微生物标准操作流程

目录
生物安全柜操作规程及维护 (3)
实验室高压蒸气灭菌器操作程序 (6)
物体表面细菌监测 (8)
医护人员手指细菌监测 (9)
空气中细菌含量的监测 (10)
环境卫生学监测质控标准 (12)
使用中消毒剂与无菌物品保存液的质控程序 (13)
一次性医疗用品微生物监测 (14)
紫外线消毒质量控制程序 (15)
污水的细菌监测 (总大肠菌群) (16)
正确洗手的手法 (18)
生物安全柜操作规程及维护
1.目的：
为了满足生物安全操作的要求，并且达到在操作时保护操作人员的目的，使细菌操作达到无菌操作的要求，便于操作的标准化。

2.原理：
通过使用空气超高过滤器（ULPA）的过滤，使仪器内部的空气洁净度达到100级，使细菌的一般操作限制在一个相对密闭的环境中，不但保护操作人员，还可满足操作的标准化。

3.工作条件：
环境温度：18－30℃相对湿度：<80%
安装的环境必须达到一定的洁净度；远离人员通道及有潜在干扰气流的位置；柜后及两侧各留30cm的空隙，顶部30-35cm空隙。

环境必须有良好的通风设备。

4、操作步骤：
生物安全柜的设置已经设置完全，如果需要重新设置请参看HFsafe生物安全柜使用说明。

具体操作步骤为：
将电源插头插入准备好的固定插座，连通电源。

有系统管理员(即本室负责人)开启玻璃门门锁，并将总开关置于开位置“！”，此时系统开始上电。

检查显示及按钮的各项功能，具体见后附注（注意：UV灯的测试除外，开启UV灯时必须将前玻璃门关闭）。

当系统稳定后，对设备进行安全性检查。

（检查项目包括：工作室平均垂直风速；工作室内可操作区域洁净度达到100级；设备的密封有没有被破坏。

所有的安全检查项目中的洁净度建议由当地卫生防疫部门来进行尘埃粒子数、沉降菌和菌落数的检测，看是否符合其工作室的洁净度要求）。

如果安全性测试通过，系统已经可以使用，请在《使用记录》上写下相应的信息。

在使用时需要注意的是，操作必须在工作台板无孔区域进行，物品也必须放置于无孔区域。

操作者应先把手臂放进安全柜内大约1分钟，以使柜子适应并且让气流扫过手臂手臂移入移出柜内应保持前门气流的连续性，应缓缓移入移出，并且方向和前门垂直；为使跨越前门的动作量降低，在实验开始前应把所需的物品放入柜子；柜子在开始工作前以及完成后至少要运行5分钟是，使柜子净化，以便于污染空气从柜内排出。

实验操作方向应从清洁区到污染区，一般要求为左→右。

当工作完成后需要关机前，将试验使用的所有材料和其他物品从设备中取出。

关闭前玻璃门前，需要维持气流循环一段时间（时间长短视所操作材料的危险性而定）。

关闭风机，停止气流循环。

每日使用后维护(见后面维护中的第一二步)。

维护完成后，关闭电源开关。

锁住前玻璃门，并如实填写《使用记录》。

5、仪器的维护：
基本保养：
清洁：在通常的情况下，清洁只需要用少量家用或商用的碗碟清洗剂，将它溶于水后直接擦洗，就可将设备表面的污染擦掉。

请不要擦拭任何玻璃，以免产生摩擦。

在使用过程中每日或每周的清洁:
消毒（一般使用1000mg/L的次氯酸钠溶液）和清洁工作室
对操作面板进行消毒和清洗。

用柔性的清洁剂或玻璃专用清洁剂清洗箱体外表面和玻璃。

对照说明书对设备的各种功能进行检查。

将本次工作记录下来。

月清洗：
用清洁剂将所有外表面的尘埃清除。

对设备内部进行消毒处理。

对设备进行功能检验，并在通常使用时检查设备的安全。

将本次清洗记录下来。

每月必须对紫外灯进行照射强度检测。

每年维护：
对设备进行安全性全面的检查，对设备进行维护。

包括柜体防泄露、高效过滤器的完整性、人员保护能力、产品保护能力、下降气流流速、流入气流流速、负压、气流模式、警报和联锁等的检测。

一般安全检测由仪器公司进行。

检查前玻璃门驱动装置的松劲程度。

检查紫外灯管。

将本次维护记录下来。

每两年更换日光灯管。

故障的维护处理：
当故障发生时必须停止一切操作，尽量维持设备内部空气的循环过滤，将正在进行的试验材料和工具全部取出并妥善管理，然后通知有关部门前来维修。

每次仪器出现故障时必须填写故障登记表，注明故障情况及处理情况。

常见的故障，原因及其处理方法见下表：
6、注意事项：
只有负责管理本设备的人员才有权关闭风机。

只有经过培训和指导的人员才能操作本设备。

顶部通风口不能被任何东西覆盖以保证排气通畅。

当系统失效时会发出声讯号，此时不能继续操作，否则会导致材料的损失，污染和人身安全方面的危险。

如果发现过滤器失效，要更换过滤器时，必须由专业人员进行更换。

柜内溅出物的处理：在柜内如果出现危险生物材料溅出，应该不能
关闭风机继续运行，覆盖滤纸或吸水纸于溅出物表面，然后向滤纸上滴加消毒液（1000mg/L的次氯酸钠溶液）浸泡5分钟，用钳子钳取滤纸丢入感染性废物收集袋中，然后用浸泡了消毒液的干净抹布擦拭柜内表面。

生物安全柜内避免使用明火，因为使用明火会破坏柜内的气流方向。

也禁止使用易挥发易燃易爆物品，以免造成危险。

接种环可以使用微波炉或“电炉”，最好使用一次性接种环。

实验室高压蒸气灭菌器操作程序
1．目的：
培养基等的液体灭菌，溶解。

器具等的灭菌。

1.3废弃物的处理灭菌。

2．原理：
高压蒸气灭菌。

灭菌温度105℃-135℃，溶解温度60℃-100℃，保温温度45℃-60℃；压力兆帕
3．工作条件:
环境温度:5℃-35℃
背面距离墙10厘米以上,右侧距离墙5厘米以上。

需放置在无阳光直接照射及湿度不高,灰尘少的地方。

4.操作步骤：
放置排气储存桶
注意:不得在灭菌器附近放置或放入可燃性物质,爆炸
性物质,氧化性物质,易燃性物质,可燃性气体。

在排气容器孔中务必插入排气软管添密件,关紧盖罩,
接通电源开关
注意:安装专用电源连接插口,安装地线,可靠接地。

发生异常情况时立即停止运转,切断电源。

检修时要切断电源。

打开盖子
注入加热用水
注意: 需采用蒸馏水或自来水。

放入灭菌物品
注意: 不得将灭菌物品装入蒸气不能进入的容器和袋
子,否则无法灭菌; 装盛灭菌物品的容器不得密封。

不
要让灭菌物品堵塞和挤压灭菌器内的孔和温度传感
器。

仅对试管,烧瓶等容器本身灭菌时,开口要向下或
横放。

物品灭菌时，应同时放入监控指标。

用对热敏
感的染料标记的变色带子。

灭菌时，将变色带夹放在
试验包裹中, 以监视灭菌效果，
关闭盖子
选择过程(变更设定内容)(设定预定运行作业)
注意: 运行中要开启排水阀。

按下操作按钮
R1或b1 C1 D1
灭菌 . 保温灭菌.溶解器具灭菌
运行注意:运行中如有蒸气泄漏时，不要靠近安全阀排气口。

运行完毕, 打开盖子,取出灭菌物品
注意:不要被烫伤,脸不要靠近灭菌器。

切断电源开关
排放加热用水
物体表面细菌监测
1.目的规范物体表面采样及监测标准操作规程。

2.适用范围
医院感染监控重点科室，每月常规监测。

发生医院感染暴发流行。

3、职责医院感染管理专职人员或兼职人员应遵守本程序。

4.程序方法
监测对象：选择有代表性的可能污染表面
采样时间：选择消毒处理后，4小时内进行
采样面积：100cm2
25cm2细菌定量采样皿培养法：
①使用时将采样器去盖，在待测物品上直接接触10秒钟后加盖（采样皿为一样本面积不得少于10cm2）。

②将采样皿置35～37℃温箱培育18－24小时，直接细菌计数（细菌个数／cm2）和分离鉴定细菌。

棉拭子涂擦法：
对物体表面采样时，将内径为5×5 cm2的灭菌规格板放在被检物表
面，用浸有灭菌生理盐水的棉拭子，在规格板空心处涂抹5次（往返为一次）；移动规格板，按同样方法涂抹采样，连续采样4次（采样4次为一样本）剪掉或烧去手接触部分。

将棉拭子放入装有10亳升的灭菌生理盐水的采样管中，送实验室进行培养鉴定细菌和细菌计数。

门把手等小型物体则用棉拭子直接涂擦物体表面，以每件为单位计算，较大门把手等则按面积（cm2）计算。

5、结果判断
一、二类区域细菌总数≤5 CFU/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。

三类区域细菌总数≤10 CFU/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。

四类区域细菌总数≤15 CFU/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。

母婴同室、婴儿室、新生儿室及科病房的物体表面不得检出沙门菌为合格。

医护人员手指细菌监测
1.目的
规范医务人员手采样标准操作程序。

2.适用范围
手卫生监测。

3.职责
医院院感管理专职人员或兼职人员应遵守本程序。

4.程序
采样时间：在接触病人，人事医疗活动前进行
采样面积及方法：被检人五指并拢，将带有无菌生理盐水的棉拭子放在双手指曲面从指根到指端来回涂擦各2次（往返算一次）并随之转动采样拭子剪去手接触部分，将棉拭子放入10ml采样液试管内送检（每只手面积均为30 cm2）
结果计算：
手污染细菌菌落数（Cfu/cm2）＝平器上菌落数×稀释倍数
30
5结果判断
一、二类区域工作人员细菌总数≤5 CFU/cm2，并未检出金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及铜绿假单胞菌为消毒合格。

三类区域工作人员细菌总数≤10 CFU/cm2，并未检出金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及铜绿假单胞菌为消毒合格。

四类区域工作人员细菌总数≤15 CFU/cm2，并未检出金黄色葡萄球菌、
大肠埃希菌及铜绿假单胞菌为消毒合格。

母婴同室、婴儿室、新生儿室及儿科病房的工作人员手上，不得检出沙门菌、大肠埃希菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌为合格。

注意事项被检人洗手消毒后切勿擦干。

空气中细菌含量的监测
1.目的
正确进行空气细菌含量的监测。

2.适用范围
医院感染监控重点科室，每月常规监测。

发生医院感染暴发流行时。

3.职责医院感染管理专职人员或兼职人员应遵守本程序。

4.程序
采样时间：选择消毒处理后与进行医疗活动期间采样。

采样高度：与地面垂直高度为80－150cm。

布点方法：室内面积≤30㎡设三点，≥30㎡设五点
采样方法：
平皿暴露法：将9cm直径的玻璃普通营养琼脂或血琼脂平血，放在室内3个或5个采样点上，将平皿盖打开，叩放于平皿旁，暴露5分钟，盖好。

置37℃温箱培养24－48小时观察结果，并计数3个或5个平器中的平均菌落数。

细菌数cfu／m3=N 100 × 5 ×1000＝50000 N
A T 10 AT
A＝平皿面积（cm2） N＝平均菌落数 T＝平皿暴露于空气中的时间（分）
5.结果判定
一类区域细菌总数≤10 CFU/m3（或 CFU/平板），并未检出金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌为消毒合格。

二类区域细菌总数≤200 CFU/m3（或4 CFU/平板），并未检出金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌为消毒合格。

三类区域细菌总数≤500 CFU/m3（或10 CFU/平板），并未检出金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌为消毒合格。

一类区域包括层流洁净手术室和层流洁净病房。

二类区域包括普通手术室、产房、婴儿室、早产儿室、普通保护性隔离室、供应室洁净区、烧伤病房、重症监护病房。

三类区域包括儿科病房、妇产科检查室、注射室、换药室、治疗室、供应室清洁区、急诊室、化验室、各类普通病房和房间。

6.注意事项
采样前，关好门、窗、在无人走动的情况下，静止10分钟进行采样。

平皿应新鲜透亮，当天领取使用。

如为空气采样机采样，按操作说明进行。

环境卫生学监测质控标准
1.目的
规范环境卫生学监测质控标准程序，确保员工和环境的安全。

2.范围
医院感染监控重点科室，每月常规监测。

发生医院感染暴发流行。

3.职责
医院感染管理专职人员或兼职人员应遵守本程序。

4.程序
环境空气、物体表面、医护人员手质控标准
环境类
别
范围标准
空气（cfu/cm2）物体表面（cfu/
cm2）
医护人员手
（cfu/ cm2）
Ⅰ类层流洁净手术
室、层流洁净病
≤10≤5≤5
房
Ⅱ类普通手术室、产
房、新生儿室
（母婴同室、病
房）、早产儿室、
≤200≤5≤5
普通保护性隔
离室、供应室、
无菌区
Ⅲ类儿科病房、妇产
科检查室、注射
室、换药室、治
≤500≤15≤5疗室、化验室、
各类普通病房
和房间
Ⅳ类传染病房及房
－≤15≤15间
外科、妇科不能检出绿脓杆菌、婴儿室、新生儿病房、产房不能检出沙门氏菌属。

使用中消毒剂与无菌物品保存液的质控程序
1. 目的
规范消毒灭菌程序，保证实验室内的环境安全。

2. 范围
适用于微生物实验室内环境日常消毒的操作。

3. 职责
实验室负责人及检验人员、消毒人员执行本程序。

4. 程序
监测方法：
细菌含量监测
①采样时间：取更换前，使用中的消毒剂和无菌物品保存液；
②采样量及方法；
将被检测消毒液混匀后，用无菌吸管取样1ml加至9ml含中和剂的肉汤培养基内，取其混合液各，接种于两个无菌平器上，一个置36℃±1℃培养3天，另一个置28℃培养7天，观察计数和鉴定。

③采样结果计算：
每亳升微生物数（cfu/ml）＝两种培养温度下平器上的菌落数×稀释的倍数
×2
浓度的检测：
即用G－I消毒剂浓度试纸测定法。

质控方法：
使用中消毒液细菌菌落总数应＜100cfu/ml，不得检出致病菌。

无菌器械保存液必须无菌生长。

一次性医疗用品微生物监测
1.目的
规范一次性医疗用品微生物监测的程序，减少环境污染，保护人员安全。

2.范围
微生物实验室内的一次性医疗用品。

3.职责
实验室所有工作人员执行此程序。

4.程序
医疗用品采样检查方法
采样时间：在消毒或无菌处理后存放有效期内采样；
采样量和采样方法：
（1）破坏性方法取样：如输液．输血器．注射针等，剪碎取一定量于培养基内培养，35℃, 48小时培养。

（2）不能用破坏性方法取样：可用浸有无菌生理盐水采样棉拭子在被检物体表面涂抹采样，被采表面＜100cm2，取全部；被采表面≥100cm2；取100cm2于培养基里35℃,48小时培养。

质控标准：
进入人体无菌组织，器官或接触破损皮肤粘膜的医疗用品必须无菌。

接触粘膜的医疗用品，细菌落数应≤20cfu/g或100cm2，不得检出致病菌。

（溶血性链球菌），沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌等。

4.2.3接触皮肤的医疗用品，细菌菌落总数≤20cfu/g或cm2，不得检出
致病菌。

紫外线消毒质量控制程序
1. 目的
规范紫外线消毒灭菌程序，保证微生物实验室内的环境安全。

2. 范围
适用于微生物实验室内环境日常消毒的操作。

3. 职责
实验室负责人及检验人员、消毒人员执行本程序。

4. 程序
紫外线监测主要是测定照射强度。

方法：可用紫外线强度计离紫外线灯管正中垂直1米处，开灯照射5分钟后，读出强度计指示表中数据。

标准和注意事项：
①新管（30W）不低于100uw/cm2,使用中的旧管在 70uw/cm2以上才符合要求，低于70uw/cm2者必须更换。

每半年要用紫外线强度计监测1次，每年强度计可校正一次。

②每10平方米面积室内必须安装30W灯管一支，每年用紫外线强度
计检测二次。

在使用过程中，应保持紫外线光源表面的清洁。

用紫外线消毒室内空气时，房间内应保持清洁干燥。

减少尘埃和水雾。

温度低于20℃或高于40℃，相对湿度大于50％时应延长照射时间，且应达到足够的剂量。

在有人工作环境中，不能使用紫外线光源直接照射到人，臭氧的浓度不得超过。

污水的细菌监测 (总大肠菌群)
1.目的
规范微生物实验室污水的处理程序，减少污水对人员及环境的危害。

2.范围
微生物实验室内的污水。

3.职责
实验室所有人员执行此程序。

4.程序
采样方法
用采水器或其它灭菌容器采取污水1000ml，放入灭菌瓶内，如果是经加氯处理的污水，需加%硫代硫酸钠5ml中和余下的氯。

检验方法
总大肠菌群系指一群氯及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌在37℃培养24小时，能使乳糖发酵产酸产气，总大肠菌群系指每升污水中，所含的总大肠菌群的数目。

初发酵试验
以无菌手续，于5管各盛有3倍浓缩乳糖单糖蛋白胨培养液5ml 的发酵管内，各接种污水样10ml；于5管各盛有单料乳糖蛋白胨培养液约10ml的发酵管内，各接种污水样1ml，再于5管各盛有单料乳糖蛋白胨培养液约10ml的发酵管内，各接种1：10稀释的污水样1ml相当于原污水样 ,将此15管已接种的发酵管置于37℃恒温箱内，培养24小时。

平板分离
经培养24小时后，产酸产气及只产酸不产气的发酵管，分别接种了伊红美兰培养基或品红亚硫酸钠培养基上，置37℃恒温箱培养18－24小时，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分，进行涂片、革兰氏染色、镜检。

伊红美兰培养基上的菌落
（1）深紫黑色，具有金属光泽的菌落；
（2）紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；
（3）淡紫红色，中心色较深的菌落。

品红亚硫酸钠培养基上的菌落：
（1）紫红色，具有金属光泽的菌落；
（2）深红色，不带或略带金属光泽的菌落；
（3）淡红色，中心色较深的菌落。

复发酵试验
上述涂片、镜检的菌落，如为革兰氏阴性无芽胞杆菌，则挑取上述典型菌落1－3个接种于一单管乳糖发酵管内，然后置于37℃恒温箱内，培养24小时，产酸产气者（包括小量产气）即证实有大肠菌群存在。

根据证实有大肠菌群存大的阳性管数，查对最可能数（总大肠菌群近似数检索表），报告每斤污水中的大肠菌群数。

此表中所列数值系指100ml水样中的细菌数。

因此，需将表中的数值再乘以10所得结果为每1000ml水中的细菌数。

正常值：每升污染含大肠菌群数＜500CFU。

正确洗手的手法
1.目的
规范正确洗手方法的管理程序，保护医务人员人身健康安全。

2.范围
实验室内所有工作人员。

3.职责
实验室内所有工作人员执行此程序。

4.程序
选用质量好的洗手液，保护手及皮肤。

用质量好的消毒液。

选用合适的洗手设备。

正确洗手步骤：
取下饰物及手表，用自来水淋湿双手。

取无菌皂液或洁净肥皂于手上。

用力擦搓掌心、指缝、手背、手指关节、指腹、指尖、拇指10－15
分钟。

流动水冲洗
用擦手纸巾包住龙头将水关闭，或用肘、脚等关闭水龙头。

用擦手巾擦干双手或用烘器烘干。

5.洗手后，细菌菌落数应符合手质控标准。