植物组织培养实验基本步骤。。

植物组织培养实验基本步骤

一、母液的配置

1、MS大量元素母液的配制

将大量元素配制成10 倍的母液，使用时再稀释

10 倍。按照配方表中用量依次分别称取扩大10 倍的：NH4NO3 8.250g 、KNO3 9.500g 、KH2PO4 0.850g 、MgS04 7H2O 1.850g 、CaCI2 • 2H2O 2.20g，所有药品称

取完毕后用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，最后定容至500ml，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4C冰箱中保

存备用。

2、MS微量元素母液的配制

将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别依次称取：MnS04 4H2O 1.1150g、ZnS04・ 7H2O 0.4300g 、H3BO3 0.3100g 、KI 0.0415g、CuSO4- 5H2O 0.00125g、CoCI2 • 6H2O

0.00125g ，用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容至500ml，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4C冰箱

中保存备用。

3、MS铁盐母液配制

将铁盐配制成100 倍的母液，使用时再稀释100 倍。按照配方表中用量分别称取扩大100 倍的：称FeSO4・

7H2O 1.390g 和Na2・EDTA 1.865g ,把FeSO4・7H2O 和Na2 • EDTA- 2H2O分别置于200ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解（磁力搅拌器，边加热，边搅拌）。保持加热，把FeS04溶液慢慢倒入Na2・ EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后加蒸馏水到最终容积500ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡1〜2min，贴上标签，注明母

液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4C冰箱中保存备用。

4、MS有机化合物母液的配制将有机化合物配制成100 倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：肌醇5.000g 、维生素B1 0.025g 、烟酸

0.025g 、甘氨酸0.100g 、维生素B6 0.005g 、蔗糖15.000g ，用蒸

馏水依次溶解并定容至500ml 后，转入500ml 细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4C 冰箱中保存备用。

二、植物激素的配置

常见激素：二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA、

吲哚乙酸（IAA）、吲哚一3—丁酸（IBA）、激动素（6-糠氨基

嘌呤、KT）、6—苄氨基嘌呤（6-BA）、赤霉素（GA3、

1、生长素类：

（1）、生长素类在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织

（2）、常见生长素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA、吲哚乙酸（IAA）、吲哚一3—丁酸（IBA）。NAA、IAA、IBA 被广泛用于生根，2，4－D 有利于愈伤组织的诱导和生长。IAA 容易光解，注意用棕色试剂瓶保存，保存时间不要太久。

（3）、溶解方法：称25mg吲哚乙酸（IAA），用少量1mol/L NaOH 或95％酒精预溶解，再加蒸馏水定容至25ml，摇匀。

（4）、保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存

2、细胞分裂素组织培养中，细胞分裂素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。细胞分裂素常常与生长

素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。

（1）、常用的细胞分裂素有：6 —苄氨基嘌呤（6—BA、激动素（6-糠氨基嘌呤、KT）、玉米素（ZT）、

噻二唑苯基脲（TDZ ）

（2）、溶解方法：称25mg 6—苄氨基嘌呤（6—BA，用少量（1ml）1mol/L HCL预溶解，再加蒸馏水定容

25ml，摇匀。

（3）、保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存

3、赤霉素（GA3）

（1）、溶解方法：用少量95％酒精预溶解，再加蒸馏水定容。

（2）、保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存

（3）、赤霉素易溶于水，但溶于水后不稳定，容易分解

（4）、灭菌：高温易分解，要过滤灭菌

4、脱落酸

（1）、溶解：易溶于NaHCO溶液、氯仿或丙酮。

（ 2 ）、保存：具有热稳定性，但容易发生光解。

配成一定浓度后，冰箱冷藏保存

三、培养基的制备与灭菌

（一）、培养基的制备

1 、将所需的各种母液和植物激素按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。

2、取烧杯一个内盛200ml 蒸馏水，按照培养基配方所需量依次取母液加入烧杯，搅拌，按相应培养基称量蔗糖和琼脂，并添加到烧杯中，在电炉上加热待琼脂完全融化后加蒸馏水定容至所需体积。

3、充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCI调节培养基的

pH为5.6-5.8 （可将其调为6.0 ），趁热把培养基分装到广口瓶中，封好瓶口，待灭菌。

（二）、培养基的灭菌

灭菌温度及灭菌时间：121 C （1.06kg/cm2 ）下灭菌20分钟。

（如是实验所用菌材灭菌，如无菌水及器械，则是121 C

（ 1.06kg/cm2 ）下灭菌30 分钟），此时可将需要灭菌的实验仪器一起灭菌。

1 、检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。

2、盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。

3、灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0 时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。

4、在培养基凝固之前加入一定量的植物激素后密封瓶口，放置在水平桌面上自然冷却。

四、无菌操作技术和接种

1 、接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及

接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种房间

紫外灯，照射约30min，然后关闭紫外灯。打开房间换气扇及微

开超净工作台的玻璃挡板，通风20min 后，即可进行无菌操作。

（此步由专人统一负责）

2、接种室灭菌过程中同时对外植体进行表面灭菌。先将接种材料