免疫共沉淀步骤-磁珠
Protein A G免疫沉淀磁珠使用说明书
Protein A/G免疫沉淀磁珠Figure 1. General Protocol for ImmunoprecipitationcomplexSDS-PAGE loading buffer Neutralize bufferMagnetic Beads antibodyMagnetic Separator Remove supernatant Pipette Repeat45产品组分产品参数：磁珠粒径100 nm，浓度10 mg/mL，结合量>400 μg human IgG/mL2-8℃保存，保质期2年。
储存方法实验步骤1. 抗原样品制备本操作说明书提供以下三种样品处理方法。
2. 磁珠预处理将磁珠漩涡振荡1 min，使其充分混悬；取25~50 µL磁珠悬液置于1.5 mL EP管中。
加入200 µL结合缓冲液洗涤，进行磁性分离（将离心管置于磁力架上，管底对准①卡口压紧，静置2分钟或待磁珠吸附于管壁），吸弃上清。
抽出②磁条，加入200 µL结合缓冲液重复洗涤一次，插回②磁条，磁性分离并吸弃上清。
加入200 µL结合缓冲液重悬磁珠备用。
血清样品处理：若目标蛋白丰度较高， 建议用结合缓冲液稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10~100 µg/mL，置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。
悬浮细胞样品处理：离心收集细胞（4℃, 500 g, 10 min），弃上清后称重，按每毫克细胞50 µL的比例用1×PBS洗涤2次；按每毫克细胞5~10 µL的比例加入结合缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。
贴壁细胞样品处理：移去培养基，按每1.0×105个细胞150 µL的比例用1×PBS洗涤两次；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5 mL EP管内，按每1.0×105个细胞20~30 µL的比例加入结合缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。
免疫共沉淀步骤
免疫共沉淀步骤在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。
Input是断裂后的基因组DNA,需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。
Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
1.1.1免疫沉淀1)蛋白提取(1)取10盘长满10cm大皿的HepG2细胞，弃去培养基，用预冷PBS清洗细胞3次，吸净PBS残液。
(2)加预冷的裂解液(含蛋白酶和磷酸酶抑制剂)至培养皿中(每皿500-1000ul),冰上孵育30min。
(3)用细胞刮刮取，收集细胞裂解液并移至离心管，4c离心13,000g,10min。
(4)将上清移至新离心管中，可用于蛋白浓度测定或远期研究。
2)准备磁珠(1)将proteinA和proteinG珠子分别摇晃5min混悬，各吸取50ul珠子到1.5mlEP管中，组成100ul珠子混合物。
(2)小离心机离心20-30s,去上清。
3)结合抗体(1)将肝细胞癌患者血清20ul和200ulAbBinding&WashingBuffer加入上述EP管中。
(2)室温旋转10min孵育。
(3)小离心机离心20-30s,去上清。
(4)力口入200ulAbBinding&WashingBuffer,轻柔吹打重悬珠子。
4)免疫沉淀(1)将上述EP管离心，去上清。
(2)取5ml蛋白裂解液轻柔吹打重悬珠子-抗体复合物。
(3)室温旋转孵育30min(将抗原结合到珠子-抗体复合物上)。
(4)离心机离心20-30s,将上清吸入干净离心管备用。
(5)使用200ulWashingBuffer清洗珠子-抗体-抗原复合物3次，即轻柔重悬、离心去上清3次。
(6)100ulWashingBuffer重悬珠子-抗体-抗原复合物，将混悬液移至干净EP管。
蛋白质免疫共沉淀步骤
蛋白质免疫共沉淀步骤
蛋白质免疫共沉淀是一种用于检测蛋白质相互作用的实验方法，其步骤通常包括以下几个方面：
1. 样品制备，首先需要准备含有目标蛋白质的样品，可以是细
胞提取物或者纯化的蛋白质溶液。
样品需要经过适当的处理，比如
离心、裂解等，以提取目标蛋白质。
2. 抗体结合，将目标蛋白质的抗体固定在载玻片、琼脂糖珠或
磁珠等固相载体上，形成免疫复合物。
3. 共沉淀，将制备好的抗体-蛋白质复合物与样品混合，允许
它们发生特异性结合，形成免疫共沉淀复合物。
4. 洗涤，对免疫共沉淀复合物进行洗涤，以去除非特异性结合
的蛋白质和其他杂质。
5. 蛋白质溶解，将免疫共沉淀复合物溶解于适当的缓冲液中，
以便后续的分析。
6. 分析，最后，可以使用Western blot、质谱分析、酶联免疫吸附实验（ELISA）等技术对共沉淀的蛋白质进行检测和分析。
这些步骤可以帮助研究人员确定目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用，从而揭示细胞信号传导、蛋白质复合物组装等重要生物学过程。
同时，在进行蛋白质免疫共沉淀实验时，需要严格控制实验条件，选择合适的抗体以及适当的质控措施，以确保实验结果的准确性和可重复性。
免疫共沉淀实验流程--chip
染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告步骤一：样品准备试剂和仪器：Biopulverizer(biospec)37% formaldehyde甘氨酸(Glycine)PBSprotease inhibitors步骤二：细胞交联1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。
2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。
3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。
4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。
5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。
800Xg，4°C离心5min，小心去掉上清。
步骤三：细胞裂解试剂:裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%;Tritonx -100 0.25%。
裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。
步骤:1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。
2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。
3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。
步骤四：超声破碎ＤＮＡ仪器:Bioruptor(Diagenode)步骤:(1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。
(2)、在超声池中注入一定量的冰水。
co-ip抗体和磁珠结合原理
co-ip抗体和磁珠结合原理
Co-IP（共免疫沉淀）是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，用于检测目标蛋白与其他蛋白之间的相互作用关系。
Co-IP 抗体和磁珠结合的原理是利用特异性抗体将目标蛋白与其他相互作用蛋白一起沉淀下来。
具体步骤如下：
1. 将目标蛋白和其相互作用蛋白混合，在适当的条件下使它们形成复合物。
2. 加入特异性抗体，使其与目标蛋白结合。
3. 添加蛋白A/G磁珠，这些磁珠可以结合抗体。
4. 将混合物在低温条件下轻轻摇动，使抗体与目标蛋白及其相互作用蛋白结合。
5. 使用磁力架将磁珠沉淀下来，将上清液去除。
6. 用适当的缓冲液洗涤磁珠，以去除非特异性吸附物质。
7. 用适当的缓冲液洗涤磁珠，以去除非特异性吸附物质。
8. 使用适当的洗涤缓冲液洗涤磁珠，以去除非特异性吸附物质。
9. 在洗涤后的磁珠上溶解目标蛋白复合物。
10. 进一步进行Western blot、质谱分析或其他实验，以确定蛋白相互作用。
通过这种方法，可以将目标蛋白与其相互作用蛋白一起沉淀下来，进而研究它们之间的相互作用关系。
同时，利用磁珠结合
原理可以有效地减少非特异性吸附物质的干扰，提高实验的特异性和纯度。
rna免疫共沉淀实验步骤
rna免疫共沉淀实验步骤
RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation）是一种常用于研究RNA与蛋白质相互作用的实验方法。
通过该实验可以确定RNA分子与特定蛋白质的结合情况，从而揭示RNA在细胞内的功能及调控机制。
下面将介绍RNA免疫共沉淀实验的步骤。
1. 细胞培养和处理，首先，将感兴趣的细胞系培养至适当的密度，然后进行处理，如添加药物、激素或其他刺激剂，以诱导RNA 与蛋白质的相互作用。
2. 交联，将细胞用交联剂（如甲醛）进行交联，以稳定RNA与蛋白质的相互作用。
3. 细胞裂解，将交联后的细胞裂解，并用裂解缓冲液溶解细胞膜，释放细胞内的RNA与蛋白质。
4. 免疫沉淀，将特异性抗体与蛋白A/G琼脂糖磁珠或琼脂糖珠结合，形成抗体-琼脂糖复合物。
然后将裂解液与抗体-琼脂糖复合物共孵育，使特定蛋白质与其结合的RNA被抗体-琼脂糖复合物沉淀下来。
5. 洗涤，经过免疫沉淀后，对琼脂糖磁珠进行多次洗涤，以去除非特异性结合的RNA和蛋白质。
6. RNA的提取，用三氯化锑或其他方法从琼脂糖磁珠上提取RNA。
7. RNA的分析，提取的RNA可以通过RT-qPCR、Northern blotting等方法进行定量或质量分析，从而确定RNA与特定蛋白质的结合情况。
通过RNA免疫共沉淀实验，研究人员可以揭示RNA与蛋白质的相互作用，从而深入了解RNA在细胞内的功能及调控机制。
这一实验方法对于研究RNA的生物学功能和疾病机制具有重要意义。
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀原理及步骤
第一步：制备抗体或抗原
第二步：交叉链接抗体或抗原
为了增强免疫共沉淀的稳定性，可以通过交叉链接抗体或抗原来使其形成更稳定的复合物。
交叉链接可以通过化学交联剂（如戊二醛）或交叉链接抗体分子的抗体-抗体结合位点实现。
交叉链接后的抗体或抗原会形成二聚体或多聚体结构。
第三步：取样和预处理
目标蛋白所在的细胞、组织或培养上清需要经过取样和预处理来获得纯净的样本。
这通常包括细胞裂解、蛋白质提取、离心、过滤等步骤。
预处理的目的是去除可能干扰检测结果的其他蛋白质或物质。
第四步：抗体结合和免疫沉淀
将抗体加入预处理样本中，使其与目标蛋白结合。
可以选择直接加入抗体，也可以将抗体固定在固相材料上，如蛋白A/G琼脂糖小柱或磁珠，然后将样本与固相材料接触，使抗体与目标蛋白结合。
第五步：洗涤
为了去除非特异性结合或杂质，需要对固相材料进行洗涤。
洗涤缓冲液的选择和洗涤次数将影响免疫沉淀的特异性和纯度。
第六步：洗脱和分析
将洗涤后的固相材料加入一定体积的洗脱缓冲液，使免疫沉淀物从固相材料上被洗脱下来。
洗脱后的沉淀物可以进行进一步的分析，如Western blot、质谱分析、蛋白质定量等。
总结：免疫共沉淀是一种用于检测和分离特定蛋白质复合物的免疫学技术。
该技术基于抗体与抗原结合的特异性，通过将目标蛋白与抗体结合并经过洗涤和洗脱步骤，实现对复合物的检测和纯化。
免疫共沉淀步骤包括制备抗体或抗原、交叉链接、取样和预处理、抗体结合、洗涤、洗脱和分析等过程。
这个技术广泛应用于生物医学研究中，可用于蛋白质相互作用的研究、药物研发和疾病诊断等领域。
羧基磁珠免疫共沉淀
羧基磁珠免疫共沉淀
羧基磁珠免疫共沉淀（Carboxyl Magnetic Beads Immunoprecipitation）是一种用于富集特定蛋白质或蛋白质复合物的技术。
该技术基于抗体的特异性识别能力，结合磁性珠子的特性，可以高效地捕获目标蛋白质及其结合物。
在羧基磁珠免疫共沉淀中，首先将具有羧基官能团的磁珠与特定抗体偶联。
接着，将样品中含有目标蛋白质的溶液与偶联好的磁珠一起孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
然后通过磁力，在外部磁场的作用下，将磁珠沉淀到管底或壁上，将其他非特异性结合的蛋白质洗掉。
最后，用适当的缓冲液洗涤磁珠，将沉淀的蛋白质溶解出来进行下一步的分析。
羧基磁珠免疫共沉淀技术可以广泛应用于蛋白质相互作用及信号转导的研究中。
通过富集目标蛋白质及其结合物，可以进一步分析其功能、相互作用关系及参与的生物学过程。
该技术具有操作简便、灵敏度高、靶向选择性好等优点，因此在蛋白质组学和细胞信号传导等领域得到了广泛应用。
免疫共沉淀技术流程
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在开展免疫共沉淀实验之前，要做好充分的准备工作。
免疫共沉淀实验方案
免疫共沉淀实验方案一、实验试剂和材料Dynabeads® Protein G(novex by life technologies)PBS pH7.4(含0.01%Tween-20)0.1M Na-phosphate（Washing Buffer）50mM Glycine pH2.8(Elution Buffer)二、实验步骤（一）准备磁珠1.将瓶子倾斜旋转5min左右，使瓶中磁珠悬浮；2.吸取50ul磁珠液于离心管中；3.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；4.从磁铁架上取下离心管；（二）结合抗体1.加入200ul用PBS(含0.01%Tween-20)稀释的抗体；2.室温旋转孵育10min;3.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；4.从磁铁架上取下离心管，用200ul PBS(含0.01%Tween-20)温和吹吸并重悬磁珠-抗体复合体；（三）免疫沉淀抗原1.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；2.从磁铁架上取下离心管，加入抗原样品并温和吹吸，重悬磁珠-抗体复合物；3.室温旋转孵育10min，使抗原结合到磁珠-抗体复合物上;4.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；5.用washing buffer 3次洗涤磁珠-抗体-抗原复合物，弃上清；6.用100ul washing buffer重悬磁珠-抗体-抗原复合物，并将磁珠悬浮液转移到干净的离心管中，以避免蛋白抗原粘附在管壁上。
（四）洗脱抗原1.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；2.加入200ul Elution Buffer至离心管中，温和吹吸并重悬磁珠-抗体-抗原复合物；（不要吹打出气泡）3.室温旋转孵育2min；4.将离心管置于磁铁架上，并将洗脱液（含有洗脱的抗原、抗体）转移到干净的离心管中，用于后续的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析。
免疫共沉淀原理图解
免疫共沉淀原理图解免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种用于分离和富集特定蛋白质的技术。
基于特异性抗体与目标蛋白质的结合，IP可以用于检测蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用、蛋白质修饰和定位等方面的研究。
下面将介绍免疫共沉淀的原理和流程。
原理：免疫共沉淀是通过特异性抗体与目标蛋白质的结合，来沉淀出目标蛋白质及其相关蛋白质、DNA或RNA等分子的方法。
具体来说，IP通过以下步骤实现：1. 将细胞裂解，使蛋白质溶于缓冲液中。
2. 加入特异性抗体，并使其与目标蛋白质结合。
3. 加入亲和素（一种与抗体结合的蛋白质），再将亲和素固定在磁珠上。
4. 加入磁珠后，亲和素与抗体结合，并沉淀下含有目标蛋白质及其相关分子的复合物。
5. 用洗涤缓冲液洗涤磁珠，并用洗涤液去除非特异性结合的蛋白质。
6. 用洗涤缓冲液或热水溶液将目标蛋白质及其相关分子从磁珠上去除。
7. 最后，用Western blot或其他方法检测目标蛋白质及其相关分子。
流程：IP的具体实验流程如下：1. 细胞溶解：将含有目标蛋白质的细胞或组织裂解并使蛋白质溶于缓冲液中。
2. 抗体结合：加入经过验证的特异性抗体，使其与目标蛋白质结合。
3. 亲和素结合：加入亲和素，使其与抗体结合，并将其固定到具有磁性的磁珠上。
4. 免疫共沉淀：将磁珠加入到蛋白质混合物中，使亲和素与抗体结合并沉淀出目标蛋白质及其相关分子。
5. 洗涤：用洗涤缓冲液将非特异性结合的蛋白质去除，保留目标蛋白质及其相关分子。
6. 去除磁性珠：用洗涤缓冲液或热水溶液将目标蛋白质及其相关分子从磁珠上去除。
7. 分析：用Western blot、质谱等多种技术检测目标蛋白质及其相关分子。
总结：免疫共沉淀是一种非常有用的技术，可以帮助研究者了解蛋白质相互作用、蛋白质修饰及其定位等方面的信息。
虽然技术流程复杂，但只要按照正确的方法进行操作，就能够产生非常有意义的结果。
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是一种广泛应用于生物学研究的技术，它可以用来检测蛋白质与染色质之间的相互作用。
该技术能够帮助研究人员确定蛋白质在基因表达中的作用，以及探究细胞的调节机制。
本文将详细介绍染色质免疫共沉淀技术的原理、步骤、优缺点和应用。
一、原理染色质免疫共沉淀技术是基于抗体特异性识别蛋白质的原理。
在该技术中，首先将抗体与磁珠或琼脂糖等载体结合，形成免疫复合物。
接着，将该免疫复合物加入到含有细胞或组织的裂解液中，使其与目标蛋白结合。
随后，使用磁力或离心等手段将免疫复合物与与其结合的蛋白、核酸等分离出来。
最后，利用PCR、微阵列芯片等技术对分离出来的蛋白、核酸等进行检测和分析。
二、步骤染色质免疫共沉淀技术的步骤主要包括：1. 细胞或组织的裂解：将细胞或组织加入到含有蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、盐和缓冲液等的裂解液中，使其破裂并释放出蛋白、DNA等。
2. 免疫复合物的制备：将抗体与磁珠或琼脂糖等载体结合，形成免疫复合物。
3. 免疫复合物与目标蛋白的结合：将免疫复合物加入到裂解液中，与目标蛋白结合。
4. 免疫复合物的分离：使用磁力或离心等手段将免疫复合物与与其结合的蛋白、核酸等分离出来。
5. 分析：利用PCR、微阵列芯片等技术对分离出来的蛋白、核酸等进行检测和分析。
三、优缺点染色质免疫共沉淀技术具有以下优点：1. 高特异性：该技术可以通过抗体特异性识别蛋白质，具有高特异性。
2. 高灵敏度：该技术可以检测到极低浓度的蛋白质。
3. 可重复性：该技术具有较高的可重复性，可以用于多次实验。
4. 可广泛应用：该技术可以应用于不同种类的细胞和组织。
然而，染色质免疫共沉淀技术也存在以下缺点：1. 受抗体质量限制：抗体的质量、特异性和亲和力等因素会影响该技术的结果。
2. 受组织分解程度限制：组织分解不彻底会导致目标蛋白无法完全释放，从而影响该技术的结果。
3. 受背景干扰影响：免疫复合物的制备和分离过程中，可能会出现背景干扰，影响结果的准确性。
免疫共沉淀操作步骤
免疫共沉淀操作步骤免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白与其他分子的相互作用。
本文将介绍免疫共沉淀的操作步骤，包括前期准备、取样、免疫共沉淀、洗涤、洗脱和分析结果等。
一、前期准备1. 准备所需试剂：PBS缓冲液（含0.1%的Tween-20）、蛋白质抽提缓冲液（含有适当的蛋白酶抑制剂）、抗体（单克隆或多克隆抗体）、控制组织或细胞苗、蛋白质A/G磁珠等。
2.对样品进行处理：收集样品，如细胞或组织，并用蛋白质抽提缓冲液裂解细胞膜或组织。
3. 确定抗原-抗体反应的条件：进行Western blot或其他实验，确定抗体和目标蛋白的最佳工作浓度和最佳条件。
二、取样1.将裂解的细胞或组织样品通过离心等手段去除细胞碎片和残留的细胞核。
2.将上清液收集到新的离心管中，并测定样品的总蛋白浓度，以便后续计算抗体的用量。
3.根据总蛋白浓度将样品分成相等的小样本，并放入不同的离心管中。
三、免疫共沉淀1.将试验管中的抗体与适量的蛋白质A/G磁珠混合，孵育一段时间，使抗体与磁珠形成固定复合物。
2.将磁珠与固定复合物加入到每个含有样品的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。
3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中，以减少非特异性结合的背景。
4.用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。
5.转移沉淀到新的离心管中，并用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除残留的非特异性结合蛋白质。
四、洗涤1.将磁珠与背景低的洗涤缓冲液混合，孵育一段时间，混匀后在冰上孵育。
2.将磁珠与洗涤缓冲液加入到每个含有沉淀的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。
3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中。
4.用洗涤缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。
五、洗脱1.将洗涤缓冲液去除，加入适量的脱附缓冲液，孵育一段时间，混匀并在冰上孵育。
免疫共沉淀(CO-IP)实验方法与操作步骤
免疫共沉淀(CO-IP)实验方法与操作步骤CO-IP是用于检测或探究蛋白与蛋白之间相互作用的实验，属于IP实验的扩展，在样品溶液中，捕获和纯化通过天然相互作用及靶标结合的其他大分子蛋白，基于抗原抗体的特异性免疫结合，以饵蛋白为诱饵蛋白，通过饵蛋白抗体捕获，磁珠吸附结合，进而将饵蛋白结合的互作蛋白捕获得到，纯化定量定性分析。
实验操作步骤：1.样本准备组织和细胞是最常见的样本类型。
组织用液氮研磨，研磨时少量多次加入液氮，研磨时用研磨杵按住组织旋转研碎，需戴护目镜或是头盔。
细胞直接消化或刮下离心，预冷1XPBS清洗1-2次，消化是影响细胞膜表面蛋白构象，尤其是层黏连蛋白和粘附蛋白改变，导致细胞贴壁不牢，进而脱落，对细胞内蛋白影响几乎没有，细胞刮下来也行，虽然存在物理机械损伤，但损伤相基本可忽略。
2.细胞裂解使用弱裂解液，不要直接用WB裂解蛋白的裂解液，做免疫共沉淀，要保留细胞内天然构建结合，强裂解液会使蛋白变性，弱性裂解液在于表面活性剂，比如NP-40、Triton X-100。
3. 磁珠清洗及抗体孵育磁珠用之前摇一摇，按照使用量吸取，不要用小枪头，用1ml大枪头，且是无菌无酶，加入适量抗体与buffer，混入磁珠即可。
4. 磁珠-抗体-裂解液孵育此为核心步骤，磁珠与抗体孵育完成后，buffer清洗3次，加裂解液。
清洗是为去除未结合至磁珠表面的游离抗体，防止游离未结合的抗体结合到饵蛋白，降低结合总量。
磁珠-抗体复合物清洗完，加裂解液孵育，注意要颠转孵育，不能静置，磁珠是固体，溶液沉降，颠转孵育，不但能使磁珠不沉降，而且使磁珠-抗体与蛋白结合更充分全面。
放置4℃，颠转过夜。
5.清洗纯化磁珠-抗体-蛋白复合物关键步骤，需清洗6次，清洗少了会导致假阳性，清洗次数过多结合蛋白损失大，清洗时要用两种buffer，一种低盐，一种高盐，尽量去除未结合的蛋白，防止假阳性出现。
6.检测检测分为三种，根据实验目的区分。
一是银染：按照input组、目的组、IgG 组、beads组跑胶银染，查看蛋白差异性；二是WB检测：根据预测结合的靶蛋白，进行WB检测，看有无条带，确认是否结合（要做内参）；三是MS（质谱）检测：质谱检测是根据产物蛋白，进行酶解消化成多肽，再测定多肽，获取序列，比对蛋白数据库，查看潜在结合蛋白有哪些，探讨结合蛋白。
免疫沉淀原理及步骤
免疫沉淀原理及步骤
免疫沉淀是一种常用的免疫学实验技术，它主要用于检测特定抗原与抗体的相
互作用。
在免疫沉淀实验中，抗体与抗原结合后形成免疫复合物，通过沉淀技术可以将免疫复合物从混合物中分离出来，从而进行进一步的分析和研究。
本文将介绍免疫沉淀的原理及步骤，希望能对相关实验工作者有所帮助。
原理：
免疫沉淀的原理主要是利用抗体与抗原的特异性结合来实现对特定蛋白质的沉淀。
在实验中，首先将样品与特异性抗体孵育，使抗体与抗原结合形成免疫复合物，然后通过添加沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G琼脂糖磁珠）来沉淀免疫复
合物，最后通过洗涤和离心等步骤将免疫复合物分离出来。
步骤：
1. 样品制备，将待检样品进行适当处理，如细胞裂解、蛋白抽提等，获得目标
蛋白质的混合物。
2. 抗体孵育，将特异性抗体加入样品混合物中，使其与目标蛋白质发生特异性
结合，形成免疫复合物。
3. 沉淀，加入沉淀剂，如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G琼脂糖磁珠，将免疫复
合物沉淀下来。
4. 洗涤，用洗涤缓冲液对沉淀物进行洗涤，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
5. 离心，通过离心将沉淀物沉淀到管底，去除洗涤缓冲液。
6. 分析，将沉淀物进行进一步的分析，如Western blot、质谱分析等，以获取
所需的数据和结果。
总结：
免疫沉淀作为一种重要的免疫学实验技术，广泛应用于蛋白质相互作用、蛋白质纯化等领域。
掌握免疫沉淀的原理及步骤，对于开展相关实验具有重要的指导意义。
希望本文所介绍的免疫沉淀原理及步骤能够为实验工作者提供帮助，使其能够准确、高效地开展免疫沉淀实验，为科研工作的开展提供有力支持。
免疫共沉淀步骤-磁珠
一、细胞裂解1、转染后24-48 h收获细胞，用冷的PBS（4°C）洗细胞三次，最后一次吸干PBS；2、加入适量（500μl）预冷的细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min；3、用预冷的细胞刮将细胞从培养瓶上刮下，将裂解液收集到1.5mlEP管中，4°C、最大转速（14000rpm）离心30 min后取上清；4、取少量（20μl）裂解液以备western blotting分析；二、准备磁珠5、将Dynabeads完全重悬；6、吸取50μl（1.5mg）Dynabeads到一个EP管中；（准备两份，一份结合抗体，一份去除非特异性蛋白）7、将EP管放在磁力架上，将Dynabeads从溶液中分离出来，吸去上清；8、再用预冷的lysis buffer 500μl洗三次，每次都用磁力架将Dynabeads分离出来，最后将EP管从磁力架上取下来；三、结合抗体9、取10μl的Antibody（Ab），加入到准备好Dynabeads的EP管中；10、4°C旋转、孵育5h；11、将EP管放在磁力架上，把Dynabeads-Ab复合物从溶液中分离出来，吸去上清；12、用冷的lysis buffer 1000μl洗三次，最后一次尽量吸尽上清，再加入25μl 的lysis buffer和0.2μl的10%叠氮化钠；四、免疫共沉淀13、在裂解好的细胞样品500μl（步骤3）中加入Dynabeads（步骤6）25μl中，4°C旋转2h（去除非特异性蛋白）；14、将EP管放在磁力架上，收集上清；15、将上清加入预处理的Dynabeads-Ab复合物中，轻轻重悬Dynabeads-Abs复合物；16、4°C旋转、孵育2h，让Ag与Dynabeads-Abs复合物结合；17、将EP管置于磁力架上，转移上清到一个新的EP管中，以备需要时进一步分析；18、用1000μl的lysis buffer洗Dynabeads-Ab-Ag复合物三次，每次清洗后在磁力架上分离，移去上清，再温柔地重悬复合物；（Avoid co-elution of proteins bound to the tube wall）四、洗脱目标蛋白19、将EP管放在磁力架上，吸去上清；20、加入20μl的2×SDS 上样缓冲液，轻轻重悬Dynabeads-Ab-Ag复合物；21、50°C加热10min；22、将EP管放在磁力架上，取上清作为样品，SDS-PAGE电泳。
免疫共沉淀原理及实验方法
免疫共沉淀原理及实验方法1.利用抗体的高度特异性与抗原结合，将抗原特异性地富集。
2.抗原-抗体复合物与磁珠或珠标记结合，通过磁力或离心作用将复合物分离沉淀下来。
1.材料准备：准备所需的细胞或组织样品，以及抗体、磁珠或珠标记等实验试剂。
2.细胞或组织提取：将细胞或组织样品裂解，并用适当的缓冲液重悬，获得蛋白质提取液。
3.抗体结合：将蛋白质提取液与所需的抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.沉淀：将磁珠或珠标记加入抗原-抗体复合物中，使其结合，再利用磁力或离心作用将复合物沉淀下来。
5.洗涤：用适当的缓冲液洗涤沉淀物，去除非特异性的蛋白质。
6. 分离与检测：将沉淀物分离出来并进行进一步的分析、检测，如Western blotting、质谱分析等。
1.高特异性：通过使用特异性抗体，可以选择性地沉淀目标蛋白质，减少非特异性的干扰。
2.高灵敏度：沉淀后的蛋白质富集度高，有利于进一步的鉴定和分析。
3.可用于分析蛋白质相互作用：通过免疫共沉淀技术，可以研究蛋白质与其他分子的相互作用关系，揭示机体内蛋白质功能和信号传导的调控机制。
免疫共沉淀技术在生命科学研究中扮演着重要的角色。
例如，通过免疫共沉淀可以研究蛋白质与DNA、RNA或其他蛋白质的相互作用关系，从而了解基因调控、信号传导和代谢途径等重要生物学过程的调控机制。
此外，免疫共沉淀还可以用于筛选靶蛋白质、鉴定疾病标志物，以及评估一些药物对蛋白质相互作用的影响。
综上所述，免疫共沉淀技术是一种重要的实验方法，通过利用特异性抗体与所要研究的蛋白质结合，实现蛋白质的富集、分离和鉴定。
该技术广泛应用于细胞生物学、分子生物学和疾病研究等领域，对揭示分子相互作用、信号传导机制和疾病发生发展具有重要意义。
Abbkine丨免疫(共)沉淀磁珠 琼脂糖实验步骤
Abbkine丨免疫（共）沉淀磁珠/琼脂糖实验步骤免疫沉淀（IP）是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等固相支持物上的特异性抗体对抗原进行小型亲和纯化的方法。
需要从细胞或组织裂解物中分离用于免疫印迹检测或其他检测技术的蛋白和其他生物分子时，免疫沉淀是常用的方法之一。
接下来就和abbkine一起分享一下免疫（共）沉淀磁珠/免疫（共）沉淀琼脂糖的相关问题。
什么是免疫共沉淀？免疫共沉淀的优缺点是什么？免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质具有生理性相互作用的有效方法。
优点：相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物；能够对间接相互作用的蛋白进行捕获，比如对蛋白复合物的多种成分进行鉴定；可以研究具有修饰的目的蛋白；操作流程较为简便，不需要事先制备大规模蛋白表达文库。
缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；不能判断直接互作还是间接互作，两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择特异的检测抗体，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性；灵敏度没有亲和色谱高；可能因为多种非特异性吸附带来假阳性结果，因此需要设置严格的对照。
免疫共沉淀（Co-IP）具体实验方法免疫共沉淀的大致流程如下：准备蛋白样品--抗原抗体结合--proteinA/G与抗体结合--免疫共沉淀分离--WB/MS分析出报告免疫共沉淀的具体操作步骤如下：(1)取20μL的Protein A/G Magnetic Beads加入到1.5mL离心管中，离心管置于磁分离架上，静置10s，吸弃上清。
(2)加入1mL1×Wash Buffer，重悬Protein A/G Magnetic Beads，离心管置于磁分离架上，静置10s，吸弃上清，重复3次。
免疫共沉淀实验原理及详细步骤
免疫共沉淀实验原理及详细步骤免疫共沉淀是一种常用的实验方法，用于确定蛋白质与其他分子（例如核酸，蛋白质和脂类等）之间的相互作用关系。
该方法利用抗体与目标蛋白结合的特异性，将其与蛋白质一起纯化或检测。
下面将详细介绍免疫共沉淀的实验原理及步骤。
实验原理：在免疫共沉淀实验中，首先需要利用对目标蛋白高度特异性的抗体经抗原抵结的方式将目标蛋白与抗体结合。
然后将这种特异性抗体抵结的蛋白（复合体）与抗体相结合的固相支架接触，利用固相支架上特异抗体识别结合复合体，并通过洗脱和沉淀步骤将目标蛋白纯化或检测。
实验步骤：1.目标蛋白和抗原抵结：首先需要纯化目标蛋白或从合适的细胞系或动物模型中提取目标蛋白。
将目标蛋白与对其高度特异性的抗体一起孵育，使抗体能够特异性地与目标蛋白结合。
2.制备固相支架：在实验管中加入含有特异抗体的磁珠或琼脂糖等固相支架。
特异抗体可以是直接专一抗体，也可以是经过交联的间接专一抗体。
3.孵育复合体与固相支架：将目标蛋白与抗原抵结后的复合物加入到含有固相支架的实验管中，并进行充分的振荡孵育，使复合物能够与固相支架上的抗体结合。
4.洗脱非特异结合物质：通过连续洗涤步骤，将非特异性结合的杂质分子从固相支架上洗脱。
一般可以使用高盐浓度或化学物质（例如尿素或磺酸盐）来打破非特异结合以保留特异性结合复合体。
5.纯化或检测目标蛋白：通过洗脱步骤，从固相支架上将目标蛋白的特异性抵结复合物分离出来。
这些分离物可以用于进一步的纯化、分析或检测。
6.质谱分析或其他分析方法：将纯化后的目标蛋白样品进行质谱分析，确定目标蛋白自身和与其相互作用的分子。
总结：免疫共沉淀实验是一种利用抗体与目标蛋白之间的相互作用来纯化或检测蛋白质的方法。
这种方法可用于确定蛋白质与其他分子之间的相互作用关系，从而揭示生物学过程中的重要调节机制。
免疫共沉淀实验步骤繁多，需要注意实验操作的细节，但也是一个非常有价值和实用的技术。
免疫共沉淀 磁珠 板子
免疫共沉淀磁珠板子
免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于分离和富集特定蛋白质或蛋白质复合物。
在这个过程中，磁珠（magnetic beads）通常被用作固相载体，它们具有磁性并且表面
上可以修饰抗体或其他亲和配体。
板子可能指的是用于悬浮磁珠的
反应管架，也有可能是用于分析的固相板。
在免疫共沉淀实验中，首先将特异性抗体固定在磁珠表面，然
后将这些抗体修饰的磁珠与待检测的蛋白质混合，使抗体与目标蛋
白发生特异性结合。
随后，利用磁场将磁珠与结合的蛋白质一起沉
淀下来，然后去除非特异性结合的蛋白质。
接着，通过洗涤步骤去
除杂质，并最终使用适当的缓冲液将目标蛋白质从磁珠上解离下来，以进行后续的分析。
使用磁珠进行免疫共沉淀具有许多优点，例如操作简便、高效、不易失去样品、可以自动化处理等。
同时，固相板也是在实验过程
中扮演着重要的角色，它可以用于分析免疫共沉淀后的样品，比如ELISA实验等。
总的来说，免疫共沉淀实验中的磁珠和板子都是至关重要的实
验工具，它们在分离、富集和分析蛋白质方面发挥着重要作用，为科研工作者提供了强大的实验手段。
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一、细胞裂解
1、转染后24-48 h收获细胞，用冷的PBS（4°C）洗细胞三次，最后一次吸干PBS；
2、加入适量（500μl）预冷的细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min；
3、用预冷的细胞刮将细胞从培养瓶上刮下，将裂解液收集到1.5mlEP管中，4°C、最大转速（14000rpm）离心30 min后取上清；
4、取少量（20μl）裂解液以备western blotting分析；
二、准备磁珠
5、将Dynabeads完全重悬；
6、吸取50μl（1.5mg）Dynabeads到一个EP管中；（准备两份，一份结合抗体，一份去除非特异性蛋白）
7、将EP管放在磁力架上，将Dynabeads从溶液中分离出来，吸去上清；
8、再用预冷的lysis buffer 500μl洗三次，每次都用磁力架将Dynabeads分离出来，最后将EP管从磁力架上取下来；
三、结合抗体
9、取10μl的Antibody（Ab），加入到准备好Dynabeads的EP管中；
10、4°C旋转、孵育5h；
11、将EP管放在磁力架上，把Dynabeads-Ab复合物从溶液中分离出来，吸去上清；
12、用冷的lysis buffer 1000μl洗三次，最后一次尽量吸尽上清，再加入25μl 的lysis buffer和0.2μl的10%叠氮化钠；
四、免疫共沉淀
13、在裂解好的细胞样品500μl（步骤3）中加入Dynabeads（步骤6）25μl中，4°C旋转2h（去除非特异性蛋白）；
14、将EP管放在磁力架上，收集上清；
15、将上清加入预处理的Dynabeads-Ab复合物中，轻轻重悬Dynabeads-Abs复合物；
16、4°C旋转、孵育2h，让Ag与Dynabeads-Abs复合物结合；
17、将EP管置于磁力架上，转移上清到一个新的EP管中，以备需要时进一步分析；
18、用1000μl的lysis buffer洗Dynabeads-Ab-Ag复合物三次，每次清洗后在磁力架上分离，移去上清，再温柔地重悬复合物；（Avoid co-elution of proteins bound to the tube wall）
四、洗脱目标蛋白
19、将EP管放在磁力架上，吸去上清；
20、加入20μl的2×SDS 上样缓冲液，轻轻重悬Dynabeads-Ab-Ag复合物；
21、50°C加热10min；
22、将EP管放在磁力架上，取上清作为样品，SDS-PAGE电泳。