高拷贝数的质粒载体---西北师范大学

例如 POU71质粒，在低于 37C下培养，每条染色体平均只有一个拷贝， 但当温度上升到42 C时，其拷贝数可增加到1000个以上。在这种高温环 境下，细胞的生长及蛋白质的合成可按正常的速率持续2～3小时。这期 间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。最后，细胞生长受到了 抑制，并失去了存活的能力，但在这个阶段质粒DNA可累积到占细胞总 DNA的50％。
质粒
自主复制基日，转移基因，抗菌素抗性基因
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
Col质粒 R质粒 F质粒 Col质粒 R质粒 Col质粒
4.1.3.2 F质粒
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（1）以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，其上不携带 着细菌的染色体基因或DNA区段。这样的细胞叫做F+细胞。
（2）以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时在其上 还携带着细菌的染色体基因或DNA区段。这样的细胞叫做F’ 细胞。
4.2.1.1 质粒拷贝数的控制方式
天然质粒拷贝 数是通过控制 ＤＮＡ合成的 启动速率来调 节的
杂种质粒拷贝 数的控制因 DNA组成不同， 方式不同。
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4.2.1.2质粒拷贝数控制分子模型1—蛋白质稀释模型
4.2.1.2 模型2—自体阻遏蛋白质模型
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第三节 质粒DNA的分离与纯化
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bom (nic)
ColE1
实验中使用的许多载体分子，在其构建过程中都已经丢掉了nic位点，因此不能迁 移。要使这类质粒发生接合转移的唯一的可能途径是，通过重组作用形成融合的 共整合质粒，从而使它们在形体上变成接合型质粒的一部分。
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4.1.5 质粒的不亲合性
当两种或两种以上的质粒不能够在同一 个宿主细胞中共存的现象，叫质粒的不 亲合性. 这两种质粒就属于一个单一的不相容组.
ColE1是一种可以迁移的非接合型的质粒。
ColE1质粒的转移需要质粒自己编码的两种基 因参与：特异位点bom( nic) ；ColE1特有的 mob基因编码的核酸酶（迁移蛋白质）。
从ColEI质粒或其亲缘关系密切的派生的大多 数的质粒载体，都已经丧失掉了mob区段。迁
移蛋白可以由亲和性质粒类似基因来补充。 mob
第四章 基因克隆质粒载体
第一节 质粒的一般生物学特性 第二节 质粒ＤＮＡ的复制和拷贝数控制 第三节 质粒ＤＮＡ的分离和纯化 第四节 质粒载体的构建及类型 第五节 重要的大肠杆菌质粒载体
引子
❖限制性片段，连接进载体后，
形成多个重组DNA分子
❖将外源DNA带进宿主细胞 ❖提供使重组DNA分子在宿主细
胞中保存下去所需的生物学功能
4.1.2 质粒编码基因表达的某些表型特征 返回第四章
抗性特征 抗菌素抗性 氨苄青霉素、氯霉素、四环素、链霉素抗性等 重金属抗性 汞\镍、钻、铅、锑、锌等金属抗性 毒性阴离子抗性 砷酸盐、亚砷酸盐、亚硫酸盐、硼酸盐等 其它 嵌人试剂（EB）、辐射、噬菌体及细菌素、质粒特异的限制／修 饰体系抗性 代谢特征：抗菌素及细菌素的合成；碳水化合物、蛋白质、冠瘦碱的新陈 代谢；固氮作用、H2S的合成； 修饰寄主生活方式的因子 毒素的合成--大肠杆菌肠毒素合成； 金黄色葡萄球菌--剥脱性毒素的合成， 植物之冠座病和发根病；豆科植物的感染与结瘤 其它特征 盐杆菌---细胞中气泡的形成； 豌豆根瘤菌的根际蛋白质合成；
（3）以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上，这 样的细胞叫做Hfr细胞（高频重组细胞）。
4.1.3.3 质粒DNA的接合转移作用
雄性细胞中的 F因子按滚环复 制，进入到雌性细胞。
F－受体细胞
F＋细胞。
F因子还能够带动寄主染色 体一道转移。 从安全考虑，基因工程主要 使用非接合型的质粒。
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4.2.2 质粒拷贝数控制
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常用的定义是指，生长在标准的培养基条件下，每个细菌细 胞中所含有的质粒DNA分子的数目.
•10~100个拷贝，称为高拷贝数质粒，松弛型 •1~4个拷贝，为低拷贝数质粒，严紧型 •质粒最多可以占到细菌总DNA的0.1％ ~ 5％。
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高拷贝数：自身基因功能控制，与寄主无关 低拷贝数：自身与寄主共同控制，与寄主染色体同步复制 失控：一些低拷贝数的质粒，其复制控制是温度敏感型的。
4.1.3 质粒的转移
4.1.3.1 按结合方式分类类型：结合型和非结合型 雌一雄细胞配对过程为细菌的接合作用。
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分类
主要基因
Leabharlann Baidu
按抗性记 号分类
非 接 合 自主复制基因，产生大肠杆菌素基因 型质粒 自主复制基因，抗菌素抗性基因
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段
接 合 型 自主复制基日，转移基因，大肠杆菌素基因
❖通常用质粒、噬菌体和病毒
第一节 质粒的一般生物学特性
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4.1.1 质粒DNA：都有一段DNA复制起始位点序列
1、F因子(致育因子)：F+（♂）；F-（♀）；Hfr. 2、R因子(耐药性)： 3、Col因子：可以使不带有Col质粒的亲源关系密切的菌 株致死的蛋白质. 4、青霉素酶质粒： 5、Ti质粒(诱癌质粒)：植物基因工程重要载体。 6、降解质粒： 7、其它：隐蔽质粒、表达质粒、分泌质粒等。
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第二节 质粒DNA的复制与拷贝数控制
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4.2.1 质粒DNA复制的多样性 ① 对寄主酶的依赖性 ② DNA聚合酶的利用 绝大多数大肠杆菌质粒DNA都是利
用Pollll，仅在前体片段合成中才利用poll；但另外一些 质粒，例如ColE1，始终是利用pol1 。 ③ 复制的方向性 分为纯单向性的（如 ColE1 ）和纯双向 性的（如 F质粒）两种不同的形式。此外还有一类质粒， 其 DNA的复制既有单向性的也有双向性的。 ④ 复制的终止 ⑤ 复制型 ⑥ 复制起点 窄宿主范围质粒和广宿主范围质粒。
4.1.4 质粒DNA的迁移作用（mobilization） 返回第四章
接合型质粒的分子比较大，编码有一套控制质粒DNA 转移的基因。
非接合型的质粒，分子小，不足以编码全部转移体系 所需要的基因。
如果寄主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们 通常也是可以被转移的。
由共存共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移 叫质粒的迁移。