免疫共沉淀中文使用说明书(Pierce26149)

Pierce® Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit（26149）

中文说明书

介绍：

Thermo 公司的Pierce®免疫共沉淀试剂盒，可通过将铆钉抗体固定在琼脂

糖支撑物上，从裂解液中或其他复杂混合物中，分离出天然蛋白复合物。Co-IP

是一种研究蛋白与蛋白相互作用通用的方法，该方法使用一种诱饵蛋白与抗原

进行免疫沉淀反应，然后可通过免疫共沉淀任何与诱饵蛋白具有相互作用的猎

物蛋白。传统的Co-IP方法使用蛋白A或G共同洗脱抗体的重链和轻链，这很

可能导致将相关的蛋白一起洗脱下来，掩盖一些重要的结果。Pierce®免疫共沉

淀试剂盒通过将共价结合抗体固定在一个胺类活性反应树脂上解决了这一问题。该试剂盒包含足够的用于蛋白结合和恢复的缓冲液，完成对照试验的高校离心

柱和收集管，这些产品进一步缩短了操作实验的时间。

重要产品信息：

略

Co-IP实验步骤：

A.抗体固定

注意：以下试验步骤是针对用无胺和其他载体蛋白稀释的10-75μg亲和纯

化抗体（参考重要产品信息一节）。根据实际使用比例参考这一协议步骤。参

考重要产品信息节表1中的建议抗体用量和树脂体积用量。

1.室温平衡胺连接耦合树脂（AminoLink®Plus Coupling Resin）和试剂；

2.为每个Co-IP反应准备2ml 1×Coupling Buffer（超纯水稀释20×Coupling Buffer）；

3.轻轻涡旋混匀装有AminoLink®Plus Coupling Resin的瓶子，使其处于悬浮状态。使用大口径（或剪掉一段枪头端），添加50μl树脂悬液到Pierce提供的离心柱中，将离心柱放入微量离心管中，1000g离心1min，弃滤液；

4.添加200μl 1×Coupling Buffer 清洗树脂2次，离心弃滤液；

5.将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱底部，去除剩余的液体，插上底塞；

6.准备10-75μg亲和纯化抗体用于结合蛋白，调整体积至200μl，使用足够的超纯水和20×Coupling Buffer来制备1×Coupling Buffer。例如：添加10μl 20×Coupling Buffer，180μl超纯水和10μl浓度为1μg/μl。可直接添加含有超纯水、20×Coupling Buffer、亲和纯化抗体的树脂在离心柱中。

7.在通风厨中，每200μl反应体系，添加3μl氰基硼氢化钠溶液；

注：氰基硼氢化钠属剧毒物质，操作时要小心并穿戴防护服。

8.拧紧离心柱上螺帽，室温涡旋孵育90-120min，确保浆体在孵育过程中处于悬浮状态；

9.握紧底塞，拧开并拿走螺帽，将离心柱置于收集管中离心，保存滤液以便验证抗体耦合；

10.打开螺帽，添加200μl 1×Coupling Buffer，离心弃滤液，重复此步骤1次；

11. 向离心柱中添加200μl Quenching Buffer，离心弃滤液；

12. 将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱底部，去除残留液体，插上底塞。在树脂上添加200μl Quenching Buffer；

13. 在通风厨中，添加3μl氰基硼氢化钠溶液，拧紧螺帽；轻轻摇动并孵育15min；

14.取出底塞，拧开螺帽，将离心柱置于一收集管中，离心弃滤液；

15.打开螺帽，采用200μl 1×Coupling Buffer洗脱树脂，离心。再次重复此步骤；

16.用150μl Wash Solution洗脱树脂6次，每次洗脱后离心；

17.不管是进行细胞裂解、Co-IP，还是储存树脂，都需要继续进行下列步骤；

18.用200μl 1×Coupling Buffer洗脱树脂2次，每次需离心；

19. 将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱，去除残留液体，并插入离心柱底部。添加200μl 1×Coupling Buffer，系上螺帽，将离心柱置于4℃保存。如果长期储存，需添加sodium azide（叠氮化钠）至终浓度为0.02%。

B. 哺乳动物细胞裂解

方案I：单层培养细胞的裂解

1.小心从细胞中弃掉培养基；

2.采用Modified Dulbecco’s PBS（改良型Dulbecco PBS缓冲液）清洗细胞1次；

3.向细胞中添加冰冷的IP Lysis/Wash Buffer（表2），冰上孵育5min，期

间进行周期性混匀。

4.转移溶解物于1个微量离心管中，13000g离心10min ，以便将细胞碎片

制成微球；

5.转移上层于1个新的离心管用于测定蛋白浓度或进一步的分析实验。

方案II：悬浮培养细胞的裂解

1.1000g 离心细胞悬液5min，收集细胞团，弃上层；

2.用PBS清洗细胞，使细胞团悬浮起来，1000g 离心5min收集细胞；

3. 向细胞团中添加冰冷的IP Lysis/Wash Buffer；每50mg湿的细胞团使用500μl IP Lysis/Wash Buffer（10：1 v/w）。如果使用大量的细胞，首先向细胞团中加入终体积为10%的IP Lysis/Wash Buffer，移液器上下吹打混匀混合物，再

向细胞悬液中加入剩余体积的IP Lysis/Wash Buffer；

4.冰上5min，孵育溶解产物，期间周期性摇荡；13000g离心10min去除细

胞残渣。转移上清于新的离心管中，用于蛋白质浓度测定或其他分析实验。

C. 使用对照组琼脂糖树脂预澄清裂解物

5.对于1mg的裂解物，添加80μl的对照组琼脂糖树脂（40μl的固定树脂）

悬浮液到离心柱中；