(完整word版)叶绿素含量的测定
测定叶绿素含量实验报告
测定叶绿素含量实验报告测定叶绿素含量实验报告引言：叶绿素是植物中最重要的色素之一，它在光合作用中起着至关重要的作用。
测定叶绿素含量可以帮助我们了解植物的生理状态和光合效率。
本实验旨在通过分光光度法测定叶绿素含量，并探讨影响叶绿素含量的因素。
材料与方法：1. 实验材料：新鲜的植物叶片、乙醇、丙酮、二氯甲烷、石英比色皿、量筒、离心机、紫外可见分光光度计等。
2. 实验步骤：a. 将适量的新鲜叶片切碎，并加入适量的乙醇中，用离心机离心10分钟，使叶绿素溶解于乙醇中。
b. 取适量的叶绿素提取液，加入丙酮和二氯甲烷，混合均匀。
c. 用量筒将混合液转移到石英比色皿中，放入紫外可见分光光度计，设置波长为665nm和649nm，测定吸光度。
d. 计算叶绿素含量。
结果与讨论：通过实验测定，我们可以得到不同植物叶片的叶绿素含量。
在实验中，我们发现不同植物叶片的叶绿素含量有所差异。
这是因为不同植物对光合作用的需求和适应能力不同，导致叶绿素合成的数量和比例不同。
此外，我们还发现在同一植物的不同部位，叶绿素含量也存在差异。
例如，在一棵树上，树叶的叶绿素含量可能比树干或树枝的含量高。
这是因为树叶是进行光合作用的主要部位，需要更多的叶绿素来吸收光能。
除了植物本身的因素外，环境条件也会对叶绿素含量产生影响。
光照强度、温度、水分等因素都会对叶绿素合成和降解产生影响。
例如，充足的光照和适宜的温度可以促进叶绿素的合成，而干旱和寒冷的环境则可能导致叶绿素的降解。
在实验中，我们使用了分光光度法来测定叶绿素含量。
这种方法基于叶绿素对特定波长光的吸收特性，通过测量吸光度来间接测定叶绿素的含量。
分光光度法具有操作简便、结果准确等优点，因此被广泛应用于叶绿素含量的测定。
然而，分光光度法也存在一些局限性。
首先，该方法只能测定总叶绿素含量，无法区分不同类型的叶绿素。
其次，该方法对样品的处理要求较高，需要保证样品中的叶绿素完全释放并溶解于提取液中。
因此，在实际应用中，我们需要根据具体情况选择适合的方法来测定叶绿素含量。
叶绿素含量的测定分光光度法
叶绿素含量的测定分光光度法叶绿素是植物和一些原生生物中重要的光合色素之一，它在光合作用中起到接收和转换光能的关键作用。
测定叶绿素含量可以帮助我们了解植物的光合效率和健康状况，以及研究光合作用的机制和调控。
分光光度法是一种常用的测定叶绿素含量的方法，本文将介绍该方法的原理、实验步骤和数据分析。
一、原理分光光度法测定叶绿素含量的原理是基于叶绿素对光的吸收特性。
叶绿素分子可以吸收特定波长的光，特别是蓝光和红光，而对绿光的吸收较弱。
利用分光光度计测量叶绿素溶液在不同波长的光下的吸光度，可以通过比较吸光度与叶绿素浓度的标准曲线，计算出待测样品中叶绿素的含量。
二、实验步骤1. 制备叶绿素提取液：将适量的鲜叶片（去除茎和大的叶脉）放入离心管中，加入少量酒精，并用研钵捣碎，使叶绿素释放到酒精中。
然后用酒精将研钵中的残渣洗入离心管中，最后用酒精将叶绿素完全溶解。
注意，酒精的使用要避免火源。
2. 离心沉淀：将叶绿素提取液离心10分钟，以沉淀残渣和悬浮物。
3. 分光光度计测量：取离心后的叶绿素提取液，用分光光度计在特定波长下（如645 nm和663 nm）测量其吸光度。
记录吸光度值。
4. 制备标准曲线：取不同浓度的叶绿素标准溶液，用同样的方法测量其吸光度，记录吸光度值。
5. 计算叶绿素含量：根据标准曲线，将待测样品的吸光度值代入，通过计算叶绿素浓度的公式，得出叶绿素的含量。
三、数据分析1. 标准曲线的绘制：将各个标准溶液的叶绿素浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标，绘制曲线。
利用标准曲线可以通过待测样品的吸光度值，反推出其叶绿素的浓度。
2. 计算待测样品中叶绿素的含量：根据标准曲线，将待测样品的吸光度值代入，通过计算叶绿素浓度的公式，得出叶绿素的含量。
四、注意事项1. 实验中应尽量避免阳光直射，以免光线对实验结果的干扰。
2. 操作时应注意安全，避免酒精接触到火源。
3. 叶绿素提取液的制备应充分溶解，避免残渣和悬浮物的影响。
叶绿素含量测定
实验五食品中叶绿素含量的测定一、试验原理叶绿素含量的多少对植物源食品的色泽有重要的影响，例如绿茶的外形色泽就与叶绿素含量有密切的关系。
叶绿素在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体，当细胞死亡后，叶绿体即被解离，随之叶绿素游离出来。
游离的叶绿素很不稳定，对光、热都较敏感，在酸性条件下很快生成褐色的脱镁叶绿素，加热可使该反应加速。
但在弱碱性条件下叶绿素会被水解为叶绿酸盐、叶绿醇及甲醇。
叶绿酸盐呈鲜绿色，这是一些果蔬产品加工时常用弱碱处理的原因。
高等植物体内叶绿素有a, b两种，二者都易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。
叶绿素a, b分别对663nm 和645nm波长的光有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm处。
因此，将食品中叶绿素经适当提取，然后在645nm、663nm和652nm处测其光吸收值，从而求得叶绿素含量。
二、试剂与器材黄瓜丙酮，石英沙容量瓶：100ml烧杯：50ml量筒：10ml滴管，玻璃棒，玻璃漏斗，研钵可见分光光度计三、实验步骤1均匀称取黄瓜样品5g于研钵中，加入少许石英砂（约0.5～1g）和冷丙酮充分研磨后倒入100ml容量瓶中，然后用丙酮分次洗涤研钵并倒入容量瓶中，最后用丙酮定容至100ml。
2充分振摇后用滤纸过滤。
取滤液分别在645nm、652nm和663nm处测其光吸收值。
以95%的丙酮作空白。
3按下式分别计算叶绿素a 和叶绿素b 的含量以及叶绿素总量：结果计算()m V D D 100059.271.12645663⨯⨯⨯-⨯()mV D D 100067.488.22663645⨯⨯⨯-⨯()mV D D 100004.829.20663645⨯⨯⨯+⨯叶绿素a 含量(mg/g 鲜重) =叶绿素b 含量(mg/g 鲜重) =叶绿素总量(mg/g 鲜重) =如果只测定叶绿素总量，则测定652nm 处光吸收值，按下式计算即可：5.341000652⨯⨯⨯m V D 式中：D 645，652，663—表示在所指定波长下，叶绿素提取液的光密度值；V —叶绿素丙酮提取液的最终体积，ml ；m —所用果蔬鲜重，g 。
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定是指测定植物体内叶绿素的含量，主要有荧光法、比色法和HPLC法。
1. 荧光法：是利用叶绿素对荧光的强烈敏感性，用来测定叶绿素的一种方法，是生物体叶绿素含量测定最常用的一种方法。
其原理是根据叶绿素在紫外光照射下产生的荧光强度，可以分析出叶绿素的含量。
2. 比色法：是利用叶绿素和其他物质的吸收光谱差异，从而计算叶绿素含量的一种方法。
其原理是，在不同浓度的叶绿素溶液中添加相应量的比色剂，当叶绿素的浓度达到一定时，会产生色谱变化，根据色谱变化的大小，可以计算出叶绿素的浓度。
3. HPLC法：也称为高效液相色谱法，是一种新型的分析技术，用于测定叶绿素的含量。
其原理是将叶绿素以溶剂溶解后，通过高效液相色谱仪将叶绿素从溶剂中分离并测定叶绿素的含量。
叶绿素的测定
叶绿素含量的测定（参考李合生）一、实验原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
二、材料、仪器设备及试剂25ml容量瓶14个，分别标号0~6和0Y~6Y（标有Y的装子叶,带0的表示实验组）；80%的丙酮；剪刀；手术刀；注射器；长方形硬纸盒三、试验方法与步骤1、叶绿素的提取取一个实验组，从每个培养皿中取出等量个数的材料，用手术刀将根茎叶分开，再单独取叶或茎剪碎，称取叶0.1g左右，茎段0.2g左右；记录各组的质量，然后分别放入对应的容量瓶中，等到所有实验组的叶和茎都装入容量瓶后，再用注射器吸取适量80%的丙酮，加入容量瓶中，并定容至刻度线，摇匀后立即放入预先准备的纸盒中（内用报纸垫着），依次逐个加入。
等所有的都加完后，把纸盒放在暗处，提取24小时以上，备用。
2、分光光度计测定其OD值打开分光光度计，设置470、663、646nm三个波段，测量次数设为3，间隔10s。
预热30min。
预热结束后，用80%的丙酮较零，取出遮光下的溶液，从容量瓶中直接倒到比色杯中开始测量，每组试剂测3次。
注：之前先测两个实验组，若值偏大，可适当用80%的丙酮稀释，并记录好稀释倍数四、结果计算叶绿素a Ca=12.21*A663-2.81*A646叶绿素b Cb=20.13*A646-5.03*A663类胡萝卜素Cx=（1000*A470-3.27*Ca-104*Cb）/229叶绿素色素含量=色素浓度*提取液体积*稀释倍数/样品鲜重（mg/g）注：A663、A646、A470分别指在663、646、470nm波长下的吸光度。
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叶绿素含量的测定(精)
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6、结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子： Ca=12.7A663－2.69A645； Cb=22.9A645－4.69A663； 据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb： mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进 一步求出植物组织中叶绿素的含量： 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体 积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。
3、取滤纸1张，置漏斗中，用80%丙酮湿润，沿玻棒把提取 液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量80% 丙酮冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入 漏斗中。 4、用滴管吸取80%丙酮，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入 容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用80%丙 酮定容至25ml，摇匀。 5、把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以80% 丙酮为空白，在波长663nm、645nm下测定吸光度。
能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿素a和叶绿素b的
定量分析，为什么？
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今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、 b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个 特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类 胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。 在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰， 所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸 收峰。 2、了解叶绿素a和b及总量的最大吸收峰，学会分 光光度计的使用方法及其原理。
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四、操作步骤
1、取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组 织表面污物，剪碎(去掉中脉)，混匀。 2、称取剪碎的新鲜样品0.2g，放入研钵中，加少量石英砂 和碳酸钙粉及5ml 80%丙酮，研成均浆，再加80%丙酮 10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。
植物叶绿素含量的测定
植物叶绿素含量的测定
植物叶绿素含量的测定
一、实验目的
1. 了解叶绿素的含量对植物生长发育的影响。
2. 使用叶绿素测定仪器，熟练掌握叶绿素测定的操作方法。
二、实验原理
叶绿素的含量是植物生长发育的重要参数，它主要受到植物品种、生长环境等因素的影响，叶绿素的测定能了解植物发育及分析植物选择性。
叶绿素测定仪器以叶绿素的吸收波长在670nm处，测定叶绿素的吸收值，从而计算出叶绿素的含量。
三、实验材料
1. 叶绿素测定仪器；
2. 分装标准液；
3. 各种植物叶片；
4. 纸巾；
5. 光学玻璃管（空管，分装标准液管）；
6. 吸管；
7. 水桶；
8. 烧杯；
9. 烧瓶；
四、实验步骤
1. 将叶片裁切为小块，放入烧杯中；
2. 把六个光学玻璃管清洗干净；
3. 用纸巾擦干玻璃管，将空管和标准液管装入叶绿素测定仪中；
4. 在烧杯中加入适量水，把叶片浸泡；
5. 将烧杯中的叶片倒入叶绿素测定仪中，盖上盖子；
6. 按照设备的操作指南，进行实验操作；
7. 记录实验数据；
8. 计算叶绿素含量；
9. 将实验数据做出结果表格。
五、实验结果
植物叶绿素含量（μg/g）
植物 | 叶绿素含量
---- | ----
植物1 | 10.2
植物2 | 15.3
植物3 | 8.1
植物4 | 12.6
植物5 | 13.2
植物6 | 11.4
六、结论
通过实验，可以得出不同植物叶绿素含量的不同，从而了解叶绿素含量对植物生长发育的影响。
叶绿素含量测定方法
叶绿素含量测定方法叶绿素是植物体内含量较高的绿色色素，它在光合作用中起着重要的作用。
因此，测定叶绿素含量对于研究植物的生理过程和生态体系具有重要意义。
本文将介绍几种常用的测定叶绿素含量的方法。
1. 直接萃取法：直接萃取法是最常用的测定叶绿素含量的方法之一。
具体步骤如下：(1) 取新鲜叶片，将其切碎并放入含有乙醇或丙酮的试管中。
(2) 在测定之前，将试管置于黑暗中，以避免光照对叶绿素的破坏。
(3) 将试管加热至60-80摄氏度，使用超声波震荡器震荡一段时间，以使叶绿素从叶片中完全溶解到溶液中。
(4) 将溶液离心，收集上层液体，并使用分光光度计测定其吸光度。
(5) 根据吸光度测定值和标准曲线来计算叶绿素的含量。
2. 酸碱法：酸碱法是测定叶绿素含量的一种简便方法。
具体步骤如下：(1) 取新鲜叶片，用醋酸乙酯将其完全浸泡。
(2) 在测定之前，将其放在黑暗中保护叶绿素不受光照。
(3) 将浸泡叶片的醋酸乙酯溶液转移到一个离心管中，再添加一些酸性乙醇（如95%乙酸）。
(4) 离心一段时间，使叶绿素溶于酸性乙醇中。
(5) 将上清液转移到一个试管中，并用乙醚稀释，使其适合测定。
(6) 使用分光光度计测定溶液的吸光度，并根据标准曲线计算叶绿素的含量。
3. 间接法（叶绿素含量的计算）：间接法是一种根据叶片在不同波长下吸光度的差异来推测叶绿素含量的方法。
具体步骤如下：(1) 使用分光光度计测定叶片在不同波长下的吸光度，包括440 nm、645 nm和663 nm。
(2) 根据以下公式计算：非光合色素 Chl (a+b) = 0.0073 A663 + 0.036 A645叶绿素 a = 0.0127 A663 - 0.00269 A645叶绿素 b = 0.0205 A645 - 0.00488 A663叶绿素 a/b = (0.0127 A663 - 0.00269 A645) / (0.0205 A645 - 0.00488 A663)(3) 使用所得结果进行各种关于叶绿素含量的统计分析。
(完整word版)叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数.当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时,α为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰.已知叶绿素a、叶绿素b的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm处。
已知在波长663nm下叶绿素a、叶绿素b在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27;在波长645nm处的吸光系数分别为16.75和45。
60。
根据加和性原则列出以下关系式：A663=82。
04Ca+9.27Cb （1）A645=16。
76Ca+45.60Cb （2）式（1) (2)A663nm和A645nm为叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，C a C b分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度，以mg/L为单位。
解方程(1) （2）组得C a=12。
72 A663—2。
59 A645(3)C b=22。
88 A645-4.67 A663 （4)将C a +C b 相加即得叶绿素总量C TC T ＝ C a 十C b ＝20。
29A 645-8。
05 A 663 (5)从公式(3）、（4）、（5）可以看出，,就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度另外,由于叶绿素a 叶绿素b 在652nm 的吸收峰相交,两者有相同的吸光系数(均为30。
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定叶绿素含量的测定一、实验目的1. 了解分光光度计的工作原理；2. 掌握不同型号分光光度计的操作方计；3. 通过本实验的学习掌握叶绿素含量测定的一种常见的方法------分光光度法。
二、实验原理叶绿素是脂溶性色素，主要存在于以叶绿体为首的色素体中。
在活体中，叶绿素与脂蛋白结合并受到还原系统的保护，对氧和光是稳定的。
叶绿素的80%丙酮提取液在波长663nm，645nm有吸收峰，叶绿素a和叶绿素b 的浓度符合以下公式：Ca=0.0127A663-0.00259A645Cb=0.0229A645-0.00467A663 浓度单位是：g/LCa=12.7A663-2.59A645Cb=22.9A645-4.67A663 浓度单位是：mg/L叶绿素总浓度为： CT=Ca+Cb 若以试液中色素含量来表示，则C(mg/L)?提取液总体积(ml)叶绿素含量（mg/g鲜样）?样品重(g)?1000三、仪器、试剂和材料 1. 仪器紫外-可见分光光度计、研体、25ml容量瓶、玻璃漏斗、玻璃棒、皮头滴管 2. 试剂丙酮（分析纯）、85%丙酮、80%丙酮 2. 材料滤纸、石英砂、碳酸镁四、操作步骤1. 在遮光条件下取出等测样品，剪碎，混匀，称取鲜样0.1-0.5g；2. 样品置于研钵内，加入少量碳酸镁和石英砂，加入一定体积的丙酮研磨匀浆，再加85%丙酮适量继续研磨至组织白色；3. 经铺有滤纸的漏斗将匀浆液转入25ml的容量瓶中，并用80%的丙酮分次清洗研钵和滤纸，最后用80%的丙酮定容。
4. 以80%的丙酮为参比液，在663和645nm波长处测定吸光值（A应在0.2-0.8范围内，浓度过大应用80%丙酮适当稀释）。
五、结果处理按照公式计算出叶绿素a和叶绿素b的浓度，再计算出叶绿素的含量。
六、注意事项1. 在活体内，结合态叶绿素是稳定的，组织一经破坏，叶绿素易被光解。
因此，抽提和测定工作应尽可能避光快速完成。
测定植物叶绿素含量的方法
测定植物叶绿素含量的方法
植物叶绿素是一种广泛存在于植物、藻类和一些细菌中的绿色色素，能够在吸收光子的过程中将光能转化为化学能。
因此，测定植物叶绿素含量是衡量植物光合作用效率的重要指标之一。
1. 乙醇提取法
将待测叶片粉碎后加入适量的95%乙醇中，放置于暗处浸泡数小时或过夜，然后离心收集上清液。
测定上清液吸光度，通过比较不同波长下的吸光度值，可计算出叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量。
将待测叶片粉碎后加入1.5mL 80%乙醇和0.5mL 1mol/L HCl的混合液中，振荡10分钟后加入玻璃珠摇匀，含有叶绿素的乙醇溶液将变为红褐色。
用0.22µm微孔滤纸过滤，取上清液，用分光光度计测定吸光度值后计算叶绿素含量。
3. 醋酸铜法
将待测叶片加入0.05%醋酸铜溶液中，用滚轴摇匀10分钟后过滤，取上清液后测定吸光度并计算叶绿素含量。
4. 液相色谱法
将待测叶片加入甲醇或乙腈中，使用高效液相色谱仪分析样品中的叶绿素和类胡萝卜素含量。
这种方法需要更为精确的仪器和技术，但可以同时测定多种色素。
无论使用哪种方法测定植物叶绿素含量，都需要注意以下几点：
1. 样品采集应在相同的时间、地点和光照条件下进行，以保证结果可比性。
2. 需要控制乙醇、醋酸铜等试剂用量、摇匀时间和过滤条件等因素，以获得准确的结果。
3. 对于不同种类和部位的植物，可能需要针对性地选择不同的测定方法，并对结果进行修正和比较。
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A = a CL式中：a比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，a为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、叶绿素b的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm处。
已知在波长663nm下叶绿素a、叶绿素b在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27 ;在波长645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。
根据加和性原则列出以下关系式：A663=82.04Ca+9.27Cb (1)A645=16.76Ca+45.60Cb (2)式(1) ( 2) A663nm和A645nm为叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，C a C b分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度，以mg/L为单位。
解方程(1) (2)组得C a=12.72 A 663 2.59 A 645 (3)C b=22.88 A645—4.67 A663 (4)将C a+C b相加即得叶绿素总量C TC T = C a十C b= 20.29A 645+8.05 A663 (5)从公式(3)、(4)、(5)可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素绿素a叶绿素b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数波长下测定一次吸光度(A652)而求出叶绿素a、叶绿素b总量所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算:A652 勺000C T =34.5有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。
叶片叶绿素含量的测定
叶片叶绿素含量的测定1、原理莃叶绿素a、b在长波的最大吸收峰分别在663nm、645nm，据Lamber-Beer定律，可得浓度C与光密度D间的关系式：莄D663=82、04Ca+9、27Cb虿D645=16、75Ca+45、6Cb(浓度单位：g/mL）膆叶绿素a的浓度：Ca=12、72D663–2、59D645莆叶绿素b的浓度：Cb=22、88D645–4、68D663蒄总叶绿素的浓度：Ct=20、29D645+8、02D663(浓度单位：mg/L）肀2、试剂与材料袈2、1试剂：膅丙酮、石英砂、碳酸钙薃2、2材料：蒁新鲜叶片。
芆2、3仪器与器皿：袄分光光度计、天平、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管蚃3、实验步骤薈称1、25g叶用丙酮研磨羈↓蚃匀浆过滤（用80%丙酮洗研钵及残渣，合并滤液）蚃↓聿滤液用80%丙酮定容至25mL蒆↓蚆适当稀释后测A645、A663螃3、1取样：称取1、25g剪碎的叶片（提供的样品即为剪碎后冻于-80℃的叶片）放入研钵中。
注意取样时要避开大的叶脉。
蒀3、2研磨提取：向研钵中加入80%丙酮2、5ml，以及少许（约0、002g）CaCO3(中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素)和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止3~5min后，用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用80%丙酮定容至刻度。
膇3、3读取吸光度：取厚度为lcm 的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。
将比色皿放入仪器的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。
实验二十叶绿素含量的测定
实验二十叶绿素含量的测定叶绿素的含量与植物光合作用及氮素营养有密切的关系，在科学施肥、育种及植物病理研究上常有测定的需要。
方法Ⅰ一、目的掌握叶绿素含量测定的基本原理和方法。
二、原理叶绿素与其他显色物质一样，在溶液中如液层厚度不变则其吸光度与它的浓度成一定的比例关系。
已知叶绿素a 、b在652 nm波长处有相同的比吸收系数（均为34.5）。
因此，在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，即可计算出叶绿素a 、b的总量。
三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：菠菜叶；芥菜叶或其他植物叶片。
2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；漏斗；25ml容量瓶；剪刀；滤纸；玻棒等。
3. 试剂：95﹪乙醇、石英砂、碳酸钙粉。
四、实验步骤1. 叶绿素的提取称取植物鲜叶0.20g（可视叶片叶绿素含量增减用量），剪碎放入研钵中，加少量碳酸钙粉和石英砂及3～5ml95﹪乙醇研成匀浆，再加约10ml 95﹪乙醇稀释研磨后，用滤纸过滤入25ml 容量瓶中，然后用95﹪乙醇滴洗研磨及滤纸至无绿色为止，最后定容至刻度，摇匀，即得叶绿素提取液。
2. 测定取光径为1cm的比色杯，倒入叶绿素提取液距杯口1cm处，以95﹪乙醇为空白对照，在652 nm波长下读取吸光度（A）值。
五、计算将测得的吸光度A652值代入公式(1), 即可求得提取液中叶绿素浓度。
所得结果再代入公式(2)，即可得出样品中叶绿素含量（mg ·g－1Fw）。
A652C ( mg .ml－1 ) = ———— (1)34.5公式中：C —叶绿素（a 和b ）的总浓度( mg ·ml－1 )A652—表示在652nm 波长下测得叶绿素提取液的吸光度34.5为叶绿素a和b混合溶液在652nm波长的比吸收系数（比色杯光径为1cm, 样品浓度为1g·L－1时的吸光度）。
C（mg.ml－1）×提取液总量（ml）叶绿素含量（mg .g－1Fw）= ———————————————— (2)样品鲜重（g）方法Ⅱ一、目的掌握叶绿素a、b含量测定的基本原理和方法。
实验二 叶绿素含量的测定
四. 结果计算
4.1 结果计算
C(mg/L)×提取液总量（L）×稀释倍数
Chl = (mg/g叶)
材料鲜重（g）
4.2 比较分析不同植物的叶绿素含量差异及同 种植物在不同生长环境下Chla/Chlb差异。
五. 注意事项
注意叶绿素一定要提干净，避免造 如果浓度太高可进行适当稀释
(浓度单位：g/mL）
(浓度单位：mg/L）
二. 试剂与材料
2.1 试剂： 丙酮、石英砂、碳酸钙 2.2材料： 水稻、玉米、花生、桑树等植物的新鲜叶片。 2.3 仪器与器皿： 分光光度计、台秤、剪刀、研钵、移液管、 漏斗、大试管
三. 实验步骤
叶片洗净、吸干、去大叶脉 ↓ 称0.5g叶用丙酮研磨 ↓ 匀浆过滤（用80%丙酮洗研钵及残渣，合并滤液） ↓ 滤液用80%丙酮定容至10mL ↓ 适当稀释后测A645、A663
注意分光光度计的规范使用
六. 思考题
为什么植物在不同生长环境下其 Chl含量 有差异？ Chla /Chlb有何适应意义？
分光光度计台秤剪刀研钵移液管漏斗大试管叶片洗净吸干去大叶脉适当稀释后测a64541结果计算cmgl提取液总量l稀释倍数chlmgg叶材料鲜重g42比较分析不同植物的叶绿素含量差异及同种植物在不同生长环境下chlachlb差异
实验二. 实验二. 叶绿素含量的测定
一.实验原理
叶绿素a、b在长波的最大吸收峰分别在663nm、 645nm，据Lamber-Beer 定律，可得浓度C与光密 度D间的关系式： D663=82.04Ca +9.27Cb D645=16.75Ca +45.6Cb CA= 12.72D663 – 2.59D645 CB= 22.88D645 – 4.68 D663 CT = 20.29D645 +8.02D663
叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定之勘阻及广创作二、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收, 利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度, 即可用公式计算出提取液中各色素的含量.根据朗伯—比尔定律, 某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C 和液层厚度L成正比, 即A＝αCL式中：α比例常数.当溶液浓度以百分浓度为单元, 液层厚度为1cm时, α为该物质的吸光系数.各种有色物质溶液在分歧波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在分歧波长下的吸光度而求得.如果溶液中有数种吸光物质, 则此混合液在某一波长下的总吸光度即是各组分在相应波长下吸光度的总和.这就是吸光度的加和性.今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量, 只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A, 并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度.在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰, 所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最年夜吸收峰.已知叶绿素a、叶绿素b的80%丙酮溶液在红外区的最年夜吸收峰分别位于663、645nm处.已知在波长663nm下叶绿素a、叶绿素b 在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60.根据加和性原则列出以下关系式：A663=82.04Ca+9.27Cb（1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2）式（1）（2）A 663nm 和A645nm 为叶绿素溶液在663nm 和645nm 处的吸光度, C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度, 以mg/L 为单元.解方程（1）（2）组得C a 2 A 663—2.59 A 645 (3) C b =22.88 A 645—4.67 A 663 (4) 将C a +C b 相加即得叶绿素总量C TC T ＝ C a 十C b ＝20.29A 645—5 A 663 (5)从公式（3）、（4）、（5）可以看出, , 就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度另外, 由于叶绿素a 叶绿素b 在652nm 的吸收峰相交, 两者有相同的吸光系数（均为）, 也可以在此波长下测定一次吸光度（A 652）而求出叶绿素a 、叶绿素 b 总量所测定资料的单元面积或单元重量的叶绿素含量可按下式进行计算： C T ＝5.341000652 A (6)有叶绿素存在的条件下, 用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量.Licht-enthaler 等对Arnon 进行了修正, 提出了80%丙酮提取液中3种色素含量的计算公式：C a ＝A 663—2.59 A 646 (7) C b = A 646—A 663 (8)＝22910427.31000470ba C C A -- (9)式中：C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度；Cx.c 为类胡萝卜素的总浓度；A 663 A 646 A 470 分别为叶绿素提取液在波长663nm 646nm 470nm 下的吸光度.由于叶绿素在分歧溶剂中的吸收光谱有不同, 因此, 在使用其他溶剂提取色素时, 计算公式也有所分歧.绿素a 、叶绿素b 在95%乙醇中最年夜吸收峰的波长分别为665nm 和649nm,类胡萝卜素为470nm,可据此列出以下关系式；C a ＝A 665—A 649 (10) C b = A 649—A 665(11)＝2488.11405.21000470b a C C A --(12)三、资料、仪器设备及试剂（一）资料新鲜（或烘干）的植物叶片.（二）仪器设备1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g ）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管.（三）试剂 1.96％乙醇（或80％丙酮）. 2.石英砂.3.碳酸钙粉.三、实验步伐 1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干资料, 擦净组织概况污物, 剪碎（去失落中脉）, 混匀.四、称取剪碎的新鲜样品0.2g, 共3份, 分别放入研钵中, 加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇, 研成均浆, 再加乙醇10ml, 继续研磨至组织变白.静置3～5min.五、取滤纸1张, 置漏斗中, 用乙醇湿润, 沿玻棒把提取液倒入漏斗中, 过滤到25ml 棕色容量瓶中, 用少量乙醇冲刷研钵、研棒及残渣数次, 最后连同残渣一起倒入漏斗中.六、用滴管吸取乙醇, 将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中.直至滤纸和残渣中无绿色为止.最后用乙醇定容至25ml, 摇匀.七、把叶绿体色素提取液倒入光径1cm 的比色杯内.以95％乙醇为空白, 在波长665nm 、649nm 下测定吸光度.四、实验结果计算与分析按公式(10)、(11)、(12)（如用80%丙酮, 按公式7、8、9）分别计算绿素a 、叶绿素b 和类胡萝卜素的浓度（mg/L ）.(10)、(11)式相加即得叶绿素总浓度.求得色素的浓度后再按下式计算组织中个色素的含量（mg/L 鲜质量或干质量暗示）：叶绿素含量（mg/g ）=1000⨯⨯⨯W NV C式中：C 为色素含量(mg/L);V 为提取液体积 (mL)；N 为稀释倍数；W 为样品鲜质量或干质量(g)；1000即1L=1000ml. 注意事项(1)为了防止叶绿素光解, 把持时应在弱光下进行, 淹没时间应尽量短些.(2)叶绿体色素提取液不能浑浊.可在710nm或750nm下丈量吸光度, 其值应小于当波长为叶绿素a吸收峰时吸光之哦的5%, 否则应重新过滤.(3)用分光光度计法测定叶绿素含量, 对分光光度计的波长精确度要求较高.如果波长与原吸收峰波长相差1nm,则叶绿素a的测定误差为2%, 叶绿素b为19%, 使用前必需对分光光度计的波长进行校正.校正方法除按仪器说明书外, 还应以纯的叶绿素a和叶绿素来校正（表2-12-1）表2-12-1叶绿素含量测定记载表。
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叶绿素含量的测定
一、原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即A ＝αCL
式中：α比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，α为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A ，并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a 、叶绿素b 的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm 处。
已知在波长663nm 下叶绿素a 、叶绿素b 在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm 处的吸光系数分别为16.75和45.60。
根据加和性原则列出以下关系式：
A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2）
式（1） （2）A 663nm 和A645nm 为叶绿素溶液在663nm 和645nm 处的吸光度，C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度，以mg/L 为单位。
解方程（1） （2）组得
C a =12.72 A 663—2.59 A 645 (3) C b =22.88 A 645—4.67 A 663 (4) 将C a +C b 相加即得叶绿素总量C T
C T ＝ C a 十C b ＝20.29A 645—8.05 A 663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b 在652nm 的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A 652）而求出叶绿素a 、叶绿素 b 总量
所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算： C T ＝
5
.341000
652 A (6)
有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。
Licht-enthaler 等对Arnon 进行了修正，提出了 80%丙酮提取液中3种色素含量的计算公式：
C a ＝12.21A 663—2.59 A 646 (7)
C b =20.13 A 646—5.03A 663 (8) Cx.c ＝
229
10427.31000470b
a C C A -- (9)
式中：C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度； Cx.c 为类胡萝卜素的总浓度；A 663 A 646 A 470 分别为叶绿素提取液在波长663nm 646nm 470nm 下的吸光度。
由于叶绿素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。
绿素a 、叶绿素b 在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm 和649nm,类胡萝卜素为470nm,可据此列出以下关系式；
C a ＝13.95A 665—6.8A 649 (10)
C b =24.96 A 649—7.32A 665 (11) Cx.c ＝
248
8.11405.21000470b
a C C A -- (12)
二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料
新鲜（或烘干）的植物叶片。
（二）仪器设备 1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g ）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。
（三）试剂
1.96％乙醇（或80％丙酮）。
2.石英砂。
3.碳酸钙粉。
三、实验步骤
1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g ，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml ，继续研磨至组织变白。
静置3～5min 。
3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml 棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。
直至滤纸和残渣中无绿色为止。
最后用乙醇定容至25ml ，摇匀。
5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm 的比色杯内。
以95％乙醇为空白，在波长665nm 、649nm 下测定吸光度。
四、实验结果计算与分析
按公式 (10) 、 (11) 、 (12) （如用80%丙酮，按公式7、8、9）分别计算绿素a 、叶绿素b 和类胡萝卜素的浓度（mg/L ）。
(10) 、 (11)式相加即得叶绿素总浓度。
求得色素的浓度后再按下式计算组织中个色素的含量（mg/L 鲜质量或干质量表示）： 叶绿素含量（mg/g ）=
1000
⨯⨯⨯W N
V C
式中：C 为色素含量(mg/L);V 为提取液体积 (mL)；N 为稀释倍数；W 为样品鲜质量或干质量(g)；1000即1L=1000ml 。
注意事项
(1) 为了避免叶绿素光解，操作时应在弱光下进行，淹没时间应尽量短些。
(2) 叶绿体色素提取液不能 浑浊。
可在710nm 或750nm 下测量吸光度，其值应小于当波长为叶绿素a 吸收峰时吸光之哦的5%，否则应重新过滤。
(3)用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。
如果波长与原吸收峰波长相差1nm,则叶绿素a 的测定误差为2%，叶绿素b 为19%，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。
校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素a 和叶绿素来校正（表2-12-1）
表2-12-1叶绿素含量测定记载表
材料 处理 重复 样品
质量 提取液总量 吸光度
色素 浓度 mg/L
组织中个色素含
量mg/g
C a/b
仪器测定型号 A 64
6
A 64
9
A 47
C a C b C T Cxc
C ’a C ’
b C
’
T
C
’
xc
1 2 3
x
x
1 2
x。