心肌组织匀浆的制备

心肌组织匀浆的制备

缺血30min，再灌注60min后停止主动脉灌流，取下心脏，迅速剪下缺血区组织约0.1g在冰冷生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸吸干，放入1.5ml的塑料离心管中，经液氮冷冻后置-70℃冰箱中保存。实验全部结束后，将所有标本取出，用移液管取预冷生理盐水(生理盐水的体积重量是组织块重量的9倍)，加入盛有组织的塑料离心管中，用眼科小剪尽快剪碎组织块。继用组织捣碎机10000-15000r/min，离心14min，将心脏制成10%心肌组织生理盐水匀浆，取0.5ml 上清液备用，测定SOD、MDA生化指标。测定方法按试剂盒说明进行。

2.7 心肌组织超氧化物岐化酶（superoxide dismudase, SOD）活力的测定

剪下左心室称重后，在冰冷的匀浆介质生理盐水中制成10%匀浆，先用双缩脲法进行蛋白定量，然后采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD的活力。SOD测定原理：黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系生成超氧阴离子自由基，然后将羟胺氧化成亚硝酸盐，显色以后呈现紫红色，在550 nm处有最大吸收峰，测定吸光度。当被测样品中含SOD时，通过抑制超氧阴离子自由基，使亚硝酸盐的生成减少，若测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD 活力。SOD活力的高低可间接反映机体清除氧自由基的能力。采用南京建成生物工程研究所的SOD检测试剂盒严格按试剂盒说明书操作，测得心肌中的SOD活力（U/mg prot）。脂质过氧化物中的MDA能与硫代巴比妥酸（TAB）发生缩合反应，生成物呈红色，在532nm处有最大吸收峰，测定被测样品的吸收光度值，根据吸光度值计算出MDA含量。采用南京建成生物工程研究所的MDA检测试剂盒，按试剂盒说明书进行操作，测得心肌中的MDA（nmol/mg prot）含量。

乳酸在LDH的催化作用下产生丙酮酸，丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，碱性溶液中呈棕红色，最大吸收峰在340nm处，测定吸光度值，求出此酶的活力。采用中生北控生物科技股份有限公司的LDH检测试剂盒进行测定。

实验中于各监测时间点，分别留取心脏灌流漏出液1.5ml，-70℃保存，以备心脏灌流漏出液酶学指标使用。将留存的灌流心脏漏出液在室温下自然融化，按试剂盒说明书进行操作，计算LDH活力（U/L）。

乳酸脱氢酶比色测定法（L P反应固定时间法）

一、原理以氧化型辅酶Ⅰ(NAD+ )作氢受体，乳酸脱氢酶催化乳酸脱氢生成丙酮酸，丙酮酸与2, 4—二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在碱性溶液中显棕红色。颜色深浅与丙酮酸浓度成正比，由此推算乳酸脱氢酶活性单位。

二、试剂盒组成

1．试剂A：底物缓冲液，12 ml, 4℃避光保存1年。

2．试剂B：11.3 mmol/L氧化型辅酶Ⅰ溶液，2 ml, –20℃保存，4℃可保存6周，

3．试剂C：1mmol/L 2, 4—二硝基苯肼溶液，10 ml, 4℃避光保存半年以上。4．丙酮酸钠标准品母液(5 μmol/ml)，0.5 ml, –20℃保存；5．终止试剂：

0.6 mol/L NaOH , 30 ml, 常温保存。

三、操作步骤1．取10 μl标准品或样本加入到微孔板中。2．底物缓冲液与氧化型辅酶Ⅰ溶液以5:1的体积比混合，取60 μl混合液加到各孔，充分混匀；37℃水浴15分钟。3．加入2, 4—二硝基苯肼溶液50 μl，与标准品或样本充分混合；37℃水浴15分钟。4．加入150 μl 终止试剂，充分混合。5．室温

放置3分钟后，440nm波长处测定。四、标准曲线的制作临用前将丙酮酸钠标准品母液用底物缓冲液稀释成2.5、2、1.5、1、0.5、0.25、0.125 μmol/ml 7 个浓度，稀释液4℃可保存一周。丙酮酸钠浓度与乳酸脱氢酶活力单位的对应关系见下表。丙酮酸钠浓度(μmol/ml) 0 0.125 0.25 0.5 1 1.5 2 2.5 相当于乳酸脱氢酶活力单位0 125 250 500 1000 1500 2000 2500 丙酮酸钠0 μmol/ml的孔只加10 μl底物缓冲液，以此孔作为空白孔调零，440nm波长处读取各孔吸光度，与其相应的酶活力单位作图，得出标准曲线。

五、样本处理一）体液处理血清用生理盐水作1：10稀释；脑脊液内乳酸脱氢酶活力较低，直接以原液测定即可；其他体液也需1：10稀释后测定。二）细胞处理细胞用1% Triton X-100裂解，取10 μl细胞裂解液用于测定；细胞培养基可直接用于测定。

六、单位定义每100m1血清中的LDH在37℃与底物作用15分钟，能生成一微摩尔丙酮酸者即为一个乳酸脱氢酶活力单位。以第四管为例，丙酮酸含量为0.005微摩尔，如稀释后的血清测定结果相当于第四管的光密度时，因稀释前的血清用量为0.001ml，换算成100ml时就相当于乳酸脱氢酶活力500单位／dl；如果血清未经稀释，测定结果相当于第四管光密度时，说明0.01ml血清在37℃与基质作用15分钟生成0.005微摩尔丙酮酸，换算成100ml血清就相当于产生了50微摩尔丙酮酸，乳酸脱氢酶活力单位为50U/dl, 即测得的酶活力单位除以稀释倍数10得实际的酶活力单位。

七、结果处理440nm波长处读取样本孔吸光度，根据标准曲线算出酶活力单位，即为测定的酶活力单位。一）体液作1：10稀释后测定的体液的实际酶活力单位即是测定的酶活力单位；未经稀释的体液的实际酶活力单位=测定的酶活力单位/10；二）细胞活力计算细胞活力用LDH释放率来表示，后者值越大，表示细胞活力越差，受损程度越严重。细胞LDH释放率（%）=细胞培养基中测定的酶活力单位/（细胞裂解液测定的酶活力单位+细胞培养基测定的酶活力单位）×100%

八、参考值人血清LDH：190~310U/dl

九、注意事项1．红细胞内乳酸脱氢酶活力较血清内约高100倍．故标本有轻微的溶血．测定的结果会比实际的结果高数倍。 2. 草酸盐可抑制乳酸脱氢酶活力，故不能用草酸盐抗凝血浆测定。3．测定结果超过2500U时，应将样本继续稀释后重新测定。4．该方法以乳酸盐和NAD+为底物，其优点是乳酸盐及NAD+ 底物液稳定，冰箱保存时可稳定半年以上，反应的线性范围较宽

【资料简介】

乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）试剂盒说明书

分光光度法50 管/24 样

测定意义：

LDH（EC 1.1.1.27）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的末端酶，

催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，伴随着NAD+/NADH 之间互变。

测定原理：

LDH 催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步与2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二