg结合形成Mg-原卟啉原IX，光下E环的环化形成，D环的还原作用和叶绿醇尾部的连接完成了整个合成过程，合成过程中的许多步骤在图中已省略2.影响叶绿素形成的条件（1）光光是影响叶绿素形成的主要条件。
从原叶绿素酸酯转变为叶绿酸酯需要光，而光过强，叶绿素又会受光氧化而破坏。
黑暗中生长的幼苗呈黄白色，遮光或埋在土中的茎叶也呈黄白色。
这种因缺乏某些条件而影响叶绿素形成，使叶子发黄的现象，称为黄化现象(etiolation)。
也有例外情况，例如藻类、苔藓、蕨类和松柏科植物在黑暗中可合成叶绿素，其数量当然不如在光下形成的多；柑橘种子的子叶及莲子的胚芽在无光照的条件下也能形成叶绿素，推测这些植物中存在可代替可见光促进叶绿素合成的生物物质。
(2)温度叶绿素的生物合成是一系列酶促反应，受温度影响。
叶绿素形成的最低温度约2℃，最适温度约30℃,最高温度约40℃。
秋天叶子变黄和早春寒潮过后秧苗变白，都与低温抑制叶绿素形成有关。
高温下叶绿素分解大于合成，因而夏天绿叶蔬菜存放不到一天就变黄；相反，温度较低时，叶绿素解体慢，这也是低温保鲜的原因之一。
(3)营养元素叶绿素的形成必须有一定的营养元素。
氮和镁是叶绿素的组成成分，铁、锰、铜、锌等则在叶绿素的生物合成过程中有催化功能或其它间接作用。
因此，缺少这些元素时都会引起缺绿症(chlorosis)，其中尤以氮的影响最大，因而叶色的深浅可作为衡量植株体内氮素水平高低的标志。
(4)氧缺氧能引起Mg-原卟啉IX或Mg-原卟啉甲酯的积累，影响叶绿素的合成。
(5)水缺水不但影响叶绿素生物合成，而且还促使原有叶绿素加速分解，所以干旱时叶片呈黄褐色。
通过对室外旱池处理条件下的甘薯叶片叶绿素含量变化的研究，结果表明，水分胁迫下甘薯品种叶片中叶绿素a、b及总叶绿素含量比对照均有所下降，叶绿素a/b比值比对照也有所下降，且叶绿素a/b比值占对照百分率与品种抗旱性呈极显著负相关。
实验六 叶绿素的提取、分离
叶绿素的提取、分离一、实验目的1.掌握从植物叶中提取叶绿素的方法。
2. 了解纸层层析的原理，掌握纸层析的一般操作和定性鉴定方法。
二、实验原理1. 叶绿素提取原理：叶绿素等是脂溶性的有机分子，根据相似相溶的原理，叶绿体中含有叶绿体色素（叶绿素a和b、胡萝卜素及叶黄素）等色素分子溶于有机溶剂而不溶于有极性的水。
故在研磨和收集叶绿色素时要用丙酮或乙醇等有机溶剂提取而不用水。
2. 色素分离的原理：纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。
滤纸上吸附的水为固定相（滤纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。
把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续一次有一次的分配。
结果分配比比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上，从而达到分离的目的。
毛细管点样薄层色谱展开三、仪器和药品研钵、毛细管、漏斗、纱布、小烧杯、试管、培养皿等剪纸形状滤液基线95%酒精、丙酮、石油醚碳酸钙，石英砂四、实验步骤（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片20g左右，洗净，用滤纸擦干，去掉叶柄和中脉剪碎，放入研钵。
（2）研钵中加入少量碳酸钙和石英砂，加4-5ml 无水乙醇，研磨至糊状，再加10ml 无水乙醇充分混匀以提取叶片匀浆中的色素，15-20分钟后，过滤入50ml锥形瓶中加塞待用。
分离：（1）取圆形定性滤纸一张（直径15cm），将其剪成滤纸条（15cm×2cm），将其2cm一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm，宽约0.5cm的窄条，并在滤纸剪口上方用铅笔画一条直线，作为画滤液细线的基准线（注意：滤液线必须距底边1-1.5cm）。
实验六叶绿体色素的质及叶绿素ab含量的测定
叶绿素a、b含量：
C×提取液体积（20ml）×稀释倍数（10） (mg / g)
样品的重量（1g）
取分液漏斗
加20ml乙醚
加提取液10ml
？ 摇动
沿漏斗边缘加30ml蒸馏水
？ 轻摇，静置
·· 蒸馏水冲洗1～2次
分层，弃去下层 加5ml 30％KOH甲醇溶液，
用力摇动 ··
振动，静置
？ ？ 静置10min
加水10ml
分层
作业
描述各实验结果并作出解释
二、叶绿素a、b含量测定
实验原理
叶绿体色素
类胡萝卜素 （含量占1/4）
Ⅰ
Ⅱ
Mg
Ⅳ
Ⅲ
Ⅴ
头部：4个吡咯环+4个甲烯基 连接，形成卟啉环，卟 啉环+Mg，与四个吡咯 环上的N相连，再与一 个副环相连
尾部：C20H39(叶醇)
叶绿素的降解与色变
-COOCH3
-COOCH3
5. 叶绿素的荧光现象：
取提取液少许于试管中，分别观察在反射光和透射光
？ 一侧提取液的颜色
6. 黄色素与绿色素的分离
叶绿素 （含量占3/4）
胡萝卜素 叶黄素 叶绿素a 叶绿素b
分光光度法
根据叶绿素对某一特定波长的可见光具有吸收能力， 用Lambert- Beer定律计算出叶绿素的含量。
吸光度
Lambert- Beer定律
A ＝ KLC
浓度
吸收系数
叶绿素b的最大吸收峰：645nm 叶绿素a的最大吸收峰：663nm
Lambert- Beer定律 A ＝ K LC
A――吸光度 K――吸收系数 C――浓度
Ka663：82.04 Kb663：9.27 Ka645：16.75 Kb645：45.60
实验5 叶绿素a与叶绿素b含量的测定
C—叶绿素的浓度（mg/L)；v—提取液体积(ml)； n—稀释倍数；m—样品鲜重（g)
作业：
比较阳生植物和阴生植物的叶绿素有何不 同？
下周实验：植株磷素的测定(钼蓝法)
三、实验器料
1、材料： 菠菜或其它绿色植物叶片
2、试剂： 80% 丙 酮 或 96% 乙 醇 ； 石 英 砂 ；
CaCO3； 3、仪器：分光光度计（分光光度计
的使用）、高速离心机
四的植物叶片，称取0.2g剪碎后置 于研钵中，加入5ml 80%丙酮，少许CaCO3和 石英 砂。充分研磨（组织变白），再加10ml80%丙 酮，静止3-5分钟，冲洗研钵后转至离心管，定 容至15ml,3000转、15分钟，取上清液用80% 丙酮 定容至25ml。
2. 测定OD值： 取上清液1ml，加80%丙酮4ml， 以80%丙 酮
作空白对照，用分光光度计分别测定叶绿 素提取液在645nm、663nm、470 nm下的吸
光度。 3.计算：
把测出的吸光值带入(1)(2)(3)(4)式计算叶 绿素a、b、a+b和类胡萝卜素的浓度。 根据下式求出植物组织中叶绿素的含量：
实验六 叶绿素含量的测定
一、实验目的
1、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶 液中测定叶绿素a、b和类胡萝卜素 的方法及计算；
2、测定叶绿素含量a与叶绿素b含量 的意义。
二、实验原理
叶绿素提取液中同时含有叶绿素a、叶绿素b和 类胡萝卜素，三者的吸收光谱虽有不同，但又 存在着明显的重叠，在不分离他们的情况下同 时测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的浓度， 可分别测定在663nm、645nm、470 nm （分别是叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素在红 光区的吸收峰）的光吸收，然后根据 Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素 a、叶绿素b、和类胡萝卜素的浓度。
植物生理学实验五叶绿素a 、b 含量的测定(分光光度法)
实验步骤
4. 称重比较：将叶片对应部位重叠在一起，用 打孔器均匀打相同数目的孔（50），分别置 于光照及黑暗的两个称量皿中，80-90℃下 烘干至恒重，在分析天平上称重比较。
实验原理
改良半叶法是将植物对称叶片的一部分遮光或取 下置于暗处，另一部分则留在光下进行光合作用， 过一定时间后，在这两部分叶片的对应部位取同 等面积，分别烘干称重。因为对称叶片的两对应 部位的等面积的干重，开始时被视为相等，照光 后叶片重量超过暗中的叶重，超过部分即为光合 作用产物的量，并通过一定的计算可得到光合作 用强度。
结果分析
1. 仔细观察和记录实验结果。 2. 计算出Ca、Cb及总Ct的质量浓度。 3. 计算今天菠菜中Ca、Cb及总Ct的含量。 叶绿素a的含量（mg/g鲜重）= 叶绿素b含量（mg/g鲜重）= 叶绿素c含量（mg/g鲜重）=
韩山师范学院生物系
植物生理学实验
实验六 植物光合强度的测定 （改良半叶法）
叶绿素叶绿素aa的含量的含量mggmgg鲜重鲜重叶绿素叶绿素bb含量含量mggmgg鲜重鲜重叶绿素叶绿素cc含量含量mggmgg鲜重鲜重韩山师范学院生物系韩山师范学院生物系植物生理学实验植物生理学实验改良半叶法是将植物对称叶片的一部分遮光或取改良半叶法是将植物对称叶片的一部分遮光或取下置于暗处另一部分则留在光下进行光合作用下置于暗处另一部分则留在光下进行光合作用过一定时间后在这两部分叶片的对应部位取同过一定时间后在这两部分叶片的对应部位取同等面积分别烘干称重
植物生理学实验五叶绿素a 、b 含量 的测定（分光光度法）
植物生理学实验五叶绿素a 、b 含量的测定(分光光度法)
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切取叶面总和（dm2）×照光时数（h）
实验原理
改良半叶法是将植物对称叶片的一部分遮光或取 下置于暗处，另一部分则留在光下进行光合作用， 过一定时间后，在这两部分叶片的对应部位取同 等面积，分别烘干称重。因为对称叶片的两对应 部位的等面积的干重，开始时被视为相等，照光 后叶片重量超过暗中的叶重，超过部分即为光合 作用产物的量，并通过一定的计算可得到光合作 用强度。
3. 剪取样品：按编号次序分别剪下对称叶片 的一半（主脉不剪下）。按编号顺序夹于 湿润的纱布中，贮于暗处，过六个小时左 右，在依次剪下另外半叶，按同样的编号 夹于湿润的纱布中（两次剪叶的速度应尽 量保持一致。）
实验步骤
4. 称重比较：将叶片对应部位重叠在一起，用 打孔器均匀打相同数目的孔（50），分别置 于光照及黑暗的两个称量皿中，80-90℃下 烘干至恒重，在分析天平上称重比较。
实验器材和试剂
植物材料: 生长的榕树叶
实验器材：分析天平、烘箱、剪刀（自 备）、称量瓶、打孔器、纱布、棉签。
实验试剂：三氯乙酸（5 %） 。
实验步骤
1. 选择测定样品：选择生长旺盛常绿向阳的 榕树叶片20片。用小纸牌编号。
2. 叶子基部处理：采用5%三氯乙酸涂在叶 柄，以阻断光合产物的输出。
韩山师范学院生物系
植物生理学实验
实验五 叶绿素a 、b 含量的测定 （分光光度法）
实验器材和试剂
植物材料: 自选
实验器材：分光光度计、台天平、剪刀、 研钵、漏斗、移液管、量筒、10 mL容 量瓶。
实验试剂：80% 丙酮、 碳酸钙、 石英 砂、 水、 丙酮。
实验方法和步骤
叶绿素a和b含量的测定
实验14叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）一、目的学会Chla、b含量的测定方法，了解叶片中Chla、b的含量。
二、材料用具及仪器药品菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）三、原理叶绿素a、b在波长方面的最大吸收峰位于665nm和649nm,同时在该波长时叶绿素a、b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert Beer定律，列出浓度C与光密度D之间的关系式：D665=83.31Ca+18.60C b ........................................................................... .(1)Du9=24.54Ca+44.24 C b .......................................................................... .(2)⑴（2）式中的D665、D649为叶绿素溶液在波长665nm和649nm时的光密度。
为叶绿素a、b的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a、b在、在波长665nm时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a、b在、在波长649nm时的比吸收系数。
解方程式⑴(2)，则得：C A=13.7 D 665—5.76 D 649 (3)C B=25.8 D 649——7.6 D 665 (4)G=C+C B=6.10 D 665+20.04 D 649 (5)此时，G为总叶绿素浓度，C A、C B为叶绿素a、b浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a、b及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤1. 称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml共研磨成匀浆，再加5ml乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml。
2. 取一光径为1cm的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm和649nm波长测出该色素液的光密度。
叶绿素a、b含量的测定(分光光度计法和SPAD叶绿素仪法)
实验四叶绿素a、b含量的测定（分光光度计法和SPAD叶绿素仪法）植物叶面积的测定（仪器法、画纸称重法）一、实验目的：1.掌握叶绿素的提取方法及叶绿素含量测定的两种方法；2.学会使用VIS-723G和723N（new)的分光光度计的比色杯较正和定波长的两个程序；仪器法、复印称重法测定植物叶面积3.学会SPAD叶绿素仪和AM-300手持式叶面积仪的使用4.了解CB-1102便携式光合蒸腾测定仪二、实验原理：略、三、实验步骤：1.叶绿素a、b含量的测定（分光光度计法）P373人一组，实验材料为大红花成熟叶和嫩叶a)叶绿体色素的提取（0.5g叶片剪碎，加少量石英砂和碳酸钙用95%乙醇研磨，提取定容至25mL）b)稀释至5倍后测A665nm和A649nmc)计算(请列出计算公式）•更正：• 1.请用95%乙醇取代丙酮提取叶绿素。
• 2. 仍用书本上所列的公式。
2.叶绿素a、b含量的测定（SPAD叶绿素仪法）3人一组，实验材料为灰莉叶片实验原理：1.SPAD-502 叶绿素仪通过测量叶片在两种波长光学浓度差方式650nm 和940nm来确定叶片当前叶绿素的相对数量。
2.测量值是通过对在二个不同波长区域，叶片传输光的数量进行计算，在这二个区域叶绿素对光吸收不相同的。
这二个区域是红光区(对光有较高的吸收且不受胡萝卜素影响)和红外线区(对光的吸收极低)。
SPAD—502叶绿素仪使用说明一）电池安装1、按照电池盒上面的箭头标定方向旋转，打开电池盒盖。
2、放入盒内两节AA号码电池，并确信是按照指示放入电池。
3、必须是碱性或是碳—锌电池。
不要混淆电池型号和新旧电池。
4、把电池盒盖按照上面箭头方向旋转，直到盖子和仪器比较适当为止，不能太紧。
5、当电源开关打到ON的位置时，如果电源符号出现在显示屏上，表示电池已经耗尽，应该更换电池了。
如果电源符号没有出现，检查一下电池是否正确地插入或是否有电。
二）调零无论什么时候关闭电源之后需要在打开时，都需要调零。
叶绿素a和b含量的测定(分光光度法)
实验14 叶绿素a 和b 含量的测定（分光光度法）一、目的学会Chla 、b 含量的测定方法，了解叶片中Chla 、b 的含量。
二、材料用具及仪器药品菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml ）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）三、原理叶绿素a 、b 在波长方面的最大吸收峰位于665nm 和649nm ，同时在该波长时叶绿素a 、b 的比吸收系数K 为已知，我们即可以根据Lambert Beer 定律，列出浓度C 与光密度D 之间的关系式：D 665=83.31Ca+18.60C b (1)D 649=24.54Ca+44.24 C b (2)(1)(2)式中的D 665、D 649为叶绿素溶液在波长665nm 和649nm 时的光密度。
为叶绿素a 、b 的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a 、b 在、在波长665nm 时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a 、b 在、在波长649nm 时的比吸收系数。
解方程式(1)(2)，则得 ：C A =13.7 D 665—5.76 D 649 (3)C B =25.8 D 649—7.6 D 665 (4)G=C A +C B =6.10 D 665+20.04 D 649 (5)此时，G 为总叶绿素浓度，C A 、C B 为叶绿素a 、b 浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a 、b 及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤1．称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml 共研磨成匀浆，再加5ml 乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml 。
2．取一光径为1cm 的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm 和649nm 波长测出该色素液的光密度。
计算结果：叶绿素a 含量（mg/g. FW ）=2.01100025⨯⨯A C 叶绿素b 含量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯B C 叶绿素总量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯G五、实验报告计算所测植物材料的叶绿素含量。
植物生理学实验报告叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定
实验报告课程名称：植物生理学及实验实验类型：探索、综合或验证实验项目名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定一、实验目的和要求掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法二、实验内容和原理以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。
原理如下：1.叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂.常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。
2.皂化反应。
叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。
3.取代反应。
在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。
H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+。
4.叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。
透射光下呈绿色，反射光下呈红色。
5.光谱分析。
叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。
三、主要仪器设备1.天平（万分之一）、可扫描分光光度计（UV-1240）、离心机2.研具、各种容（量）器、酒精灯等四、操作方法与实验步骤1.定性分析a)称取鲜叶3-5g，并逐步加入乙醇15ml，磨成匀浆取匀浆过滤，并倒入三角瓶中，同时观察荧光现象。
b)取三角瓶中约1ml溶液于小试管。
加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和HO 1ml分层后观察。
2c)取代反应：加醋酸约1ml，取1/2加醋酸铜粉加热。
观察颜色变化。
2. 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：a) 取皂化反应的上层黄色石油醚溶液→稀释（470nm OD 0.5-1） b) 取下层绿色溶液（留1/3），反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)→稀释（663nm OD 0.5-1）c) 两者在400-700nm 处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰3. 叶绿素定量分析：鲜叶0.1g ，加1.9mlH 2O ，磨成匀浆，取2份0.2ml 加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心5min,上清液在645，652，663测定OD ，计算Chla,Chlb 和Chl 总量的值。
实验六 重金属污染对植物叶绿素含量的
至25mL。
4．叶绿素的测定
在波长分别为663nm、645nm条件下测定提取液的吸光 度。如果浓度较高，经适当稀释后比色定量。叶绿素a 和b及总叶绿素的浓度(mg/L)分别为Ca、Cb、CT，可根 据下式求算： Ca=12.7A663-2.69A645
Cb=22.9A645-4.68A663
（2）80%丙酮水溶液
四、方法与步骤
实验流程如图所示：
1．实验材料准备
将大小比较均匀的水稻种子用蒸馏水浸 泡、吸胀后，移入铺有河沙的瓷盘中，置入 光照培养箱中培养。
培养条件
白天：25℃，湿度80%，光照66%，12h； 夜间：20℃，湿度60%，光照0%，12h。 培养时间：10个周期（两叶一心）。
污染对植物作用的剂量效应和毒害过程。
叶绿体的结构 模式图
二、实验原理
高等植物叶绿体中的叶绿素（chlorophyll ,chl）主 要有叶绿素a 和叶绿素b 两种。它们不溶于水， 而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿 等。 过量的重金属能够抑制叶绿素的合成，并能 够破坏细胞内的膜结构，从而对生物产生毒害
CT=8.02A663+20.21A645 式中：A663、A645—分别为提取液在波长663nm、645nm 下的吸光度。
叶绿素含量
Ca(含量)＝Ca×V/1000W;
Cb(含量)＝Cb×V/1000W;
CT(含量)＝CT×V/1000W
5．实验结果分析
每个处理的平行测定结果用平均数±标 准误表示（每个处理做3个平行重复），并 用F检验分析不同处理间的差异性。利用 Excel作图，展示实验结果。
实验五、 重金属污染对 植物叶绿素含量的影响
上课用--叶绿素测定
思考题
TTC法和红墨水测定种子生活力有 何不同？实验结果与实际情况是否相 符 ? 为什么 ?
实验八 生长素类物质对小麦根、 芽生长的不同影响
红墨水染色法
【实验原理】 有生活力的种子其胚细胞的原生质膜具 有半透性，具有选择吸收外界物质的能力， 某些染料如红墨水中的酸性大红G不能进 入细胞内，胚部不染色。而丧失活力的种 子其胚部细胞原生质膜丧失了选择吸收的 能力，染料进入细胞内使胚部染色，所以 可根据种子胚部是否染色来判断种子的生 活力。
3、测定数据记录 光合速率、呼吸速率测定数据记录
植物 名称 V：气体流速 (L/min) 叶面积 (cm2) Ci ：CO2参/初值 (μL/L) C0：CO2测/终值 (μL/L) 叶室温度 （t℃） 备注（是 否遮光）
6.5
平均值
五、结果计算
光合速率、呼吸速率计算（当光照为0时，R=-Pn ）
注：Ta = 273.15 +t℃ 60是将气流量V的L/min化分为秒 P：大气压力（bax），一般认为1标压 22.41L/mol，是将温度Ta，压强P下的气体体积划为mol 10000是将叶面积A的cm2划为m2
注意事项： 1、仪器使用前，对CO2分析器的调零和调满已校正好， 测定时，无需再校准。 2、仪器使用时，对调零、调满旋钮不要乱旋动，以免影 响测定的准确性。 3、叶室与叶室的手柄连接杆比较细小，使用时要轻拿轻 放，小心使用。
实验五
不同生长环境下植物 叶绿素a、b含量的测定
一、实验目的、原理
[实验目的] 在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶 绿素a和b的方法及其计算。 [实验原理] 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然 有明显的差异，但吸收曲线彼此有重叠，在这种情 况下要分别测定两个组分，可根据朗伯-比尔 （Lambert-Beer）定律，通过代数方法，计算一种 组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后 分别得到两种组分的含量。 根据叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸 收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm, 吸收 曲线彼此又有重叠。
叶绿素的测定
实验六富营养化湖中藻量的测定（叶绿素a法）一、实验目的富营养化湖由于水体受到污染，尤以氮磷为甚，致使其中的藻类旺盛生长。
此类水体中代表藻类的叶绿素a浓度常大于10微克/升。
本实验通过测定不同水体中藻类叶绿素a浓度，以考查其富营养化情况。
二、器材与用品1、分光光度计（波长选择大于750nm，精度为0.5－2nm）。
2、比色杯（1cm；4cm）。
3、台式离心机（3500r/min）4、离心管（15ml具刻度和塞子）；冰箱5、匀浆器或小研钵。
6、蔡氏滤器；滤膜（0.45微克，直径47mm）。
7、真空泵（最大压力不超过300kpa）。
8、MgCO3悬液：lg MgCO3细粉悬于100ml蒸馏水中。
9、90％的丙酮溶液：90份丙酮＋10份蒸馏水。
10、水样：两种不同污染程度的湖水水样各2L.三、方法和步骤1、按浮游植物采样方法，湖泊、水库采样500ml，池塘300ml。
采样点及采水时间同“浮游植物”。
2、清洗玻璃仪器：整个实验中所使用的玻璃仪器应全部用洗涤剂清洗干净，尤其应避免酸性条件下而引起的叶绿素a分解。
3、过滤水样；在蔡氏滤器上装好滤膜，每种测定水样取50－500ml 减压过滤。
待水样剩余若干毫升之前加入0.2ml MgCO3悬液、摇匀直至抽干水样。
加入MgCO3可增进藻细胞滞留在滤膜上，同时还可防止提取过程中叶绿素a被分解。
如过滤后的载藻滤膜不能马上进行提取处理，应将其置于干燥器内，放冷（4℃）暗处保存，放置时间最多不能超过48小时。
4、提取；将滤膜放于匀浆器或小研钵内，加2－3ml90％的丙酮溶液，匀浆，以破碎藻细胞。
然后用移液管将匀浆液移入刻度离心管中，用5ml90％丙酮冲洗2次，最后向离心管中补加90％丙酮，使管内总体积为10ml。
塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物，充分振荡，放冰箱避光提取18－24小时。
5、离心：提取完毕后，置离心管于台式离心机上3500r/min，离心10min，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞上塞子，3500r/min在离心10min。
叶绿素
类胡萝卜
蓝紫光区
红光区
最大吸收区域在 400-500nm） 蓝紫光区（400-500nm）， 基本上不吸收黄、 基本上不吸收黄、橙、 红光。 这四种色素在可见光谱中具有 不同的特征吸收峰
叶绿素与类胡萝卜素具有一定的吸收光谱，因此,在不分离的 叶绿素与类胡萝卜素具有一定的吸收光谱，因此 在不分离的 情况下,可用分光光度计法来进行测定。 情况下 可用分光光度计法来进行测定。今欲测定叶绿体色素 可用分光光度计法来进行测定 和类胡萝卜素的含量， 混合提取液中叶绿素 a 、 b 和类胡萝卜素的含量，只需测定 该提取液在三个特定波长下的吸光度 A 即可求得，叶绿素 a、 即可求得， 、 b乙醇溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于红光区和蓝 乙醇溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于红光区和蓝 紫光区， 为了排除类胡萝卜素的干扰， 紫光区 ， 为了排除类胡萝卜素的干扰 ， 所用单色光的波长选 择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 此外我们发现叶绿体色素提取液中各色素的吸收光谱虽有不 此外我们发现 叶绿体色素提取液中各色素的吸收光谱虽有不 同，但又存在着明显的重叠 吸光度的加和性告诉我们如果溶液中有数种吸光物质， 则此 吸光度的加和性告诉我们如果溶液中有数种吸光物质 ， 混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸 光度的总和， 光度的总和，A ＝ K1C1 +K2C2
实验目的
掌握分光光度计法测定植物叶绿体色素含 量的原理与方法. 量的原理与方法. 进行完全营养液与缺素营养液玉米苗间叶 绿体色素含量的比较并分析其差异的原因. 绿体色素含量的比较并分析其差异的原因.
高 等 植 物 叶 绿 体 色 素 叶绿素
实验原理
叶绿素a---C55H72O5N4Mg 叶绿素a---C 叶绿素b---C55H70O6N4Mg 叶绿素b---C 胡萝卜素---C 胡萝卜素---C40H56 --叶黄素---C 叶黄素---C40H56O ---
植物生理学实验指导
植物生理学实验教案唐为萍韩山师范学院生物系实验一、植物组织（半透膜）渗透现象的观察一、原理：利用半透膜的选择透性，观察不同浓度溶液间的渗透现象。
二、仪器、药品：铁架台、烧杯、长玻璃管、滴管、橡皮筋、1M蔗糖溶液（2000ml）、15%的HCL溶液。
三、材料：浸泡好的蚕豆或直接买鲜鸡蛋等半透膜及自备材料。
四、方法、步骤：1.取浸泡好的蚕豆种子，小心去出子叶；2.将空皮囊用橡皮筋系紧于玻璃管的一端；3.检查不漏气后，用滴管注入1M蔗糖溶液若干于玻璃管中；4.放入盛有清水的烧杯中，使二者液面平齐；5.过一段时间观察有什么变化？五、结果分析：结果：原因：现象如图：（注：34.23g蔗糖用蒸馏水配成100ml，即为浓度1ml/L）附：植物组织含水量的测定一、原理：植物组织中水遇热可以蒸发成水蒸气，用加热烘干法测定植物组织中的含水量。
二、仪器分析天平、鼓风干燥箱、称量瓶（铝盒）、剪刀（自带）。
三、材料：各种植物的树叶。
（学生自己采集）四、方法步骤：1、在天平上称得铝盒的重量（W1）(精确到小数点后四位)。
2、将待测材料——树叶剪碎放入铝盒中盖好，准确称重（W2）。
3、置于烘箱内烘干，烘干后冷却至室温称重（W3）。
(注：新鲜组织先在105℃烘4~6小时杀死细胞组织后，再烘2小时至恒温。
)五、结果分析：树叶的含水量：占鲜重%= W2－W3×100%W2 －W1占干重%= W2－W3 ×100%W3－W1应注意的几个问题：①烘后一定要冷至室温称重。
②将材料置于烘干箱内烘干时，称量瓶（连盖）一起放入，注意在烘箱中打开盖子，再烘干。
③将烘干的材料从烘箱内取出时，一定先盖上盖子，再拿出来。
④烘干时温度、时间调整为105℃，2个小时。
（注：分几组测不同的树叶）实验二、植物组织水势的测定（小液流法）一、原理：当植物细胞或组织放入溶液中时，如果植物的水势小于溶液的水势，则组织吸水而使溶液浓度变大，反之，如果植物的水势大于溶液的水势，则植物失水，溶液浓度变小，若两者水势相等，则二者保持水分交换的动态平衡，溶液浓度不变。
叶绿体色素的提取及理化性质的定
色素名称
叶绿素
类胡萝卜素
项目 颜色
叶绿素a 叶绿素b β−胡萝卜素 叶黄素
蓝绿色 黄绿色 橙黄色
黄色
在叶绿体内各色素含量比例
3
1
3
2
1
1Hale Waihona Puke 3叶绿素(Chlorophylls)是叶绿酸的酯，它在植 物进行光合作用中吸收可见光，并将光能转 变为化学能。叶绿素是植物进行光合作用所 必需的催化剂。
在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a （C55H72O5N4Mg）和叶绿素b（C55H70O6N4Mg） 两种结构相似的形式存在，其差别仅是叶绿 素a中一个甲基被叶绿素b中的醛基所取代。
(3) 盖上皿盖, 静置观察。15min左右色素可充分扩展, 分离结 束，在滤纸上可得到各种色素的同心圆环。
19
六、叶绿素理化性质的观察
(1) 光对叶绿素的破坏作用
在 2支具塞试管中各放入2ml上述色素提取液，盖好塞子。 一支试管置暗处，一支试管置强光（如太阳光）下，经
2~3h后，取出2支试管观察溶液颜色有无变化，或在分光光 度计上测定663nm处吸光度值后进行比较。
八、 讨论
研磨叶片提取叶绿体色素时，加入少量碳 酸钠有何作用？加多了会出现什么问题？
叶绿素溶液为什么会发荧光？ 黄色素和绿色素分离的原理？
23
实验结果部分
1、纸色谱分离色素：要求用铅笔绘制出色素经 纸色谱分离后的图形，并用注明各色素环的颜 色和名称。
2、叶绿素理化性质鉴定：要求写出各个项目的 实验现象和并分析其中的原因。见下表
21
七、注意事项
1、叶绿体色素对光、温度、氧气环境、酸碱及 其它氧化剂都非常敏感。色素的提取和分析一 般都要在避光、低温及无酸碱等干扰的情况下 进行。
叶绿素提取分离实验报告
一、实验目的1. 学习叶绿素提取与分离的方法。
2. 了解叶绿素的理化性质。
3. 掌握薄层色谱法在叶绿素分离中的应用。
二、实验原理叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，存在于叶绿体的类囊体膜上。
叶绿素具有吸收红光和紫光，反射绿光的特性，因此植物呈现绿色。
叶绿素主要分为叶绿素a和叶绿素b两大类，此外还有叶黄素和胡萝卜素等类胡萝卜素。
叶绿素的提取通常采用有机溶剂，如乙醇、丙酮等，将叶绿素从植物组织中溶解出来。
分离叶绿素通常采用薄层色谱法，根据叶绿素在不同溶剂中的分配系数不同，通过层析将叶绿素与其他色素分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜菠菜叶片、石英砂、碳酸钙粉、95%乙醇、层析缸、滤纸、毛细管等。
2. 实验仪器：研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、电热恒温水浴锅、离心机、紫外灯等。
四、实验步骤1. 准备工作：将新鲜菠菜叶片洗净、擦干，去掉中脉剪碎。
2. 叶绿素提取：将剪碎的菠菜叶片放入研钵中，加入少量石英砂和碳酸钙粉，加入2-3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加入10-15ml 95%乙醇，离心35min，提取上清液过滤于三角瓶中。
3. 叶绿素分离：取圆形定性滤纸一张，将其剪成滤纸条（9cm×3cm），用滴管吸取乙醇叶绿素提取液，沿纸条的长度方向涂在纸条的一边（距边约1cm），使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，风干后，重复操作数次。
4. 层析：在层析缸中加入适量的推动剂，将滤纸条带有色素的一端插入层析缸中，使滤纸条下端浸入推动剂中。
迅速盖好层析缸盖，等待推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可观察到分离的各种色素条带。
五、实验结果与分析1. 色素条带观察：在紫外灯下观察，滤纸条上呈现出蓝绿色、黄绿色、黄色和橙黄色的条带。
2. 色素鉴定：根据色素条带的颜色和位置，鉴定出叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素。
3. 叶绿素含量测定：通过比较各色素条带的长度，计算叶绿素a和叶绿素b的含量。
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三、实验原理
• 叶绿素a、b的吸收光谱
• 叶绿素a、b的光吸收总和在645nm和663nm处各有一 峰值。
• A=nCL n=摩尔消光系数； C=溶液浓度； L=比色杯内径。
三、实验步骤
• 取培材养7：d适后量，菹从草顶，端在起含取有倒不数同第浓三度对C叶d片Cl2；的1/10Hogland营养液中 • 提取：叶片洗净、吸干、称重后于研钵中加入5mL80%丙酮、少
许石英砂和碳酸钙，研磨匀浆后过滤，再用5mL80%丙酮冲洗滤 渣，定容到10mL，混匀； • 测定：充分过滤后，以80%丙酮调零，测定叶绿素提取液在645 nm和663nm处的光吸收值。 • 计算： 叶绿素a：C=12.21A663-2.81A645
叶绿素a（mg/gFW)=? 叶绿素b：C=20.13A645-5.03A663
实验六 叶绿素a、b 含量的测定
精品实验《水生植物抗逆生理的研究》——1
一，实验目的与要求
• 掌握叶绿素a、b含量测定的方法； • 了解逆境条件（重金属Cd污染）下植物体叶绿素含
量的变化。
二、实验材料与试剂
• 材料 不同浓度Cd2+处理7d的菹草。
• 试剂 1/10Hogland营养液； CdCl2溶液：0、5、10、20mg/L（以Cd的浓度计）； 80%丙酮。
叶绿素b（mg/gFW)=?
叶绿计CdCl2处理浓度与叶绿素含量之间的关系； • 结合其他生理指标分析Cd2+对植物体生长的影响。