产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离

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枯草芽孢杆菌的发现和应用研究进展

枯草芽孢杆菌的发现和应用研究进展枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阳性细菌，具有许多生物学特性，因此在科学研究和工业应用中备受关注。

以下将针对枯草芽孢杆菌的发现和应用进行综述。

首先，简要介绍枯草芽孢杆菌的发现。

枯草芽孢杆菌最早是由德国科学家C. Cohn于1872年从稻草中分离和鉴定出来。

随后，人们对其生物学特性和基因组结构进行了大量研究，发现它具有较小的基因组大小、高变异性以及丰富的代谢途径，这些特性为其广泛应用奠定了基础。

其次，探讨枯草芽孢杆菌的应用研究进展。

枯草芽孢杆菌在农业、医学、食品工业等领域都有广泛的应用价值。

在农业领域，枯草芽孢杆菌被广泛应用于植物生长调节、抗病虫害和土壤改良等方面。

它能够分解植物残渣，提高土壤有机质含量和养分供给，并产生一系列生物活性物质，如植物生长素和抗生素，从而促进植物的生长发育和抵抗病虫害。

此外，枯草芽孢杆菌还可以抑制一些植物病原真菌和细菌的生长，起到生物防治的作用。

在医学领域，枯草芽孢杆菌具有一定抗菌、抗肿瘤和免疫调节的功能。

研究表明，枯草芽孢杆菌能够产生抗菌物质，对一些常见病原菌具有较强的抑制作用，包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。

另外，枯草芽孢杆菌菌株还能够产生一些抗肿瘤物质，如秋水仙素，对于某些肿瘤细胞具有抑制作用。

此外，枯草芽孢杆菌还能够刺激人体免疫系统，增加免疫细胞的活性，并促进巨噬细胞的活化。

在食品工业中，枯草芽孢杆菌具有辅助酿造、发酵和防止食品腐败等功能。

枯草芽孢杆菌可以产生多种酶，如淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等，可用于酿造业的辅助加工，提高酿酒的产率和质量。

此外，枯草芽孢杆菌还能够发酵产生乳酸、醋酸等有益物质，用于食品添加剂和调味品的生产。

同时，枯草芽孢杆菌也可以抑制一些食品腐败菌的生长，延长食品的保质期。

除了上述应用领域外，枯草芽孢杆菌还在环境治理、生物能源等方面有一定的研究和应用价值。

例如，枯草芽孢杆菌可以降解废弃物中的有机物，减少环境污染；它还能够利用废弃物中的纤维素和淀粉等生物质资源，生产生物能源，如乙醇和氢气等。

高淀粉酶蛋白酶活力枯草芽孢杆菌的选育及酶基因阳性克隆的筛选的开题报告

高淀粉酶蛋白酶活力枯草芽孢杆菌的选育及酶基因阳性克隆的筛选的开题报告一、研究背景其中淀粉分解酶和蛋白酶作为生物体内两种最主要的催化能力已经广泛应用于食品、工业、生物医学等多个领域。

目前，大多数市场上的淀粉分解酶和蛋白酶仍来自于传统的菌种发酵或者经过化学合成生产，这种生产方式存在成本高、污染大、产量低等缺点。

为了解决这些问题，近年来人们开始利用生物技术研究新型酶制品，以提高酶的生产效率和环境友好型。

二、研究目的本研究旨在筛选一株高淀粉酶和蛋白酶活力的枯草芽孢杆菌，并通过PCR技术开展酶基因阳性克隆的筛选，为高效生产淀粉酶和蛋白酶的工业应用提供理论和实际参考。

三、研究内容1. 选育高淀粉酶和蛋白酶活力的枯草芽孢杆菌2. 筛选酶基因阳性克隆3. 测定酶活力及酶的生产量四、研究方法1. 枯草芽孢杆菌的分离和筛选：通过样品的培养和筛选、形态学和存活力的初步鉴定，将具有优良代谢特性表现的菌株选出。

2. 克隆酶基因：利用DNA提取和PCR技术进行酶基因的扩增，获得酶基因的亚克隆，并进行酶基因阳性克隆的筛选。

3. 测定酶活力及酶的生产量：将选育出的枯草芽孢杆菌进行发酵培养，测定其淀粉酶和蛋白酶的活力和生产量。

五、研究意义本研究能够选育出一株高活性的淀粉酶和蛋白酶生产菌株，为高效、环保、经济地生产淀粉酶和蛋白酶的工业化应用提供理论和实际参考。

同时，对于推动生物制药产业、食品工业的升级和发展具有重要的推动作用。

六、研究计划1. 选育高淀粉酶和蛋白酶活力的枯草芽孢杆菌（2个月）2. 筛选酶基因阳性克隆（3个月）3. 测定酶活力及酶的生产量（2个月）4. 数据统计和分析（1个月）五、参考文献1. 郑凌峰, 林天. 枯草芽孢杆菌的生物学特性及酶应用[J]. 南方农业学报, 2014, 45(4):410-417.2. Che J, Roy I. Bio-based production of enzymes and enzymes used in bio-based production[J]. Biotechnology Advances, 2010, 28(6):791-804.。

枯草芽孢杆菌及其分离培养方法

1. 枯草芽孢杆菌及其分离培养方法1.1 枯草芽孢杆菌简介枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阳性细菌。

它是一种常见的土壤菌，同时也存在于水体、空气和植物表面等生物体的附属物中。

枯草芽孢杆菌具有良好的产生芽孢和分泌代谢产物的能力，因此在农业、医药和食品工业等领域有着广泛的应用前景。

1.2 枯草芽孢杆菌的分离培养方法枯草芽孢杆菌的分离培养是研究其生理特性和应用价值的基础工作之一。

下面将介绍常用的枯草芽孢杆菌分离培养方法。

1.2.1 选择性培养基为了选择枯草芽孢杆菌并抑制其他微生物的生长，常采用含有适当抑菌剂的选择性培养基。

例如，常用的选择性培养基有Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin（MYP）和Bacillus Cereus Agar（BCA）等。

1.2.2 样品采集从土壤、水体或其他可能存在枯草芽孢杆菌的环境中采集样品。

样品的选择要考虑到可能存在的生物体和环境因素对细菌分布的影响。

1.2.3 样品处理将采集到的样品进行处理，常见的处理方法包括稀释、过滤、震荡等。

通过处理可以去除一部分不相关的微生物，并将枯草芽孢杆菌分散在培养基中。

1.2.4 培养基接种将处理后的样品接种在选择性培养基上，用无菌的铁环或吸管进行操作。

将接种好的培养基置于适宜的温度和湿度条件下进行培养。

1.2.5 培养条件调控根据枯草芽孢杆菌的生长特性，可以调控培养条件来促进其生长和芽孢形成。

例如，增加培养基中的营养物质浓度、调节培养温度和pH值等。

1.2.6 分离纯培养经过一段时间的培养后，可以观察到菌落的形成。

根据形态学特征，选择单个菌落划线分离，并进行纯培养。

通过多次传代培养，可以得到纯种的枯草芽孢杆菌菌株。

2. 枯草芽孢杆菌的应用价值2.1 农业领域枯草芽孢杆菌具有多种促进植物生长的特性，可以增强植物的抗逆性和抗病能力，提高作物产量和品质。

此外，枯草芽孢杆菌还可以降解农药和有机污染物，对环境具有修复作用。

枯草芽孢杆菌的培养、筛选分离和鉴别

03
枯草芽孢杆菌的筛选分离
枯草芽孢杆菌的分离纯化
制样品稀释液
取得土壤样g，放入盛 1 有99ml的无菌水锥形
瓶中，充分振荡。
培养
用移液枪将各个浓度梯度的一 3 定量稀释液接种到开始时制作好的培养基上，用无菌刮铲涂匀。37℃下倒置培养24小时。
加热筛选能形成芽孢的细菌
在超净工作台中，将装有锥形瓶 2 的菌悬液加塞、包扎、摇匀后放
3
高压灭菌：将分装包扎的培养基放入高压蒸汽灭菌锅中进行高压蒸汽霉菌，用0.075MPa灭菌30分钟。（使用高压蒸汽灭菌锅要注意放完冷气。灭菌结束后等到气压降到“0”时才能打开放气阀。）
培养基制备
2
精确称取蔗糖30g、磷酸二氢钾4.5g、硫酸铵2.5g、蛋白胨10g、碳酸钙 2g、酵母膏5g和琼脂20g，然后在 1000ml水中充分溶解。
道中的游离氧，造成肠道
2
低氧，促进有益厌氧菌生
长，间接抑制其它致病菌
生长。
4.
枯草芽孢杆菌菌体自身合成α -
4
淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤
维素酶等酶类，在消化道中与
动物体(人体)内的消化酶类一
同发挥作用。
3.
3
刺激动物(人体)免疫器官
的生长发育，激活T、B
淋巴细胞，提高免疫球
蛋白和抗体水平，增强
细胞免疫和体液免疫功
能，提高群体免疫力。
生物科学进入人体，能100%到达大小肠，抑
制致病菌，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长。提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力。合成α -淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体(人体)内的消化酶类一同发挥作用。

1株边鸡源产蛋白酶枯草芽孢杆菌的分离鉴定与生物学特性研究

1株边鸡源产蛋白酶枯草芽孢杆菌的分离鉴定与生物学特性研
究
孙丽萍;胡馨元;钮慧晶;王琴;裴彩霞;李毅;夏呈强
【期刊名称】《现代畜牧科技》
【年(卷),期】2024()2
【摘要】该试验旨在筛选具有高产蛋白酶能力的益生芽孢杆菌,扩大微生态制剂候选菌株资源。

以边鸡直肠内容物为分离来源,经脱脂奶粉平板初筛获得16株产蛋白酶菌株,液体发酵复筛后,选取1株蛋白酶活力高达119.7 U/mL的芽孢杆菌FRE76进行后续研究。

通过16S rRNA基因测序与进化树分析,并结合形态学与生理生化鉴定,判定该菌株为枯草芽孢杆菌。

病原菌抑制试验表明,该菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用。

耐酸和耐胆盐检测发现,在pH值3.0和4.0时该菌株存活率均为50%以上,在胆盐浓度为0.1%和0.3%时菌株存活率均能达到60%以上。

该试验筛选获得的枯草芽孢杆菌FRE76,具有优良的蛋白酶生产性能、较好的致病菌抑制能力和较强的抗逆性,是一株潜在的益生菌菌株。

【总页数】6页(P33-38)
【作者】孙丽萍;胡馨元;钮慧晶;王琴;裴彩霞;李毅;夏呈强
【作者单位】山西农业大学动物科学学院;山西农业大学生命科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】S831.5
【相关文献】
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3.一株虹鳟源枯草芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性研究
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5.藏羊源枯草芽孢杆菌的分离鉴定与生物学特性
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枯草芽孢杆菌实验报告

微生物技术综合实验年级：13级生物工程（专升本）班级：学号：姓名：徐红贞指导老师：刘凤霞教授日期：二零一三十月五号目录1实验目的及原理 (1)1.1实验目的 (1)1.2实验原理 (1)2实验材料 (1)2.1实验仪器 (1)2.2实验试剂 (1)2.3培养基 (2)2.3.1 生长培养基 (2)2.3.2鉴定培养基 (2)2.3.3摇瓶培养基 (2)3试验方法 (2)3.1仪器的准备 (2)3.2培养基的配置 (2)3.3初步筛选及鉴定 (2)3.3.1采集土样 (3)3.3.2富集培养 (3)3.3.3稀释分离、纯化 (3)3.3.4初筛 (3)3.4复筛及鉴定 (4)3.4.1革兰染色 (4)3.5酶活力的测定 (4)3.5.1摇瓶培养 (4)3.5.2酶液稀释 (4)3.5.3酶液测定 (4)4结果分析 (5)4.1平板涂布分离 (5)4.2平板划线分离 (5)4.3初筛 (5)4.4复筛 (5)4.5摇瓶培养 (6)4.6酶活力测定 (6)5参考资料 (7)6附录 (8)微生物上游技术综合实验枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定1.实验目的及原理1.1实验目的（1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。

（2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。

（3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。

（4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。

（5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。

1.2实验原理选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。

将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。

一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件(

一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。

采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。

通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。

在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。

关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a highprotease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of protein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 U/mL.Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition*基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2012B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201307），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201203）。

枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法

枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，具有重要的应用价值，被广泛应用于农业生产中的抗病、增产、改善土壤等方面。

因此，对枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法进行研究具有重要意义。

以下将介绍枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法。

一、枯草芽孢杆菌分离方法：1. 样品采集：根据研究需要，选择合适的样品，如土壤、植物组织、水等。

采集样品时要注意避免外源性污染，尽量避免使用过多的抗生素。

2. 样品处理：将采集到的样品进行处理，如土壤样品需要经过悬浮液稀释法进行样品制备，植物组织需要进行消毒处理等。

3. 分离培养基选择：根据枯草芽孢杆菌的生长特性，选择合适的分离培养基。

通常可以选用液体培养基（如TSA、LB培养基）或固体培养基（如TSA、PDA培养基）。

固体培养基还可以添加适当的抑菌剂来抑制其他细菌的生长。

4. 分离培养：将样品制备好后，均匀涂布在选择的培养基上，然后进行培养。

液体培养基需要在适当的温度和速度下进行摇床培养，固体培养基需要静置培养。

培养时间一般为24-48小时。

5. 子培养：在培养基上出现孤立的菌落后，用离心管吸取菌落，再划线接种到新的培养基上，进行连续传代培养。

一般选择形态特征明显、菌落形状规则的菌落进行子培养。

6. 纯化：通过连续传代培养，最终获得纯种的枯草芽孢杆菌。

纯化的细菌可以通过形态观察、生理生化特性检测等方法进行初步鉴定。

二、枯草芽孢杆菌鉴定方法：1. 形态观察：观察菌落形态、色素、菌体形态等。

枯草芽孢杆菌的菌落通常呈乳白色或灰白色，形状为圆形或不规则形。

2. 胞内酶活性检测：通过检测枯草芽孢杆菌的胞内酶活性来鉴定，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。

常用方法为利用不同培养基的酶基质进行相关酶活性检测。

3. 生理生化特性检测：包括对枯草芽孢杆菌的耐温、耐酸碱性、氧化还原反应等生理生化特性的检测。

4. 分子生物学鉴定方法：利用分子生物学方法，如PCR、16S rRNA基因测序等来鉴定枯草芽孢杆菌。

枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定

枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定一、目的：掌握芽孢杆菌属常见种的分离，鉴定方法和技术。

将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。

二、原理：芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性。

，因而得到芽孢菌属，经过进一步分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。

三、材料和器皿：显微镜、培养皿（12个）、试管（12个）、三角瓶（5个）、烧杯、移液管（）、涂布棒（6个）、载玻片、接种环、接种针、试管架、灭菌锅、培养箱培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、v.p.实验培养基、肉汤琼脂培养基孔雀绿溶液、番红复染液、NaOH溶液、草酸铵溶液、碘液、乙醇四、操作步骤菌种的分离和纯化（1）土壤的采集：取土壤表层5~10厘米下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋中带回实验室分离。

（2）平板的制备：融化三角瓶中的牛肉膏蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒入6个平板上。

（3）稀释分离法：秤取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15分钟，而后静止5分钟。

吸取上层液0.5ml加入到含有4.5ml的无菌水的试管中，制成1:100浓度的悬液，然后分别吸取10-2和10-3土壤悬浊液个0.1ml滴加到上述牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每种稀释2皿，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于37℃恒温培养1~2天。

（4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取2个单菌落中部分菌落，然后在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化，经菌落特征的观察和镜检，确定是否是芽孢杆菌纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，置37℃培养1~2天备用。

菌种的鉴定1、形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等）（1）单个菌种的形态（2）菌种形态的观察2.革兰氏染色3.芽孢染色4.菌体大小测验5.枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定一、淀粉水解一、原理许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将淀粉培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。

蛋白酶产生菌细菌的分离与鉴定

蛋白酶产生菌细菌的分离与优化一、研究背景及进展蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。

皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。

蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。

临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。

加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。

二、实验方案1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株B1 分离自污水河的土壤；B9 为B1 物理诱变后所得的菌株。

1.1.2 药品弹性蛋白、刚果红弹性蛋白 Sigma 公司产品。

1.2 培养基1.2.1 细菌富集培养基(% W/V)蛋白胨1.0，酵母膏0.5，NaCl 1.0，pH7.0，121℃灭菌20min。

1.2.2 初筛培养基(% W/V)弹性蛋白0.80，葡萄糖0.10，酵母膏0.10，K2HPO4 0.10，KH2PO4 0.05，MgSO4·7H2O 0.01，pH7.0，115℃灭菌30min。

1.2.3 发酵培养基(% W/V)干酪素3.00，葡萄糖4.00，玉米提取液0.1，K2HPO4，0.20，MgSO4·7H2O 0.01，pH7.0，11℃灭菌30min。

1.3 胞外弹性蛋白酶产生菌的筛选方法1.3.1 细菌富集培养称取土样1 g ，加入细菌富集培养基中，送摇床培养，150r/min，37℃培养48h。

同时做两个平行实验。

1.3.2 分离将富集土壤悬液按每级稀释10 倍的次序得到10－ 3、10 － 4、10 － 5 的系列稀释液，再依次分别从各稀释度试管中各吸取0.2ml 稀释液，加到相应的培养皿内，用涂棒涂匀。

每个稀释梯度做两个平行试验，3 7 ℃培养箱倒置培养48h。

蛋白酶高产菌株的筛选鉴定与酶学特性研究

蛋白酶高产菌株的筛选鉴定与酶学特性研究赵晓艳;曾志驰;穆丽丽;邓悦;王飞【摘要】以酪蛋白水解圈为筛选标记，在以酪蛋白为唯一氮源的平板上，从土壤中分离筛选到3株高产蛋白酶的菌株，经形态学鉴定和16S rRNA分析，将其分别鉴定为Bacillus sp．G1、Bacillus sp．G2、Stenotrophomonas sp．V1。

将这3株菌株的发酵液通过硫酸铵分级沉淀初步纯化后，其比酶活分别为22．21、19．10和16．03 U／mg。

菌株Bacillus sp．G1和Ba-cillus sp．G2所产蛋白酶的最适反应温度和最适反应pH值均为40℃和7．0；菌株Stenotrophomonas sp．V1所产蛋白酶的最适反应温度为70℃，最适酶反应pH值为7．5。

%Three bacteria strains producing protease were screened and isolated from soil by observation of clearing zones on casein agar plates, based on phenotypic and 16S rRNA gene phylogenetic analysis, G1, G2 and V1 were preliminary classed and named as Bacillus sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1.Bacill us sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1 were all aerobic strains.The proteases from Bacillus sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1 were purified by the methods of ammonium sulfate precipitation, the specific activities of three proteases were up to 22.21 U/mg, 19.10 U/mg and 16.03 U/mg, respectively.The enzymes from Bacillus sp.G1 and G2 were optimally active at 40℃and in 20 mmol/L phosphate buffered saline buffer( PBS, pH 7.0) , and the alkaline protease from Stenotrophomonas sp.V1 was optimally active at 70℃and in 20 mmol/L PBS buffer ( pH 7.5) .【期刊名称】《江西农业学报》【年(卷),期】2016(028)004【总页数】7页(P32-38)【关键词】蛋白酶;筛选;鉴定;酶学特性;Bacillus sp.G1;Bacillussp.G2;Stenotrophomonas sp.V1【作者】赵晓艳;曾志驰;穆丽丽;邓悦;王飞【作者单位】江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045【正文语种】中文【中图分类】TQ925.2蛋白酶(Protease, EC 3.4)属于水解酶类,是最重要的三大工业用酶之一,销售额约占全球酶制剂市场的60%[1],被广泛应用于食品、酿造、医药、纺织、皮革、日用化学、洗涤剂、饲料以及水产加工等多个行业,在我国国民经济的发展中起着重要的作用[2]。

枯草芽孢杆菌的分离

枯草芽孢杆菌的分离，纯化和培养摘要：枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。

单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。

无荚膜，周生鞭毛，能运动。

革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

需氧菌。

可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。

广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

并且耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60°C高温，在120°C温度下能存活20分钟；耐酸碱，但是不耐低温,在-4和-80度冰箱中会很快死亡。

关键词：枯草芽孢杆菌的培养·枯草芽孢杆菌的分离·枯草芽孢杆菌的纯化前言:枯草芽孢杆菌在饲料中及生物肥发酵或发酵床制作中应用较为广泛，也可用做市政和工业污水处理，工业循环水处理，腐化槽、化粪池等处理，畜牧养殖动物废料、臭味处理，粪便处理系统，垃圾、粪坑、粪池等处理。

畜牧、家禽、特种动物及宠物养殖，水产养殖。

还可以与多种菌种混配，是一种多功能的微生物。

枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。

枯草芽孢杆菌耐酸在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击，是可直达大小肠的活菌。

以孢子状态进入消化道后，迅速由休眠状态复活，在短期内繁殖成高含菌量的优势种群，消耗掉肠道内大量氧气，并能产生过氧化氢、细菌素，建立微生态平衡，促进有益厌氧微生物的繁殖，抑制有害细菌（大肠杆菌、沙门氏杆菌）的生长，从而预防腹泻、痢疾等肠胃道疾病。

在快速繁殖过程中，产生大量多种维生素、有机酸、氨基酸、蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，能降解植物性饲料中复杂的有机物，从而促进消化吸收，提高饲料利用率，防止动物消化不良。

一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件优化

一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件优化一、引言枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的芽孢形成细菌，广泛存在于土壤、水体、植物表面等环境中。

枯草芽孢杆菌具有良好的免疫调节、抗菌、促生长等生物学特性，被广泛应用于农业、食品、医药等领域。

针对不同用途的需求，分离鉴定枯草芽孢杆菌并优化其发酵条件，能够提高其生物活性和产量，为其在实际应用中发挥更好的效果。

二、枯草芽孢杆菌的分离鉴定1.样品采集与处理首先，从自然环境、农田土壤或其他植物表面等样品中采集含有枯草芽孢杆菌的样品。

将样品带回实验室后，进行分离和处理，避免混杂其他细菌或真菌。

2.菌株分离将处理后的样品进行稀释，接种于富含培养基中，利用传统分离方法（如平板分离法、稀释平板法等）进行分离。

通过观察不同菌落形态和颜色，筛选出枯草芽孢杆菌单菌株。

3.生理生化鉴定对分离到的枯草芽孢杆菌进行生理生化鉴定，包括形态学观察、生长特性、氧化还原反应、产酶活性等。

利用生化试剂盒进行相关检测，确定菌株的生物学特性。

4.分子鉴定通过16SrRNA序列分析或蛋白质质谱鉴定等分子生物学方法，确认所分离到的枯草芽孢杆菌的属种分类，并与数据库中的已知菌株进行比对验证。

5.枯草芽孢杆菌存取将鉴定完成的枯草芽孢杆菌单菌株保存在甘油保存流质中，存放在-80°C低温冰箱中备用。

1.发酵基质的选择选择适宜的发酵基质对枯草芽孢杆菌的生长和代谢具有重要影响。

常用的基质包括葡萄糖、大豆粉、玉米粉等，可以根据具体需求进行配比调整。

2.发酵菌种培养条件通过扩种培养，将枯草芽孢杆菌预培养至指数生长期，然后接种至发酵罐中，保持较高的菌液浓度，有利于产酶和生长。

3.发酵条件的控制在发酵过程中，通过控制温度、pH值、通气速率、发酵时间等因素，调节菌体生长、产酶效率和产物生成速率。

通常，较适宜的发酵条件为温度37°C-42°C，pH值6.0-8.0，通气速率1.0-2.0L/min。

枯草芽孢杆菌的分类与鉴定方法探析

枯草芽孢杆菌的分类与鉴定方法探析枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阳性细菌，属于芽孢杆菌属。

它具有广谱的抗菌活性和植物增长促进作用，被广泛应用于农业、生物防治等领域。

本文将探讨枯草芽孢杆菌的分类以及常用的鉴定方法。

一、枯草芽孢杆菌的分类枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性细菌，具有较大的细胞形态和芽孢结构特征。

根据研究发现，不同产地和环境中分离到的枯草芽孢杆菌菌株，其形态、生理生化指标和分子特征存在一定的差异。

目前，对枯草芽孢杆菌的分类主要依据16S rRNA基因序列分析以及生理生化特征。

根据16S rRNA基因序列分析，枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属（Bacillus），并可进一步细分为亚种（subspecies）和菌系（lineage）。

不同亚种和菌系的枯草芽孢杆菌在菌种间具有不同的生物学功能和代谢特征。

目前已报道的亚种主要有B. subtilis subsp. subtilis、B. subtilis subsp. spizizenii等，菌系主要有B. subtilis group、B. amyloliquefaciens group和B. licheniformis group等。

另外，枯草芽孢杆菌的分类也可以通过生理生化特征进行初步鉴定。

例如，枯草芽孢杆菌能在常规培养基上生长，并产生明亮的白色菌落；它是一种革兰氏阳性细菌，其细胞壁由肽聚糖和乙酰化肽聚糖构成；它具有耐盐、耐热、耐酸等特性，适应广泛的生存环境。

此外，枯草芽孢杆菌还能产生多种酶和代谢产物，如蛋白酶、纤维素酶、抗生素等。

二、枯草芽孢杆菌的鉴定方法为了准确鉴定枯草芽孢杆菌，科学家们发展了多种鉴定方法，包括传统的生理生化鉴定方法和分子生物学鉴定方法。

1. 传统的生理生化鉴定方法：该方法通过对枯草芽孢杆菌的生理生化特性进行检测和比较，辨别其差异和相似性，从而判断是否为枯草芽孢杆菌。

这些方法包括形态观察、生长特性、酶活性检测、代谢产物分析等。

工业微生物产生菌的分离筛选

尤其注意酵母浸膏加量，过多会刺激菌丝生长，而不利于孢子旳产生。
根据微生物对环境因子旳耐受范围具有可塑性旳特点，可经过连续富集培养旳措施分离降解高浓度污染物旳环境保护菌。例如：降解高浓度苯胺旳微生物分离；环己烷降解菌旳分离
2、控制培养条件：pH、温度及通气
富集培养基旳pH值调整到被分离微生物旳要求范围不但有利于本身生长，也可排除一部分不需要旳菌类。
搜集和筛选旳途径：
➢向菌种保藏机构索取有关旳菌株，从中筛选所需菌株
➢由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选
➢从某些发酵制品中分离目旳菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶旳产生菌等
本章内容
一、含微生物样品旳采集二、富集培养三、好氧微生物旳分离四、厌氧微生物旳分离
3）、生长圈法
一般用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素旳产生菌工具菌（指示菌）是某些相相应旳营养缺陷型菌株
将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺乏所需营养物旳平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需旳营养物，在该菌株旳菌落周围便会形成一种混浊旳生长圈
如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤旳琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈旳菌落即为嘌呤产生菌
筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素克制细菌，使霉菌在样品旳百分比提升，从中便于分离到所需旳菌株
三、好气微生物旳分离
经富集培养后来旳样品，目旳微生物得到增殖，占了优势，其他种类旳微生物在数量上相对降低，但并未死亡。所以，经过富集培养后旳样品，也需要进一步经过分离纯化，把最需要旳菌株直接从样品中分离出来。
➢ 移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势旳情况下进行。

土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选

土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选2021023123刘倩倩一、实验目的1.掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。

2.了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。

根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。

二、实验原理枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

需氧菌。

有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。

广泛分布在土壤及腐败的有机物中。

选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。

利用稀释涂布法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。

然后，进行初筛与纯化，利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。

再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。

三、实验材料（1）选择培养基本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。

配方：牛肉膏 5.0g蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 可溶性淀粉 10.0g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml调整pH至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。

（2）溶液或试剂牛肉膏 1.25g 蛋白胨 2.5g 氯化钠 1.25g 可溶性淀粉 2.5g 琼脂 5g碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克， 100毫升0.01NHCL。

（3）仪器或其他用品平板培养皿 10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。

角蛋白酶产生菌的分离鉴定及其kerC的克隆表达

ＳｃｕｎｉｈａＡｇｉｕｔｒｌｒｃｌａＵｎｖｒｉ．Ｒｅａｉｅｘｅｉｎｓｂｕｉｍｏｐｏｏｉａ，ｐｙｉｌｇｃｌａｄｉｃｅｃｌｕｉｅｓｔｙｌｔｅｐｒｍｅｔａｏｔｔｖｓｒｈｌｇｃｌｈｓｏｏｉａｎｂｏｈｍｉａ
ｃａａｔｒｔｓａｄ１ＳＤＮＡｒｏｄｃｅ．ｓｌｈｗｅｔｐｓｅｓｄｔｐｃｌｃａａｔｒａｉｎｆＢａｉｕｕｔｉ．ｈｃｅｉｉｒｒｓｃｎ６ｗｅｅｃｎｕｔｄＲｅｕｔｓｏｄｉｏｓｓｅｉａｈｃｅｉｔｓｏｃｌｓｓｂｉｓｓｙｒｚｏｌｌＴｈｒｆｒ．ｉｗａｄｎｉｅｃｌｓｓｂｉｓａｄｎｍｅｃｆｓｂｉｓＢ一．ｔｒｒｄ，ｈｕｌｏｉｅｓｑｅｃｆｅｅｏｅｔｓｉｅｔｄａＢａｉｕｕｔｉｎａｄＢａｉｕｔｉｉｆｓｌｌ？ｌ３Ａｆｗａｓｔｅｎｃｅｔｅｕｎｅｏｅｄ
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产蛋白酶菌株的分离

产蛋白酶菌株的分离一、教学目标及基本要求1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法二、实验原理枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。

枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。

由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。

但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。

例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。

又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。

1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。

由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。

2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。

利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。

根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。

3. 枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。

有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。

菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。

在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。

菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。

4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。

枯草芽孢杆菌的分离及筛选

枯草芽孢杆菌的分离及筛选枯草芽孢杆菌是一种常见的土壤细菌，广泛存在于自然环境中，可发酵多种有机物，在生物降解、环境清洁等方面有广泛应用。

本文将介绍枯草芽孢杆菌的分离及筛选方法。

一、土样采集与处理选择土壤样品时应注意，最好是新鲜土壤，不含过多杂质和残留农药、化学物质等。

首先，将土壤样品放入干净无菌试管中，并加入生理盐水，与搅拌器进行搅拌，使土壤悬浮于生理盐水中。

然后将其过滤，再将过滤液离心，离心后上清液即处理好的样品。

取样品1ml加入小培养皿中，加入适量的20%固体土壤样品，混匀后将其平均涂布于营养琼脂平板上，再进行孵育。

通常，孵育温度为30-37℃，培养基的选择可根据实验需要进行不同的调配。

通过枯草芽孢杆菌的鉴定，可判断其种类和特性。

可采用革兰染色法、形态学观察法、生理生化测定法等多种方法进行鉴定。

1. 革兰染色法：将菌落划入微滴水中，然后将其固定，加入革兰染色液，约定时间后用水冲净，用镜片沥干，用显微镜观察。

2. 形态学观察法：通过对菌落的形态、色素、形状、运动方式等特征进行观察，再与已知菌株进行对照，确定其种类和特性。

3. 生理生化测定法：可通过测定该菌株的生理生化特性，如酸碱反应、氧需求等，进一步确定其种类和特性。

1. 抗生素筛选：将分离得到的枯草芽孢杆菌接种于含有不同抗生素的墨汁琼脂平板上进行筛选，观察不同菌落的生长情况并记录，最终确定其抗性水平。

2. 发酵产物筛选：通过枯草芽孢杆菌的发酵产物、酶活性等特性，进行筛选。

将菌株接种于适当的发酵培养基中，培养一定时间后采集发酵产物进行分析。

3. 生化代谢产物筛选：通过分离并鉴定菌株代谢产物，确定其产物种类和达到的水平，寻找有价值的代谢产物。

综上所述，枯草芽孢杆菌的分离和筛选具有重要的应用价值，为生物降解、环境治理等领域开拓了新的途径。

希望本文对有关人员能够提供一些参考和帮助。

枯草芽孢杆菌制作工艺流程

枯草芽孢杆菌制作工艺流程英文回答：The production process of Bacillus subtilis var. niger involves several steps to ensure the growth and multiplication of the bacteria. This process is commonly used in the production of biopesticides and biofertilizers. Here is a detailed description of the production process:1. Isolation and selection of Bacillus subtilis var. niger strains: The first step is to isolate and select the most suitable strains of Bacillus subtilis var. niger. This is done by collecting soil or plant samples and culturing them in a selective medium. The strains that exhibit desirable characteristics such as high spore production and disease control ability are selected for further cultivation.2. Inoculum preparation: Once the strains are selected, an inoculum is prepared by transferring a small amount ofthe culture into a nutrient-rich medium. This allows the bacteria to multiply and reach a high cell density.3. Fermentation: The inoculum is then transferred to a larger fermentation vessel, such as a bioreactor, where it undergoes controlled fermentation. The fermentation conditions, such as temperature, pH, and oxygen supply, are optimized to promote the growth and spore formation of Bacillus subtilis var. niger.4. Spore separation and purification: After fermentation, the culture broth is centrifuged to separate the bacterial cells from the liquid. The bacterial cells are then washed and purified to remove any impurities or contaminants.5. Drying and formulation: The purified bacterial cells are dried using methods such as spray drying or freeze drying. This process converts the bacterial cells into a stable powder form, which can be easily stored and transported. The dried cells are then formulated into a final product, such as a powder or a liquid concentrate, byadding suitable carriers or adjuvants.6. Quality control: Throughout the production process, quality control measures are implemented to ensure the purity, viability, and efficacy of the Bacillus subtilis var. niger product. This includes testing for the absence of contaminants, checking the spore count, and evaluating the biological activity of the product.中文回答：枯草芽孢杆菌的制作工艺流程包括几个步骤，以确保该菌株的生长和繁殖。