叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定

有谁知道用分光光度计法测定叶绿素含量的具体步骤????谢谢!!!!!!

一、原理

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A

与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百

分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。

（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。

（三）试剂：96％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。

三、实验步骤

1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙

粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。

四、实验结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A665－6.88A649；Cb=24.96A649－7.32A665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：

叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。

实验步骤1. 取新鲜大红花叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净取新鲜大红花叶片（或其它绿色组织）或干材料，组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。），混匀 2. 称取剪碎的新鲜样品0.5g，放入研钵中，加少量碳酸钙称取剪碎的新鲜样品0.5g 放入研钵中，0.5g，和石英砂及2 3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml 10ml，和石英砂及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，暗处静置3 5min。处静置3～5min。3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒取滤纸1 置漏斗中，用乙醇湿润，入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、25ml 棕色容量瓶中入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量用滴管吸取乙醇，瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。25ml，摇匀。25ml，摇匀。稀释5 后倒入光径1cm的比色杯内光径1cm的比色杯内。5. 把叶绿体色素提取液稀释5倍后倒入光径1cm的比色杯内。把叶绿体色素提取液稀释95％乙醇为参比，在波长665nm 649nm下测定光密度665nm、下测定光密度。以95％乙醇为参比，在波长665nm、649nm下测定光密度。四、实验结果计算将测定得到的吸光值代入下面的式子：将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.7 D665—5.76D649 ………(3) Cb=25.8 D649—7.6 D665………..(4) G总=Ca+Cb=6.10D665+20.04D649………(5) 分别计算叶绿素a、b和总叶绿素的含量分别计算叶绿素a Chl（mg/g.FW）Chl（mg/g.FW）= 提取液体积× × 稀释倍数÷ 样品鲜重叶绿素的浓度1000 原理：原理：SPADSPAD-502 叶绿素仪通过测量叶片在两种波长光学浓度差方式650nm 和叶绿素仪通过测量叶片在两种波长光学浓度差方式650nm 940nm 来确定叶片当前叶绿素的相对数量。940nm来确定叶片当前叶绿素的相对数量。测量值是通过对在二个不同波长区域，叶片传输光的数量进行计算，在这二个区域叶绿素对光吸收不相同的。这二个区域是红光区( 这二个区域叶绿素对光吸收不相同的。这二个区域是红光区(对光有较高的吸收且不受胡萝卜素影响)和红外线区(对光的吸收极低) 收且不受胡萝卜素影响)和红外线区(对光的吸收极低) 开机调零测量1 测量2 测量3 求平均值分光光度计的工作原理：一分光光度计的工作原理：分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生通过系列分光装置，光源透过测试的样品后，特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。分光光度计的基本常识：二分光光度计的基本常识：1、紫外光分光光度计，其使用波长在190－400nm, 波长在190－190 紫外光分光光度计，可见光分光光度计，波长在400－800nm。400 可见光分光光度计，其使用波长在400－800nm。2 消光系数：是溶液对光吸收的比例常数，指在一定的消光系数：是溶液对光吸收的比例常数，浓度和波长等条件下物质的光吸收值，表示。浓度和波长等条件下物质的光吸收值，用K表示。它取决于溶质性质、入射光波长和温度。决于溶质性质、入射光波长和温度。消光度（也叫光密度OD，或吸光值A）：表示溶液吸收消光度（也叫光密度OD 或吸光值A）：表示溶液吸收OD，光的强弱或吸收程度，也用E表示。值愈大，光的强弱或吸收程度，也用E表示。E值愈大，溶液对光吸收的程度愈大。吸收的程度愈大。透光率（用T表示）：是透射光强度（透过比色皿）与透光率（表示）是透射光强度（透过比色皿）表示入射射光强度（还未过比色皿之前的光强度）之比（入射射光强度（还未过比色皿之前的光强度）之比（用T =It /I0表示）。表示）分光光度计的基本维护及使用注意事项：三、分光光度计的基本维护及使用注意事项：1 分光光度计必须放置在固定且不受震动的仪器台上，不分光光度计必须放置在固定且不受震动的仪器台上，能随意搬动。严防震动、潮湿和强光直射。能随意搬动。严防震动、潮湿和强光直射。2 分光光度计内放有硅胶干燥袋应定期更换。分光光度计内放有硅胶干燥袋