真菌免疫调节蛋白作为抗肿瘤辅助药物的开发(免疫调节剂)

真菌免疫调节蛋白作为抗肿瘤辅助药物的开发（免疫调节剂）

1、项目背景

肿瘤是目前威胁人类最严重的疾病之一，手术、放疗、化疗是临床上治疗肿瘤的三大有效手段，虽然在应用上不断取得进步，但其强烈的副作用、对人体赖以抵抗疾病的免疫力的致命打击以及引起的生活质量的降低仍然是很严重的问题。化疗对患者体内的癌细胞有很强的杀伤作用，可以提高疗效，改善预后，但是放化治疗中白细胞下降和免疫力低下是其常见的并发症和制约因素，是直接影响肿瘤治疗和患者康复的重要因素。因此，研制一种药物能提高肿瘤组织对放化疗的敏感性和升高患者机体的白细胞，使低剂量的放化治疗也能够达到治疗目的，同时又提高免疫力是非常必要的。

目前国内临床上使用的抗白细胞减少药物多为生物制剂，如生白能，粒系细胞集落刺激因子等。这些造血细胞因子其刺激骨髓造血效果良好，但价格较贵，有反跳现象，应用受到限制，副作用也较大。临床上也使用传统中药进行辅助治疗，由于中药成分复杂，质量难以控制，疗效很不稳定。因此选择有效、经济，即有较好效价比的升高白细胞药物非常重要，是保证肿瘤放化治疗顺利进行的重要环节。

灵芝和金针菇等食药用真菌含有多种有效药理成分，其中所含的多糖和免疫调节蛋白在治疗肿瘤性疾病，病毒性疾病以及各种免疫缺陷性疾病的药学功效已为证实。真菌免疫调节蛋白是灵芝和金针菇子实体中含有的一种小分子蛋白质，由110个氨基酸组成，二级结构与人类免疫球蛋白重链可变区相似，具有刺激外周血淋巴细胞增殖、促进核酸和蛋白质合成、抑制过敏反应和增强机体免疫力等作用。天然的灵芝和金针菇免疫调节蛋白含量很低，提取量仅为30-80mg/kg左右。我们已经将编码灵芝和金针菇免疫调节蛋白的基因在酵母菌中高效表达，通过基因工程菌的发酵，获得了高纯度的重组真菌（灵芝和金针菇）免疫调节蛋白，并对其理化特性，空间结构，免疫生理功能和抗肿瘤活性等以及作用机理等进行了系列研究。特别是重组真菌免疫调节蛋白具有促进外周血淋巴细胞，巨噬细胞和脾细胞的增殖，诱导其分泌干扰素，白介素-2和肿瘤坏死因子等功能，以及升高小鼠白细胞低下模型白细胞的水平，抵抗在小鼠肿瘤治疗过程中白细胞减少的作用尤为显著。

重组真菌免疫调节蛋白具有极大的开发成为肿瘤放化疗后提高白细胞和免疫力的辅助药物的潜力和价值。我们的研究结果表明，重组真菌免疫调节蛋白能持续升高小鼠白细胞低下模

型白细胞的水平，抵抗在小鼠肿瘤治疗过程中白细胞的减少，并且通过诱导淋巴系统分泌的各种细胞因子提高免疫力，对肿瘤有综合辅助治疗的作用。重组灵芝和金针菇免疫调节蛋白作为抗肿瘤升白细胞和免疫调节单体药物，能有效克服同类产品疗效不稳，易产生耐药性或价格昂贵的弱点。

2. 已有的基础

（1）重组蛋白工程菌构建，发酵工艺和特性研究

●编码基因人工合成、工程菌构建和筛选

●100升中试表达：产量约为800mg/L，建立了规模化生产的工艺条件。

●纯度鉴定测定：重组蛋白纯度为>99%。

●空间结构的确定：首次获得重组灵芝蛋白晶体，完成其空间结构的测定。

（2）免疫学活性及安全性检测指标试验

●促进小鼠淋巴细胞和脾细胞增生并诱导分泌干扰素和白介素等细胞因子。

●小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞：明显提高巨噬细胞的吞噬百分数和指数。

●对大鼠骨髓及造血功能的影响：对其骨髓造血功能无影响。

●对人红细胞的溶血实验：无溶血作用。

●对大鼠动脉及静脉血管壁的影响：对大鼠动脉、静脉组织未见病理性异常。

●对小鼠系统性过敏反应的影响：抑制牛血清白蛋白诱导小鼠系统性过敏反应。

（3）升高白细胞的药效学实验：动物模型实验

●对大鼠白细胞的影响：与阳性升白药物细胞集落刺激因子的作用一致。

●对小鼠荷瘤细胞生长的影响--能抑制S180（小鼠肉瘤细胞株）、H22（小鼠肝癌细胞株）

的生长，并维持白细胞的正常水平。

●对人白血病细胞NB4、K562、HL-60具有杀伤作用

●对人白血病细胞NB4、K562、HL-60诱导凋亡作用

（4）已申请三项专利：

●重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法及其用途

申请号：200910010576.5 申请人：刘立侠孙非许守民林景卫张韧

●一种重组灵芝免疫调节蛋白的制备方法

申请号：200710193546.3 申请人：孙非刘立侠许守民梁重阳

●具有抗肿瘤作用的重组灵芝免疫调节蛋白及其药物制剂

申请号：2008110050206.X 申请人：孙非刘立侠许守民梁重阳成果：吉林省科学技术成果基因工程重组制剂的研究—灵芝重组免疫调节蛋白基因工程药物的研究2008065-02；

奖励：吉林省科技进步二等奖（2009）重组灵芝免疫调节蛋白晶体空间结构及其抗肿瘤的研究

（5）已发表相关论文：

1.Liang Huang, Fei Sun, Chongyang Liang, Yong-Xing He, Rui Bao, Lixia Liu* and Cong-Zhao Zhou* (2009)

Crystal structure and anti-tumor activity of LZ-8 from the fungus Ganoderma lucidium.Proteins: Structure,Function and Bioinformatics: 75:524-7

2.Jing-Wei Lin · Li-Xia Hao · Gui-Xue Xu · Fei Sun ·Feng Gao ·Ren Zhang ·Li-Xia Liu* (2009) Molecular

cloning and recombinant expression of a gene encoding a fungal immunomodulatory protein from Ganoderma lucidium in Pichia pastoris World J Microbiol Biotechnol. 25:383-390.

3.Liu Li-Xia C. Su, P. Howe, J. Patries, F. Sun and R. Zhang (2002) Comparative analysis of the ITS rDNA

sequence, nutrient composition and immunological activity of an unnamed Ganoderma species in Australia.

Ganoderma：Genetics，Chemistry，Pharmacology and Therapeutics. Edited by Zhi-Bin Lin, Beijing Medical University Press, 2002. ISBN 7-810 71-410-1/R.410. pp65.

4.Jing-Wei Lin, Ren Zhang, Li-Xia Hao, Gui-Xue Xu, Ying Liu, Fei Sun, Li-Xia Liu*(2009) Recombinant

expression of FIP-fve, a fungal immunomodulatory protein from the edible mushroom Flammulina velutipes in Pichia pastoris. Canadian Journal of Microbiology In press.

5.梁重阳，徐蔚青，曹焱鑫，刘立侠，张淑芹，刘志屹，李泓睿，李柏志，孙非(2008). FITC

标记重组灵芝免疫调节蛋白(rLz-8)在NB4细胞中的动态定位.高等化学学报30：489-492

6.郭琦，刘立侠，孙非（2007）真菌免疫调节蛋白药理学研究进展。安徽医药11(5): 385-387。

7.张春玉, 黄国辉, 林景卫, 孙非, 许守民, 刘立侠* (2005)长白山药用真菌树舌凝集素的

纯化及生化特性.中国生物工程杂志25（9）：84-88.

8.林景卫，孙非，张韧，张春玉，刘立侠* (2005) 真菌免疫调节蛋白的研究进展。中国免疫

学杂志21(6): 477-480.

9.林景卫，张春玉, 姜丽丽，陈珊，张韧，刘立侠* (2003) 长白山灵芝（Ganoderma lucidum）

真菌免疫调节蛋白（FIP）基因的克隆和表达载体的构建。东北师范大学报35：110~114