一代测序相关总结
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一代测序的基本原理： .......................... 3
Sanger 法测序原理： ................................................................................................................. 3 ABI3730XL 测序原理................................................................................................................... 5
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Q-23.怎样选择（设计）测序用引物? .................................................................................... 14 Q-24.觉得你给我的结果完全不是我需要的序列？ .............................................................. 14 Q-25.我的样品上有一个杂合位点，为什么在你们的报告上看不到杂合的信号？ .......... 14 Q-26.超过 6Kb 的 DNA 片断如何进行测序？......................................................................... 14 Q-27.全自动荧光测序的准确性如何？ .................................................................................. 15 Q-28.用测序的方法检测点突变可靠吗？ .............................................................................. 15 Q-29.我要求 5' 到 3' 正向测序，为什么你们给我的序列是反的？..................................... 15 Q-30.我的样品在你们所说的可靠范围内有一处存在疑问，能否重新测一次？ .............. 15 Q-31.我的样品你们已经测通了，但为什么在 overlap 区有这么多的错配，给出的全序列
峰图与原因：................................. 16
Q-1.PCR 产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？ ......................................... 16 Q-2.什么是碱基缺失？ ............................................................................................................ 17 Q-3.什么是引物不纯？ ............................................................................................................ 17 Q-4.重复结构对测序有哪些影响？ ........................................................................................ 18 Q-5.什么是模板不单一？ ........................................................................................................ 18 Q-6.Poly 结构的测序结果是怎样的？ .................................................................................... 19 Q-7.含有回文结构的模板测序结果是怎样的？ .................................................................... 19 Q-8.测序峰图为前双峰的结果是什么样的？ ........................................................................ 20 Q-9.测序峰图为后双峰是什么样的？ .................................................................................... 20 Q-10.无信号的结果：信号值（ATGC 的平均值）皆小于 100 ............................................. 20 Q-11.飘峰：这是由于用 3.0 特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移 ....................... 21 Q-12.没有任何干扰的结果 ...................................................................................................... 21
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一代测ห้องสมุดไป่ตู้的基本原理：
用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所 需要的 3－OH 基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系 列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链 DNA 模板分子结合后， DNA 聚合酶用 dNTP 延伸引物。延伸反应分四组（如下图）进行，每一组分别用 四种 ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用 PAGE 分析四组样品。 从得到的 PAGE 胶上可以读出我们需要的序列。
常见问题解答.................................. 7
Q-1.为什么提供新鲜的菌液？如何提供新鲜的菌液？ .......................................................... 7 Q-2.DNA 测序样品用什么溶液溶解比较好? ............................................................................ 7 Q-3.提供 DNA 测序样品时，提供何种形态的比较好? ........................................................... 7 Q-4.提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好? ........................................................ 7 Q-5.PCR 产物直接测序有什么要求？....................................................................................... 8 Q-6.为什么 PCR 产物直接测序必须进行 Agarose 胶纯化？................................................... 8 Q-7.如何进行 PCR 产物纯化？.................................................................................................. 8 Q-8.对于测序用的质粒 DNA 的要求有哪些? ........................................................................... 8 Q-9.如何鉴定质粒 DNA 浓度和纯度？..................................................................................... 8 Q-10.对测序引物的要求有哪些？ ............................................................................................ 9 Q-11.为什么测序引物必须特异地与 DNA 模板结合？........................................................... 9 Q-12.测序结果有很多套峰，还照常收费，为什么? .............................................................. 9 Q-13.为什么用 PCR 产物测序时，经常会出现套峰现象? ...................................................... 9 Q-14.出现套峰的原因是什么？ ................................................................................................ 9 Q-15.测序结果不到 800 Bases，还照常收费了，为什么? ..................................................... 9 Q-16.为什么在测序报告上找不到引物序列？ ...................................................................... 12 Q-17.在测序结果上，找不到测序用引物后面的序列，为什么? ........................................ 12 Q-18.PCR 片段直接测序和 PCR 片段经克隆后测序的结果有何区别?................................. 13 Q-19.测序结果和文献资料不一样，为什么? ........................................................................ 13 Q-20.我的基因序列与标准序列为什么有差别？ .................................................................. 13 Q-21.DNA 片段很长，一个反应读不到头，怎么办? ............................................................ 13 Q-22.测序完成后，测序样品和引物将如何处理（或保存)? ............................................... 13
和单个报告也存在差异，我该相信谁？.................................................................... 16 Q-32.你们为什么在 primer walking 时总将引物设计的那么靠前？ .................................... 16 Q-33.我有一个 4KB 的 PCR 片段，希望你们帮我测通。...................................................... 16 Q-34.样品送测序前已经鉴定过了，有插入片段的，为什么测序结果是一个空质粒？ .. 16 Q-35.对于测序结果有疑问怎么办? ........................................................................................ 16
一代测序的基本原理： .......................... 3
Sanger 法测序原理： ................................................................................................................. 3 ABI3730XL 测序原理................................................................................................................... 5
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Q-23.怎样选择（设计）测序用引物? .................................................................................... 14 Q-24.觉得你给我的结果完全不是我需要的序列？ .............................................................. 14 Q-25.我的样品上有一个杂合位点，为什么在你们的报告上看不到杂合的信号？ .......... 14 Q-26.超过 6Kb 的 DNA 片断如何进行测序？......................................................................... 14 Q-27.全自动荧光测序的准确性如何？ .................................................................................. 15 Q-28.用测序的方法检测点突变可靠吗？ .............................................................................. 15 Q-29.我要求 5' 到 3' 正向测序，为什么你们给我的序列是反的？..................................... 15 Q-30.我的样品在你们所说的可靠范围内有一处存在疑问，能否重新测一次？ .............. 15 Q-31.我的样品你们已经测通了，但为什么在 overlap 区有这么多的错配，给出的全序列
峰图与原因：................................. 16
Q-1.PCR 产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？ ......................................... 16 Q-2.什么是碱基缺失？ ............................................................................................................ 17 Q-3.什么是引物不纯？ ............................................................................................................ 17 Q-4.重复结构对测序有哪些影响？ ........................................................................................ 18 Q-5.什么是模板不单一？ ........................................................................................................ 18 Q-6.Poly 结构的测序结果是怎样的？ .................................................................................... 19 Q-7.含有回文结构的模板测序结果是怎样的？ .................................................................... 19 Q-8.测序峰图为前双峰的结果是什么样的？ ........................................................................ 20 Q-9.测序峰图为后双峰是什么样的？ .................................................................................... 20 Q-10.无信号的结果：信号值（ATGC 的平均值）皆小于 100 ............................................. 20 Q-11.飘峰：这是由于用 3.0 特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移 ....................... 21 Q-12.没有任何干扰的结果 ...................................................................................................... 21
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一代测ห้องสมุดไป่ตู้的基本原理：
用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所 需要的 3－OH 基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系 列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链 DNA 模板分子结合后， DNA 聚合酶用 dNTP 延伸引物。延伸反应分四组（如下图）进行，每一组分别用 四种 ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用 PAGE 分析四组样品。 从得到的 PAGE 胶上可以读出我们需要的序列。
常见问题解答.................................. 7
Q-1.为什么提供新鲜的菌液？如何提供新鲜的菌液？ .......................................................... 7 Q-2.DNA 测序样品用什么溶液溶解比较好? ............................................................................ 7 Q-3.提供 DNA 测序样品时，提供何种形态的比较好? ........................................................... 7 Q-4.提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好? ........................................................ 7 Q-5.PCR 产物直接测序有什么要求？....................................................................................... 8 Q-6.为什么 PCR 产物直接测序必须进行 Agarose 胶纯化？................................................... 8 Q-7.如何进行 PCR 产物纯化？.................................................................................................. 8 Q-8.对于测序用的质粒 DNA 的要求有哪些? ........................................................................... 8 Q-9.如何鉴定质粒 DNA 浓度和纯度？..................................................................................... 8 Q-10.对测序引物的要求有哪些？ ............................................................................................ 9 Q-11.为什么测序引物必须特异地与 DNA 模板结合？........................................................... 9 Q-12.测序结果有很多套峰，还照常收费，为什么? .............................................................. 9 Q-13.为什么用 PCR 产物测序时，经常会出现套峰现象? ...................................................... 9 Q-14.出现套峰的原因是什么？ ................................................................................................ 9 Q-15.测序结果不到 800 Bases，还照常收费了，为什么? ..................................................... 9 Q-16.为什么在测序报告上找不到引物序列？ ...................................................................... 12 Q-17.在测序结果上，找不到测序用引物后面的序列，为什么? ........................................ 12 Q-18.PCR 片段直接测序和 PCR 片段经克隆后测序的结果有何区别?................................. 13 Q-19.测序结果和文献资料不一样，为什么? ........................................................................ 13 Q-20.我的基因序列与标准序列为什么有差别？ .................................................................. 13 Q-21.DNA 片段很长，一个反应读不到头，怎么办? ............................................................ 13 Q-22.测序完成后，测序样品和引物将如何处理（或保存)? ............................................... 13
和单个报告也存在差异，我该相信谁？.................................................................... 16 Q-32.你们为什么在 primer walking 时总将引物设计的那么靠前？ .................................... 16 Q-33.我有一个 4KB 的 PCR 片段，希望你们帮我测通。...................................................... 16 Q-34.样品送测序前已经鉴定过了，有插入片段的，为什么测序结果是一个空质粒？ .. 16 Q-35.对于测序结果有疑问怎么办? ........................................................................................ 16