分子生物学第一篇基因表达调控和蛋白质修饰
现代分子生物学第1章绪论
表 1.引 用 指 数 在 10 以 上 的 自 然 科 学 刊 物 分 科 比 较
学 科 杂志总数 平均引用指数 >30 杂志 数
总论
3
17． 8
0
化学
2
11． 8
0
物理
5
22． 0
• 1972年，Paul Berg（美）第一次进行了 DNA重组。
• 1977年，Sanger和Gilbert（英）第一次进 行了DNA序列分析。
1980年，获诺贝尔化学奖
1983年，McClintock由于在50年代提出并发 现了可移动遗传因子（jumping gene或称 mobile element）而获得Nobel奖。
模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平
了道路。
1953, Watson &
Crick 提出DNA的反向平 行双螺旋模型; Wilkins通过对 DNA分子的X射线
衍射研究证实了该 模型。
Rosalind E. Franklin
1920-1958
• 1961年，法国科学家Jacob和Monod提出 并证实了操纵子（operon）作为调节细菌细 胞代谢的分子机制。
• 1993年，英国科学家Roberts和Sharp因 发现断裂基因（introns）而获得Nobel奖；
• 1993年，（美）Mullis由于发明PCR仪而 与加拿大学者Smith（第一个设计基因定 点突变）共享Nobel化学奖。
• 1994年，Gilman和Rodbell（美）由于发现了G蛋 白在细胞内信号转导中的作用而分享Nobel生理医 学奖；
生物化学及分子生物学(人卫第九版)-16基因表达调控说课讲解
色氨酸操纵子的结构及其关闭机制
A.前导序列的结构特征；B.在Trp低浓度时，核糖体停滞在序列1上，2/3发卡结构形成，转录继续进行； C.在Trp高浓度时，3/4发卡结构和多聚U序列使得转录提前终止
3.转录衰减的机制 ①色氨酸的浓度较低时，前导肽的翻译因色氨酸量的不足而停滞在第10/11的色氨酸密码子 部位，核糖体结合在序列1上，因此前导mRNA倾向于形成2/3发夹结构，转录继续进行； ②色氨酸的浓度较高时，前导肽的翻译顺利完成，核糖体可以前进到序列2，因此发夹结构 在序列3和序列4形成，连同其下游的多聚U使得转录中途终止，表现出转录的衰减。
3.真核生物编码蛋白质的基因是不连续的，转录后需要剪接去除内含子，这就增加了基因表 达调控的层次。
4.原核生物的基因编码序列在操纵子中，多顺反子mRNA使得几个功能相关的基因自然协调 控制；而真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子 （monocistron），许多功能相关的蛋白、即使是一种蛋白的不同亚基也将涉及多个基因的 协调表达。
1.原核生物大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的
2.操纵子（operon）：由结构基因、调控序列和调节基因组成 ①结构基因：包括数个功能上有关联的基因，它们串联排列，共同构成编码区。这些结 构基因共用一个启动子和一个转录终止信号序列，因此转录合成时仅产生一条mRNA长 链，为几种不同的蛋白质编码。这样的mRNA分子携带了几个多肽链的编码信息，被称 为多顺反子（polycistron）mRNA。
5种E.coli 启动子的共有序列
b. 操纵元件：是一段能被特异的阻遏蛋白识别和结合的DNA序列。 ③调节基因（regulatory gene）：编码能够与操纵序列结合的阻遏蛋白
分子生物学-基因表达调控
a) 经典的src激酶家族 b) JAK激酶家族
➢ 蛋白磷酸酶(Protein phosphatase， PPase) • 丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酶
（主要成员： PPl， PP2A， PP2B， PP2C等。）
• 酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP)及双重特异性蛋白磷酸 酶（DSP）
蛋白的翻译后加工
20
蛋白质的磷酸化与脱磷酸化在细胞内的信 号传导过程中具有重要意义
• 活性受到信号分子的间接调节（共价修饰), 因此应答的特异性高；
• 存在放大效应； • 反应迅速； • 几乎涉及所有的生理过程
06
➢ DNA甲基化转移酶:
➢ DNA甲基化的功能：
一. 转录激活因子的结构 二. 转录激活因子的作用机制
转录水平/转录起始水平
一. 转录激活因子的结构
08
转录起始
顺式作用元件
反式作用因子
启动子
(Promoter)
基础/通用转录因子
（basal /general transcription factors）
例：小鼠免疫球蛋白 μ重链基因的选择性拼接
分泌型
膜结合型
反式拼接（Trans-Splicing）
顺式拼接： 涉及的外显子在同一个基因中; 反式拼接： 涉及的外显子不在同一个基因中，甚至不在同一个染色体中。
二. RNA的编辑
14
RNA编辑(RNA editing): 指的是转录后的RNA上发生的碱基插入，缺失，替换等现象。
பைடு நூலகம்
翻译后水平
蛋白的翻译后加工
蛋白的翻译后加工
18
翻译过程中， 一旦多肽链从核糖体中伸出， 就开始多肽链折叠和翻译后修饰。
分子生物学原理：第十二章 基因表达调控1
基本方式。
二、乳糖操纵子调节机制
结构基因：lacZ（β－半乳糖苷酶） lacY（通透酶） lacA （乙酰基转移酶）
操纵序列：O1、 O2、O3 启动子：P
CAP结合位点
调节基因：I
Lac操纵子结构及其负性调节
Lac操纵子的调节
1、阻遏蛋白的负调节
阻遏基因
DNA
I
真核基因组结构庞大
真核基因组含有大量重复序列
多拷贝序列
高度重复序列（106 次） 中度重复序列（103 ~ 104次）
单拷贝序列
真核生物以染色质的形式储存遗传信息
真核生物转录与翻译分割进行
真核基因转录产物为单顺反子
真核基因具有不连续性
真核生物线粒体DNA也储存遗传信息
二、染色质的活化
反式作用因子（trans-acting factor） ——由某一基因表达产生的蛋白质因子，与被
调节的DNA调节序列相互作用而发挥作用，这些蛋 白质分子称为反式作用因子。
反式作用因子直接作用： •直接结合DNA序列
反式作用因子间接作用： •通过蛋白质－蛋白质相 互作用发挥功能
基因表达调控的生理意义
基因表达的时间特异性和空间特异性
基因表达的持续性
管家基因
基因表达的可诱导性
诱导与阻遏
二、基因表达调控
1
多层次
DNA 基因激活 、拷贝数重排 、DNA 甲基化 RNA 转录起始、转录后加工、mRNA降解
蛋白质 蛋白质翻译、翻译后加工修饰、蛋白质降解
2
在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为
II. 增强子(enhancer)
增强子是一种能够提高转录效率的顺式调控元件。
分子生物学知识：染色质修饰的调控机制及作用
分子生物学知识：染色质修饰的调控机制及作用染色质修饰的调控机制及作用染色质修饰是指对DNA和组蛋白等基因组蛋白质进行化学修饰的过程。
这些化学修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP-核糖基化等。
这些化学修饰能够影响基因表达的调控方式，对胚胎发育、细胞命运决定和基因转录起到重要的作用。
甲基化是最常见的染色质修饰。
甲基化是指DNA碱基中的腺嘌呤或胞嘧啶的甲基化，通常发生在CpG二连体中。
对DNA进行甲基化的酶称为甲基转移酶（DNMTs）。
甲基化被认为是稳定基因沉默的关键因素。
在哺乳动物中，甲基化通常出现在表观遗传学的调控中，并且在分化过程中起着重要作用。
许多基因负责胚胎发育和细胞分化，在甲基化状态中可能被沉默。
除了DNA甲基化，组蛋白修饰也是调节基因表达的重要方式。
组蛋白是一种碱性蛋白质，通过核染色作用维持着DNA的结构。
改变组蛋白修饰基团能够去除或添加电荷，从而影响它们的质量和方式，并最终影响与其相互作用的其他蛋白质的活性。
组蛋白修饰涉及到可逆和不可逆的改变。
组蛋白乙酰化是一种可逆修饰，通过加入乙酰基团而发生。
这种修饰通常促进染色质处于开放状态，从而使染色质更易于被转录。
另一方面，组蛋白去乙酰化是另一种可逆修饰，通常被视为对交错性染色质的沉默引起的更稳定的反应。
组蛋白乙酰化水平的变化可以改变基因表达，并直接影响生物体的发育、生理和行为。
磷酸化也是组蛋白修饰的一种形式。
在胚胎早期，过度的磷酸化被认为是维持着染色质处于“超开放”状态。
在晚期，磷酸化状态发生变化，组蛋白磷酸化逐渐增加，从而限制基因转录。
磷酸化也可以影响蛋白质的稳定性及其与其他蛋白质的相互作用。
泛素化是一种组蛋白修饰形式，其中泛素被添加到一些蛋白质上。
这种修饰通常被认为是响应蛋白质质量控制的一种方式。
出于这个原因，泛素化通常被认为是下降某些蛋白质水平的信号。
最后，ADP-核糖基化被认为是染色质修饰的新型形式。
这种修饰通过添加核糖基磷酸酯而发生，被认为是被调控的基因沉默方式之一。
分子生物学-13-原核基因表达调控-1-概念分类
突触囊泡 召集
nd run
外吐
内吞
a: kiss and stay b: kiss and run c: clathrin-coated
Kiss and run
• Synaptotagmin-1 interacts with phospholipids in a calcium-dependent manner, as well as with syntaxin-1 and SNAREs, and Südhof established a role for synaptotagmin-1 as a calcium sensor for rapid synaptic fusion
基因转录激活调节“三要素”
1、特异DNA序列 原核生物的操纵子 真核生物的顺式作用元件
2、调节蛋白 是调节基因转录的蛋白因子，如原核生物的阻遏 蛋白和CAP蛋白（降解物基因活化蛋白）、 真核生物的基本转录因子和特异转录因子等即反 式作用因子。
3、 RNA聚合酶
真核和原核细胞中的顺式作用元件
• 在原核生物中，大多数基因表达通过操 纵子模型进行调控，其顺式作用元件主 要由启动子、操纵子和调节基因组成。
7.0 基因表达调控相关的概念或观点
物种
遗传信息
DNA分子
生长
发育
分化 细胞
组织
规律
时空顺序
受精卵 关闭
基因表达 开启
活化状态
调控
功能基因组学
关闭状态
调控机制
• 人类基因组DNA中约含3.5万个基因，但 在某一特定时期，只有少数的基因处于 转录激活状态，其余大多数基因则处于 静息状态。
• 在大部分情况下，处于转录激活状态的 基因仅占5%。
分子生物学研究中的基因表达调控
分子生物学研究中的基因表达调控基因是生命的基本单位，通过基因表达，细胞可以合成蛋白质，进而参与各种生物过程。
基因表达的调控是细胞发育、分化和适应环境的关键。
在分子生物学研究中，科学家们致力于探索基因表达调控的机制及其在生命过程中的重要作用。
基因表达调控可以分为转录调控和转录后调控两个层面。
首先，转录调控是指在DNA转录为RNA的过程中，通过调控转录的速率和特异性来控制基因表达。
转录调控的关键是转录因子，它们可以识别特定DNA序列，并调节基因的转录。
转录因子与DNA结合的方式多种多样，如通过结合DNA的特定序列（启动子区域）或结合其他转录因子形成复合物来实现调控。
通过转录因子的作用，细胞可以对内外环境变化作出适应性反应。
在转录后调控层面，主要通过RNA的剪接、修饰和降解来调控基因表达。
RNA剪接是指在RNA分子合成之后，通过剪接酶的作用将剪接区域的RNA片段切除和连接，从而形成成熟的RNA分子。
剪接的方式多种多样，同一基因可以产生多个不同的RNA剪接体，从而实现基因表达的多样性。
此外，RNA还可以通过修饰（如甲基化）来调控基因表达。
这些修饰使RNA分子更加稳定，或者通过与其他蛋白质相互作用，影响RNA的功能和定位。
另外，通过降解RNA分子，细胞可以快速调节基因表达的水平，以实现对环境变化的反应。
除了细胞内调控机制外，外源性信号和内源性信号也可以影响基因的表达调控。
外源性信号，如激素、药物等，可以与细胞表面的受体结合，传递信号并影响基因的表达。
内源性信号则是指细胞内部的信号通路，包括细胞周期、细胞分化等过程。
这些信号可以通过磷酸化、乙酰化等化学修饰来调控基因的表达。
最近，通过高通量测序技术的发展，我们可以更深入地研究基因表达调控。
基因组学、转录组学和表观基因组学等技术的应用，使我们能够全面了解细胞状态下基因表达的整体图谱。
通过研究这些图谱，我们可以揭示转录调控和转录后调控在不同细胞类型和发育阶段的差异，以及基因表达异常与许多疾病的关联。
分子生物学知识：蛋白质表达的调节机制
分子生物学知识：蛋白质表达的调节机制蛋白质表达的调节机制是生物体内蛋白质合成过程中的一系列调控机制。
蛋癸蛋白质表达是细胞生物学中最基本的生物学过程之一，对细胞的功能和生存至关重要。
蛋白质的表达调控机制包括转录调控和翻译调控两个层面。
这些调控机制能够有效地调节细胞内蛋白质的数量和种类，从而使细胞能够适应外部环境的变化和内部代谢的需要。
1.转录调控转录调控是指在转录过程中，通过控制RNA聚合酶的结合和活性来调节基因的转录水平。
细胞利用一系列的转录因子和共激活子来控制基因的转录。
这些转录因子可以识别并结合到特定的DNA序列上，从而启动或抑制基因的转录。
一种经典的转录调控机制是切割体的形成和功能。
在真核生物中，大部分mRNA在转录过程中都需要进行剪接修饰。
切割体由多种蛋白质组成，包括小核RNA和蛋白质因子。
切割体的形成和功能使得mRNA的剪接过程能够受到调控，从而产生不同种类的成熟mRNA，进而影响蛋白质的表达水平。
另一种转录调控机制是组蛋白修饰。
组蛋白是染色质的主要组成部分，它能够通过翻译后修饰来调节基因的转录。
例如，乙酰化和去乙酰化等修饰可以改变组蛋白对DNA的结合能力，进而影响染色质的开放性和基因的转录水平。
2.翻译调控翻译调控是指在mRNA翻译成蛋白质的过程中，通过控制转运RNA 和核糖体的结合来调节蛋白质的合成水平。
在这一过程中，细胞利用一系列的调控因子和信号通路来调节翻译的速率和效率。
一个典型的翻译调控机制是mRNA的稳定性调控。
mRNA在翻译前需要通过一系列的后修饰来影响其在细胞内的寿命和稳定性，并从而影响蛋白质的表达水平。
这些后修饰包括mRNA的poly(A)尾修饰和mRNA 的降解。
另外，一些RNA结合蛋白也能够通过结合到mRNA上来影响其稳定性和翻译效率。
转运RNA的选择性翻译也是一个重要的翻译调控机制。
这种机制能够通过选择性地识别和结合特定的转运RNA来调节特定蛋白质的合成水平。
例如，一些调控蛋白能够识别特定的转运RNA结构或序列，从而影响其在翻译过程中的优先级和效率。
分子生物学中的蛋白质表达调控
分子生物学中的蛋白质表达调控蛋白质是生命体内最为重要的基础分子之一，其表达调控对维持生命的正常运转至关重要。
分子生物学中的研究表明，蛋白质表达调控涉及复杂的信号传导、转录调控、翻译后调控等多个层次。
本文将从这些方面详细探讨蛋白质表达调控的机制和意义。
一、信号传导的作用对于细胞而言，表达适量的特定蛋白质可以满足细胞自身代谢的需要，但是在细胞生长、发育及应激应答等过程中蛋白质表达级别的快速改变是必要的。
这种调控依赖于信号传导网络的发挥作用，并可以通过调控转录因子的活性和稳定性来实现。
例如，细胞在受到刺激时，信号被传递至转录因子，从而激活特定基因的转录，产生符合需要的蛋白质。
二、转录调控的重要性转录调控是表达调控中最为核心的环节，也是最为广泛研究的方向。
转录调控可以通过多种方式实现，例如组蛋白修饰、转录因子结合和RNA聚合酶II的结构特性等等。
组蛋白修饰是一种转录激活的方式，通过组蛋白修饰酶作用将DNA包裹在染色质上，改变染色质的结构，从而影响基因的可访问性和稳定性。
与此同时，转录因子也可以通过与启动子相互作用，诱导RNA聚合酶II 的结合，并介导基因的转录。
此外，转录因子还可以作为适应环境变化的传感器，识别特定的信号，进而介导基因的表达调控过程。
三、翻译后调控的作用翻译后调控是指在蛋白翻译过程中， mRNA或蛋白质本身的调控作用。
这一调控方式可以通过微小RNA、RNA稳定性、蛋白翻译后修饰等多种方式实现。
例如，微小RNA可以结合到特定的mRNA上，针对其3'端进行递减降解。
此外，蛋白翻译后修饰也可以通过磷酸化或甲基化等方式来影响蛋白质的功能和稳定性。
这些翻译后调控因素可以对蛋白质表达产生重要的调控作用，从而完成细胞代谢、生长、分裂、凋亡和应激等生命过程。
四、表达调控的意义蛋白质表达调控在研究生命现象、发现疾病机理及挖掘药物靶点等领域都具有重要的意义。
例如，通过对差异表达基因的筛选和研究，可以发现相应的生物过程及其调控机制。
基因的分子生物学3篇
基因的分子生物学第一篇：基因的发现与结构基因是生物体内的遗传物质，掌握基因分子生物学对于理解遗传学和细胞分子生物学有着至关重要的意义。
而要了解基因，首先需要了解基因的发现和结构。
本篇将从发现基因的历史出发，介绍基因的结构、功能和分类。
一、基因的发现基因的发现历史可以追溯到康德尔和洛希提出的“遗传病理学”学说。
他们认为父母对后代的遗传是通过“血”的传递实现的。
此后，许多科学家先后展开了一系列的基因研究，如摩尔根和他的学生门德尔等人的基因定位实验，和沃特森和克里克提出的基因结构模型等。
这些研究奠定了遗传学和分子生物学的基础。
二、基因的结构大体上，基因是由DNA (deoxyribonucleic acid, 脱氧核糖核酸) 组成的，并且这些基因携带着遗传信息。
DNA分为四种碱基：腺嘌呤(Adenine, A)、胸腺嘧啶(Thymine, T)、鸟嘌呤(Guanine, G)和胞嘧啶(Cytosine, C)。
这些碱基以复合物的形式排列成了DNA链。
每条DNA链由磷酸基团和脱氧核糖醛基团组成，两条链通过碱基之间形成的氢键粘在一起。
基因的长度不固定，从几百个碱基到数百万个碱基不等。
而基因的信息则是通过DNA链中的不同碱基序列存储的。
这种存储方式使用了DNA所具有的“四字母”编码系统，每三个碱基编码一个氨基酸。
三、基因的功能基因所携带的遗传信息分为两类：表型信息和表达控制信息。
表型信息指的是基因所编码的蛋白质，而表达控制信息则是指调节基因表达的元件，如启动子、转录因子等。
基因的表达是指基因信息转化为蛋白质的过程，而基因表达的过程同样分为两个环节：转录和翻译。
其中转录是指由RNA依据DNA模板合成RNA的过程；翻译是指RNA信息转变为蛋白质序列的过程。
这一过程的完美执行需要多种辅助因子的调节。
四、基因的分类随着基因研究的不断进步，基因的分类也不断被完善。
目前，基因主要分为三类：编码基因（coding genes）、调控基因（regulatory genes）和结构基因（structural genes）。
分子生物学原核生物基因表达调控ppt课件
一、原核基因表达调控环节
1、转录水平上的调控
（transcriptional regulation）
2、转录后水平上的调控
（post-transcriptional regulation）
① mRNA加工成熟水平上的调控 ② 翻译水平上的调控
15
二、操纵子学说
1、操纵子模型的提出 1961年，Monod和Jacob提出 获1965年诺贝尔生理学和医学奖
54
55
③ 操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp）， 是阻遏物的结合位点。
56
RNA聚合酶结合部位
阻遏物结合部位
57
操纵位点的回文序列
58
④当阻遏物与操纵基因结合时，lac mRNA的转 录起始受到抑制。
59
未诱导：结构基因被阻遏
阻遏物 四聚体
LacI P O
lacZ
lacY
lacA
32
酶合成的诱导操纵子模型
调节基因
操纵基因
结构基因
阻遏蛋白
调节基因
操纵基因
结构基因
诱导物
如果某种物质能够促使
阻遏蛋白
mRNA
细菌产生酶来分解它，
这种物质就是诱导物。
诱导物
酶蛋白
33
• 可阻遏调节：基因平时是开启的，处在产生蛋白质 或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物 的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。 例：色氨酸操纵子 合成代谢蛋白的基因
1、根据操纵子对调节蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白） 的应答，可分为： 正转录调控 负转录调控
29
调节基因
操纵基因
结构基因
激活蛋白 阻遏蛋白
正转录调控 负转录调控
第1章-分子生物学与基因工程绪论
采用几种限制性内切酶组合可以使DNA分 子产生特定的片段.
– e.g. EcoRI + HindIII
DNA连接酶(DNA ligase )
1967年在三个实验室同时发现的。 活性：封闭DNA链上缺口，借助ATP或
NAD水解提供的能量催化DNA链的5’PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二 酯键。 要求：这两条链必须是与同一条互补链 配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且 必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接 酶催化成磷酸二酯键。
分子生物学的研究内容
DNA重组技术 基因表达调控研究 生物大分子的结构功能研究——结构
分子生物学 基因组、功能基因组与生物信息学研
究
基因工程（DNA重组技术）
将不同的DNA片段按照人们的设计定 向连接起来，在特定细胞中复制、表 达，产生影响受体细胞的新的遗传性 状
DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化 学、酶工程及微生物学、遗传学、细 胞学长期深入研究的结晶，限制性内 切酶、DNA连接酶及其它工具酶发现 与应用则是这一技术得以建立的关键。
DNA双螺旋结构模型的意义
DNA双螺旋模型结构同时表明了DNA复制的明显方式— —碱基互补配对原则上的半保留复制。
提示了基因和多肽成线性对应的一个可能理由：DNA核 苷酸顺序规定该基因编码蛋白质的氨基酸顺序；DNA中 的遗传信息就是碱基序列；并存在某种遗传密码，将核 苷酸序列译成蛋白质氨基酸顺序。
鲍林研究小组 威尔金斯、富兰克林研究小组 沃生、克里克研究小组
鲍林(Pauling)研究小组
主要工作： – 鲍林等1951年(提出蛋白质α-螺旋模型后)开始研究DNA 分子结构。
医学分子生物学重点
第一章基因表达调控第一节基因表达调控概念、方式、调控的主要阶段（转录）管家基因、奢侈基因概念第二节原核生物基因表达调控1、转录起始调控2、乳糖操纵子及调节（重点介绍）3、色氨酸操纵子4、原核生物的转录后调控（主要讲要点，不是重点）第三节原核与真核基因的差别1、真核生物基因表达调控特点2、染色质结构与基因表达（不讲）3、DNA甲基化与基因活性的调控请结合医学病例讲解甲基化对基因的影响4、转录水平的调控顺势作用元件反式作用因子蛋白质之间相互作用部分（不是重点）酵母双杂交技术5、翻译水平的调控第二章细胞增值、分化与细胞凋亡的分子第一节细胞增殖1、细胞周期介绍细胞周期分期、周期蛋白、重点介绍细胞周期调节方式原癌期和抑癌期的概念2、细胞周期的调控介绍Rb和P53为主的调节方式第二节细胞分化1、细胞分化2、细胞分化的基因调控机制3、干细胞分化第三节细胞凋亡1、细胞凋亡2、细胞凋亡的信号转导途径第三章基因工程第一节概念1、基因工程的基本概念（基因工程定义）2、基因工程的发展历史（自学）3、基因工程的应用（简介）第二节基因工程中常用的工具酶1、限制性核酸内切酶2、DNA连接酶3、其他用于DNA重组的工具酶第三节基因工程中的载体质粒作为载体的3个条件1、质粒载体一般的生物学特征2、PBR322和PUC，多克隆位点、抗性等第四章目的基因的获取第四节重组体的构建、导入与筛选基因工程六个基本步骤（大题）1、DNA的连接2、重组体的导入3、重组体克隆的筛选与鉴定第五章分子杂交第一节分子杂交概论1、分子杂交技术的发展简史及展望2、分子杂交的基本原理3、分子杂交的基本方法4、分子杂交的基本类型第二节southern 印记杂交1、实验原理2、实验方法3、实验结果4、注意事项第三节northern 印记杂交1、实验原理2、实验方法第四节western 印记杂交1、蛋白质样品的制备2、蛋白质样品的定量3、蛋白质样品的分离4、蛋白质样品的转移5、蛋白质样品的检测6、注意事项第六章基因诊断与基因治疗（课本上的黑体字部分注重看，了解方法步骤）名词解释（5×3′）填空题（15×1′）判断题（10×1′）单选题（30×1′）问答题（3×10′）1、绝缘子2、启动子3、反式作用因子4、细胞增殖5、基因工程6、细胞凋亡7、基因表达8、cDNA9、基因诊断10、Southern blotting11、顺式作用元件12、Plasmid1、为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度不变？高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
分子生物学DNA与蛋白质的合成与调控
分子生物学DNA与蛋白质的合成与调控在分子生物学中，DNA与蛋白质是两个核心的分子，它们在生物体内起着重要的合成与调控功能。
本文将围绕着DNA与蛋白质的合成与调控展开讨论，探究其相关机制与意义。
一、DNA的合成与调控1. DNA的合成：DNA合成是指在细胞有丝分裂或有丝分裂前期进行的DNA复制过程。
DNA双链会以复制起点为基础，由DNA聚合酶沿着DNA模板链进行复制合成。
复制过程中，DNA聚合酶会识别碱基对并在新合成链上添加互补碱基，最终合成两条完全相同的DNA分子。
2. DNA的调控：DNA的调控是指通过一系列机制控制DNA的合成速率与活性。
其中，DNA甲基化是一种常见的DNA调控方式，通过在DNA分子中的某些位置加上甲基基团，从而影响相关基因的表达。
此外，还有包括组蛋白修饰、DNA转录因子结合等方式参与DNA的调控。
二、蛋白质的合成与调控1. 蛋白质的合成：蛋白质合成是指根据DNA上的信息，通过核糖体的作用将氨基酸依次连接起来，合成出具有特定结构和功能的蛋白质。
合成过程中，mRNA作为信息的中介被翻译成蛋白质，并通过tRNA对应氨基酸的递送实现。
2. 蛋白质的调控：蛋白质的调控包括转录水平的调控和转录后的调控两个方面。
在转录水平上，通过转录调控因子的结合与调节，选择性地启动或抑制了特定基因的转录。
在转录后的调控中，通过RNA剪接、蛋白质修饰等方式，对合成蛋白质进行修饰、定位和降解等过程，从而调节特定蛋白质的功能。
三、DNA与蛋白质合成调控的重要意义1. 遗传信息的传递：DNA作为生物体遗传信息的储存载体，通过DNA的复制与传递，保证了后代个体遗传信息的相对稳定性和准确性，是生物进化和遗传的基础。
2. 基因的表达调控：DNA与蛋白质的合成与调控，参与了基因表达的调控。
通过上述方式的精细调控，确保了特定蛋白质的合成量和活性能够满足生物体的生理需求。
3. 生物体功能的实现：DNA与蛋白质合成调控的精确性和准确性，直接影响了生物体的发育、生长和功能实现过程。
基因转录调控和蛋白质修饰
基因转录调控和蛋白质修饰人类和其他生物的生命过程都受基因表达的影响。
基因的表达是特定的DNA序列在某个时刻被转录成RNA的过程，后者进而被翻译成蛋白质。
蛋白质是构成我们身体和生化反应的关键分子，而基因表达的调控方式就是通过转录调控和蛋白质修饰来实现的。
在本文中，我将探讨这些调控机制的基本概念和作用。
基因转录调控基因转录调控是指在细胞内控制RNA聚合酶所能接触到的DNA序列的过程。
这可以通过各种机制来实现，例如直接影响RNA聚合酶的活性或调节其与DNA结合的亲和力。
细胞中存在多种基因转录调控的机制，例如：1. 转录因子转录因子是一类控制基因表达的蛋白质。
它们能够与DNA结合并控制RNA聚合酶的活性。
转录因子还可以相互作用形成复合物，从而协同地调节基因的转录。
2. DNA甲基化DNA甲基化是一种使基因多聚体与DNA结合的蛋白质无法结合，从而阻止转录发生的化学修饰。
此过程会在修饰DNA特定区域的甲基酸会从DNA中引入一个甲基基团。
DNA甲基化在细胞发育和分化时起着重要作用。
3. chromatin remodelling存在一种将DNA与组蛋白组装成高度有序的“染色质”结构的遗传材料状态。
发生变化的染色质状态可影响RNA聚合酶的活性，并因此调节基因的转录。
通过基因转录调控，生物体可以特别地调整哪些基因处于转录状态，哪些没有，以适应不同的环境和需要。
蛋白质修饰假设一个基因已经通过转录表达为RNA，RNA此时会被翻译成蛋白质。
但是，蛋白质的功能往往还受到各种类型的蛋白质修饰的影响。
这些蛋白质修饰可以改变蛋白质的化学性质，如电荷、构象或增强蛋白质和其他分子之间的相互作用。
蛋白质修饰的类型非常多，但以下是其中一些最常见的。
1. 磷酸化磷酸化是添加磷酸基团的化学修饰。
它会通过改变蛋白质分子的形状，而影响其活性、相互作用和稳定性。
有时，磷酸化还可以影响蛋白质的定位，在细胞中移动或与其他分子相互作用。
2. 乙酰化乙酰化是通过加入醋酸酰基改变蛋白质的化学性质。
组蛋白修饰和基因表达调控的分子机制
组蛋白修饰和基因表达调控的分子机制基因是我们人体150万种蛋白编码的蓝图。
但是，每个人的蓝图都是独特的，这个独特之处不是由于拥有不同蓝图，而是由于我们基因的表达是有多种调控机制来完成的。
这些机制中的一种被称为“组蛋白修饰”。
组蛋白是DNA上浓缩的染色质，由由核心组蛋白和组蛋白H1组成。
DNA缠绕在核心组蛋白上，形成了类似于绳索的结构。
这些结构由一些关键酸基进行改变来完成基因表达的调控，这种改变就是组蛋白修饰。
组蛋白修饰是一个复杂的过程，需要多个酶协同合作进行。
在这个过程中，酶按照一定的顺序添加或去除细胞内核心组蛋白上的乙酰基、甲基、磷酸酯、泛素等化学基团的修饰，从而调整染色质状态，影响基因的转录、表达、复制以及基因组的稳定性等。
这个过程的发生通过一系列信号传导网络进行调控。
有关组蛋白修饰的机制研究表明，不同修饰类型的修饰位点、修饰时序以及修饰组合可调控染色质状态，影响基因转录的起始、扩展、终止和拓展等活动。
例如，乙酰化是一种常见的组蛋白修饰，常出现在核心组蛋白中的赖氨酸上。
乙酰化通常可增加染色质可拓展性和可访问性，从而增强染色质的活动性，有利于基因表达。
一些研究表明，在许多癌症中，乙酰化水平异常高，而乙酰转移酶是一个重要的治疗靶点。
另一方面，甲基化是一种比较稳定的组蛋白修饰，通常发生在DNA的顺式作用位点上，常见于环甲基化胶质瘤抑制基因和某些P53靶基因的启动区中。
甲基化可以在不影响DNA序列本身的情况下，稳定地压制基因的表达，因此在许多疾病中（包括癌症和自身免疫性疾病），DNA的过度甲基化通常被观察到。
除了上述的例子，还有其他许多组蛋白修饰类型。
例如泛素化可将核心组蛋白标记为需要修饰的靶点，而泛素化酶可以促进组蛋白去泛素化过程来更改染色质结构。
总之，组蛋白修饰是一种普遍存在于真核生物细胞内的基因调控机制。
在该过程中，将多种化学修饰添加到核心组蛋白上的特定位点，以控制染色质状态和基因表达。
正常人产生正常基因表达，而失调则导致分化、凋亡和肿瘤等各种疾病。
分子生物学表达调控
(二)诱导表达和阻遏表达---调控的普遍形式
管家基因和组成性表达:在细胞中持续表达,几乎 不受内外环境的影响.---生命全过程必需.
诱导和阻遏:调控的方式.在特定信号的刺激下, 基因表达开放或上调的现象叫做诱导,反之表现 为关闭或抑制的现象叫做阴遏.---对环境的适应.
(三)基因表达受顺式作用元件和反式作用因子的调节 顺式作用元件:与被调控序列在同一DNA链上 反式作用因子:本质为蛋白质(转录因子)
分开。因为无核膜， 生物称真核生物。其细胞称
基因受环境影响大。 为真核细胞。
（二）调控最大特点
原核生物
真核生物
调控直接受环境及营养状况 遗传程序调控、按“既定方针
的影响。调控是为了适应环境获 办”如动物1个受精卵，按遗传 取营养达到生存即分裂繁殖的最 程序开开关关基因，发育成成 优化（原核既无充足的能源贮备， 熟个体，该遗传程序是构成胚 又无高等植物制造有机物的本 领）。所以调控体现1个“快”字，胎发育和组织分化的基础。仅 快速适应环境，获取营养，合成 极少基因间接或直接受环境因
苷酶催化下转变成半乳糖，后者作为诱导剂（inducer） 与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白与操纵基因解聚，结构 基因转录。
阻遏蛋白的负性调节
无乳糖时,lac操纵子处于阻遏状态: pI →转录→阻遏蛋白I →I+O
Z Y A编码序列不转录
有乳糖时,经透酶催化并进入细胞, β-半乳 糖苷酶催化生成为半乳糖 半乳糖+阻遏蛋白 构象改变 阻遏蛋白与O序列分离 Z Y A转录 诱导剂:异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)
前导DNA 前导mRNA
(四)基因表达调控的分子基础---生物大分子相互作用 (五)多层次调控
基因表达的调控
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分子生物学第一篇: 基因表达调控和蛋白质修饰基因组(Genome): 生物个体所携带遗传性物质的总量。
即细胞中的DNA总量，或病毒的DNA或RNA量“C值悖论”(C-value paradox): C值:一种生物细胞中特异不变的DNA总量（单倍体基因组）。
物种的C值和它进化的复杂性之间没有严格的对应关系，这种现象称为C值悖论。
基因表达(Gene expression): 在一定调控机制下基因经过激活、转录、翻译、等过程产生具有生物学功能分子从而赋予细胞一定功能或表型，即基因的转录和翻译的过程。
基因表达调控（Regulation of gen expression): 细胞或生物体接受环境信号刺激或适应环境营养状况变化在基因表达水平上作出应答的分子机制。
这包括对表达基因种类和数量上的调调控。
基础基因表达(basic gene expression)：又称持续性/组成型基因表达(constitutive gene expression）: 不易受环境变化而改变的基因表达。
这其中包括一类“管家基因(housekeeping genes)”, 这类基因产物是细胞生存活动所必需的，在个体各生长阶段都表达。
可调节基因表达(regulated gene expression):易受环境变化而改变的基因表达。
对环境应答时被增强表达的过程称为诱导(induction), 被激活的基因称为可诱导基因(inducible genes)；对环境应答时被抑制表达的过程称为阻遏repression)，被抑制的基因称为可阻遏基因(repressible genes)基因表达规律:组织特异性(tissue specificity) 时间特异性(temporal specificity)基因表达调节的生物学意义:(一) 适应环境，维持生长和增殖(二) 维持个体发育与分化.真核细胞的结构特性:1、庞大基因组，结构复杂，大量重复序列，基因组大部分是非蛋白质编码的序列，基因内部常被内含子(intron)隔开2、结构基因转录产物是一条单顺反子(monocistron) mRNA,基本上没有操纵元件的结构，而且真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽链形成的亚基构成的，涉及到多个基因的协调表达。
3、以核小体为单位的染色质结构，以及众多DNA结合蛋白质成为调节基因开闭的重要因素；转录和翻译在时间和空间上被隔开，转录本和翻译产物需要经过复杂的加工与转运过程，使得基因表达的调控受到细胞核内外诸多层次的调节，而核外的遗传成分如线粒体DNA等，也增加了基因表达调控的层次和复杂性。
基因表达调节的主要阶段1、转录调控(transcriptional regulation)；（最基本或最重要的调控）2、RNA剪接过程(RNA splicing)中的调控；3、RNA 转运和定位过程(transportation and localization)中的调控；4、翻译调控(translational regulation)；5、mRNA稳定性(mRNA stability)的调控；6、蛋白质活性的调控(protein processing modification)。
活性与非活性染色质：典型的间期(interphase)染色质可分为高度密集状态的异染色质(heterochromatin，30nm的纤维被压缩40-50倍) 和较为松散的常染色质(euchromatin) 。
常染色质约10% 处于更开放的延展型结构，即为活性染色质(active chromatin，30nm的纤维压缩约6倍，具有转录活性，即电镜下的串珠状结构)。
此外的其它的色质不具有转录活性，属于非活性染色质(inactive chromatin)。
活性染色体的重要特征1.DNA酶I 超敏位点(DNase I Hypersensitive Site (DHSs)（DNA酶I 超敏位点的出现是活性染色质的重要特点之一）脱氧核糖核酸酶I(DNase I)可以随机剪切双链DNA的任意位点。
但染色之中有少数位点敏感性超出其他区域100倍以上，被称为DNA酶I 超敏位点。
DNA酶I 超敏位点约由100-200bp的碱基组成，主要位于已经起始或即将起始转录基因的5’侧翼，通常是调节蛋白位点附近。
某些基因中离3’侧翼较近,甚至在转录区内。
2.DNA 拓扑结构变化(DNA topology)天然双链DNA的构象大多为负性超螺旋。
基因活跃转录时RNA聚合酶转录方向的前方的DNA结构是正性超螺旋，其后面的DNA为负性超螺旋。
正性超螺旋会拆散核小体，有利于RNA聚合酶迁移转录，而负性超螺旋自有利于核小体再形成。
3.DNA碱基修饰变化(DNA modification)CpG序列的甲基化可能阻碍转录因子与DNA特定部位的结合而影响转录。
4.组蛋白变化(histone modification)组蛋白是带正电荷的碱性蛋白质，可与DNA带负电的磷酸基结合从而遮蔽DNA分子，起到非特异性阻遏蛋白的作用。
染色质中非组蛋白成分具有组织特异性可能消除组蛋白的阻遏，起到特异性的去阻遏促转录的作用。
活性染色体部分常有中非组蛋白成分的加入，组蛋白解聚与释放。
染色质重塑：通过调整核小体的相位，中和组蛋白尾巴碱性氨基酸残基（赖氨酸K、精氨酸R、组氨酸H等）带正电荷，减弱核小体中碱性氨基酸与DNA的结合，降低相邻核小体间的聚集使核小体滑动暴露本来被遮蔽的元件，或使核小体表面的元件瞬间暴露。
这种染色质结构的动态变化过程称为染色质重塑(chromatin remodeling)。
染色质重塑是基因表达表观遗传水平上控制的主要调控方式, 包括：1.依赖ATP的染色质物理修饰：即ATP水解供能使核小体沿DNA滑动，或使核小体解离并重新装配。
延伸中RNA聚合酶II的周围总是伴有核小体，这些核小体又是会处于部分解离部分装配的动态平衡状态,此染色质物理重塑复合体对于转录延伸也具有重要意义。
2.染色质的共价化学修饰：即多发生在组蛋白末端“尾巴”的乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化等。
主要发生在组蛋白末端的尾部，尤其是核心组蛋白的氨基末端尾部。
组蛋白末端部分含有一些带活性基团的氨基酸残基，这些氨基酸残基成为各种化学修饰的靶点。
组蛋白乙酰化（酶：HAT，histone acetyl transferases）：转录激活的标志，多发于组蛋白暴露在外的N端尾巴。
脱乙酰化（酶：HDAC ，histone deacetylase）与转录抑制相关，并参与多条信号传导通路。
组蛋白甲基化（酶：HMT，histone methyltransferases）：赖氨酸和精氨酸都可以被甲基化，其结果可以是激活或者抑制转录。
组蛋白泛素化(酶：E1s, ubiquitin-activating enzymes; E2s, ubiquitin-conjugating enzymes; E3s, ubiquitin ligases)：H2AK119泛素化与抑制转录有关；相反H2BK120泛素化激活转录，并在组蛋白伴侣分子FACT 帮助下在转录延伸中发挥作用。
组蛋白SUMO化:4种核心组蛋白都可发生，在H4、H2A、H2B上都已发现了一些特异位点。
组蛋白SUMO化拮抗在同一赖氨酸残基上的乙酰化和泛素化，因而具有抑制转录的作用。
组蛋白聚ADP核糖基化：可以在组蛋白上加上1个(酶：MART，mono-ADP-ribosyltransferase) 或多个ADP分子(酶：PARP，poly-ADP-ribosepolymerase)。
其活性依赖于缺口单链或双链DNA的存在。
可引起DNA部分地与核心组蛋白分离（构象变化可逆）。
脯氨酸异构化(酶：PPIase，peptidylprolyl isomerase，or Prolyl isomerase)：脯氨酸顺势和反式构象的转变会严重扭曲多肽链的骨架。
酵母中发现，FPR4能催化H3尾部的脯氨酸异构化(H3P38), 并调节H3P36的甲基化水平。
组蛋白尾部上的大量修饰使得它们之间可能互相干扰，修饰间的相互对话可能发生在不同水平。
细胞不同阶段和不同功能活动中组蛋白化学修饰可以是不同的，主要表现为：(1)组蛋白化学修饰类型可能是单一的，也可能是多种联合;(2)空间上，各种化学修饰的组蛋白底物可能相同，也可能不同；(3)时间上，各种化学修饰可能是同时的，也可能不同时；(4)功能上，各种化学修饰的效应可能是协同的，也可能相反。
真核基因正性调节占主导真核基因有正、负调节机制，但负调控元件并不普遍存在，虽然转录表达也有阻遏和激活或两种作用间有者，但真核染色质的紧密结构不允许基因随机转录，真核基因表达多需要主动激活，因此，真核基因表达以正性调控占主导。
基因转录的順式调节在分子遗传学领域，相对同一染色体或DNA分子而言为“順式”(cis)，对不同染色体或DNA分子而言为“反式”(trans)。
順式作用元件，即同一DNA分子中具有转录调节功能的特异DNA序列。
真核基因順式作用元件包括：启动子、增强子、沉默子和绝缘子。
启动子(promoter)RNA聚合酶周围的一组转录控制元件，即转录起始位点-1及其5’端上游100-200bp内的一组7~20bp的DNA序列，是决定RNA聚合酶II转录起始和转录频率的关键元件。
启动子至少包括一个转录启示位点(transcription start site，TSS，真核基因为-30，-75，-90)以及一个以上的机能元件。
机能元件典型的为TATA盒，共有序列为TATAAAA,通常位于-30~-25bp区，是上游启动子和增强子产生诱导性效应所必须。
分类：①核心启动子元件(core promoter element, CPE)：RNA聚合酶II起始转录所必需的最小的序列，包括转录起始点、其上游-30 ~ -25bp处的TATA盒和距起始点位点约-40 ~ +50bp 范围的DNA序列。
单独作用只能确定转录位点和产生基础水平的转录。
②上游启动子元件(Upstream promoter element，UPE)，不含TATA盒或不通过TATA盒转录，分为两类：一类是位于转录起始点上游-110 ~ -30bp区域富含GC盒（GGGCGG)的启动子，它含有多个转录起始点。
该启动子最初最初发现于一些管家基因，这些基因5’端上游富含GC，没有TATA盒，但有数个转录因子Sp-1(specificity protein 1)结合位点，且分布跨度大，对基本转绿化话有重要作用。
另一类既无TATA盒也无GC盒的启示转录，RNA聚合酶II 的转录起始于一个或数个成簇的起始子(initiator)上,它只有较弱保守序列5’-PyPyCAPyPyPyPyPy-3’，它与相应的蛋白质因子结合能提高或改变转录效率。