食品中铜绿假单胞菌检测
铜绿假单胞菌的检验流程
铜绿假单胞菌的检验流程
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的检验流程可以包括以下步骤：
1. 样品采集：从疑似感染源（如伤口、尿液、呼吸道分泌物等）采集样品。
确保采集过程无菌，并采用适当的采样器具和技术。
2. 培养基选择：选择适合于铜绿假单胞菌生长的培养基，如血琼脂、MacConkey琼脂等。
根据需要，还可以选择特殊的培养基，如铜绿假单胞菌选择性培养基。
3. 培养：将采集的样品在选择的培养基上进行斑点接种、刷涂或点菌法接种。
根据不同的培养基和环境条件，培养时间一般为24-48小时。
4. 形态观察：观察培养基上的菌落形态特征。
铜绿假单胞菌的菌落通常呈绿色或蓝绿色，具有金属光泽。
5. 鉴定测试：进行铜绿假单胞菌的鉴定测试，以确认菌株的身份。
常见的鉴定测试包括：
•革兰氏染色：观察菌株的革兰氏染色特征。
•氧化/还原测试：进行氧化/还原测试，如氧化酮酸试验等。
•水解反应：检测菌株的葡萄糖、麦芽糖等的水解反应。
•生化试验：进行生化试验，如氧化酶试验、产芽孢试验等。
6. 进一步确认：根据鉴定测试的结果，可以进行进一步的确认。
例如，可以使用API系统或分子生物学方法（如PCR）进行确认。
请注意，以上是一般的检验流程，具体的步骤和方法可能会因实验室的设备、方法选择和要求而有所不同。
在进行任何检验之前，建议遵循实验室的操作规范和相应的检验标准。
1/ 1。
饮用水中铜绿假单胞菌快速检测的研究进展
食品科技饮用水中铜绿假单胞菌快速检测的研究进展丁言炎1，章小洪2，郑连宝1，沈敏炬1*（1.德清县食品药品检验检测中心，浙江湖州 313200；2.丽水市质量检验检测研究院，浙江丽水 323000）摘 要：铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，广泛存在于各类水体环境中，对消毒剂、紫外线等因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎等各种疾病。
本文主要阐述了5种饮用水中铜绿假单胞菌快速检测技术的优点和具体应用，可为饮用水中铜绿假单胞菌的检验检测和质量控制工作提供参考。
关键词：铜绿假单胞菌；快速检测；饮用水Research Progress of Rapid Detection of Pseudomonasaeruginosa in Drinking WaterDING Yanyan1, ZHANG Xiaohong2, ZHENG Lianbao1, SHEN Minju1*(1.Deqing Food and Drug Inspection and Testing Center, Huzhou 313200, China; 2.Lishui Institute for QualityInspection and Testing, Lishui 323000, China)Abstract:Pseudomonas aeruginosa is a opportunistic pathogen that widely exists in various water environments. It has strong resistance to disinfectants, ultraviolet rays, and other factors, and can cause various diseases such as acute enteritis. This paper mainly expounds the advantages and specific applications of rapid detection technology of Pseudomonas aeruginosa in five kinds of drinking water, which can provide reference for the detection and quality control of Pseudomonas aeruginosa in drinking water.Keywords:Pseudomonas aeruginosa; rapid detection; drinking water铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又称绿脓杆菌，是一种常见的水源性致病菌，广泛存在于各类水体中，对消毒剂、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起败血症、脑膜炎和急性肠道炎等疾病。
牙膏中铜绿假单胞菌检验方法
牙膏中铜绿假单胞菌检验方法Detection of Pseudomonas Aeruginosa in Toothpaste1范围本规范规定了牙膏中铜绿假单胞菌的检验方法。
本规范适用于牙膏中铜绿假单胞菌的检验。
2定义铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，大部分能产生绿脓菌素。
3仪器3.1恒温培养箱：36℃±1℃、42℃±1℃。
3.2三角瓶：250mL。
3.3试管：18mm×150mm。
3.4灭菌平皿：直径90mm。
3.5无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸头。
3.6显微镜。
3.7载玻片。
3.8接种针、接种环。
3.9电磁炉。
3.10高压灭菌器。
3.11恒温水浴箱。
4培养基和试剂4.1SCDLP液体培养基见总则3.1。
4.2十六烷基三甲基溴化铵培养基成分：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化钠5g十六烷基三甲基溴化铵0.3g琼脂20g蒸馏水1000mL制法：除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调pH为7.4~7.6，加入琼脂，115℃高压灭菌20min后，制成平板备用。
4.3乙酰胺培养基成分：乙酰胺10.0g氯化钠 5.0g无水磷酸氢二钾 1.39g无水磷酸二氢钾0.73g硫酸镁（MgSO4.7H2O）0.5g酚红0.012g琼脂20g蒸馏水1000mL制法：除琼脂和酚红外，将其他成分加到蒸馏水中，加热溶解，调pH为7.2，加入琼脂、酚红，121℃高压灭菌20min后，制成平板备用。
4.4绿脓菌素测定用培养基成分：蛋白胨20g氯化镁 1.4g硫酸钾10g琼脂18g甘油（化学纯）10g蒸馏水1000mL制法：将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加热使其溶解，调pH至7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115℃高压灭菌20min后，制成斜面备用。
4.5明胶培养基成分：牛肉膏3g蛋白胨5g明胶120g蒸馏水1000mL制法：取各成分加到蒸馏水中浸泡20min，随时搅拌加热使之溶解，调pH至7.4，分装于试管内，经115℃高压灭菌20min后，直立制成高层备用。
铜绿假单胞菌的分离鉴定及流行病学调查
铜绿假单胞菌的分离鉴定及流行病学调查铜绿假单胞菌是一种常见的细菌，它属于铜绿假单胞菌属，是一类极耐环境和抗生素的细菌。
铜绿假单胞菌广泛存在于自然环境中，如土壤、水体、植物等。
它也是人体的正常菌群之一，可以在人体的皮肤、呼吸道、胃肠道等部位自然存在。
然而，在一些病理条件下，铜绿假单胞菌也可以引起各种感染，威胁人类健康。
铜绿假单胞菌的分离鉴定是为了了解其在环境中的分布情况及其对人体的感染能力。
流行病学调查的目的是确定感染源和传播途径，为疫情的控制和防止提供参考。
首先，进行铜绿假单胞菌的分离。
分离铜绿假单胞菌的方法一般是通过在不同的样本（如土壤、水、食品等）上进行菌落计数，从中选取典型的铜绿假单胞菌菌落进行进一步的分离。
常用的分离培养基有MacConkey琼脂和铜绿红脂琼脂两种。
分离完成后，可以通过染色和显微观察来初步鉴定。
其次，进行铜绿假单胞菌的鉴定。
铜绿假单胞菌的鉴定可以使用生化试验和分子生物学方法。
常用的生化试验包括氧化/发酵试验、涂片鉴别、目视鉴别等。
通过观察菌落形态、菌液性状和气泡产生情况等特征，可以初步鉴定铜绿假单胞菌。
进一步的鉴定可以使用分子生物学技术。
通过提取细菌的基因组DNA，可以进行PCR扩增和测序，根据16S rRNA或其它特定基因的序列，与数据库中的铜绿假单胞菌序列进行比对，从而确认其物种鉴定。
最后，进行流行病学调查。
流行病学调查的主要目标是确定感染源和传播途径，以便采取相应的控制措施。
调查可以从病例调查开始，通过回顾病例的流行病学信息，如患者的接触史、食物来源等，可以初步确定感染源。
此外，还可以进行对病例周围环境的调查，包括采集患者及其周围环境的标本，并进行铜绿假单胞菌的分离和鉴定，以确定感染源。
流行病学调查还需要进行流行病学学者之间的信息交流与合作，以便对大规模的疫情进行及时的跟踪和分析。
同时，通过对病例的进一步调查和控制措施的实施，可以减少铜绿假单胞菌感染的发生率，保障人们的健康。
食品中铜绿假单胞菌检测.课件(1).ppt
• 铜绿假单胞菌的菌体形态
无芽孢，无夹膜，革兰氏染色后为红色， 革兰阴性杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，运动 活泼。菌体的大小为0.5～1µm×1.5～ 3.0µm，菌体笔直或弯曲。
三、铜绿假单胞菌的检测
（一）检测方法（滤膜法） （二）检测原理 （三）试剂和设备 （四）检测步骤 （五）报告
（一） 铜绿假单胞菌检测方法 （滤膜法）
课堂测验
❖ 1. GB19298-2014《包装饮用水》的微生物指标中， 增加了 的检测，删除了 的检测。
❖ A.菌落总数 B. 大肠菌群 C. 铜绿假单胞菌 D.霉菌
❖ 2. 铜绿假单胞菌可引起局部化脓性炎症，也可引
起
。
❖ A.中耳炎 B.角膜炎 C.胃肠炎 D.以上都是
❖ 3.下列
不是铜绿假单胞菌的检测试剂。
国内污染情况：
-瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.2％～ 23.6％； -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6％。
➢ 国外污染情况：
-Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单 胞菌； -Rosenberg报告德国1.2％～10.2％的瓶装矿泉水 检出铜绿假单胞菌。
一、检测背景
（4）产氨试验
未加入钠氏试剂
深黄色到砖红色
阳性
阴 性
加入钠氏试剂
6.计数
• 计数滤膜上产绿脓色素的菌落以获得铜绿假单胞菌 的数量。
• 在紫外灯下产生荧光且在乙酰胺肉汤中产氨的所有 菌落证实为铜绿假单胞菌，并进行计数。
•将氧化酶反应阳性、 乙酰胺肉汤产氨、金氏B培养基 上显荧光的红褐色菌落进行计数。
5. 确证性试验
➢ （1）营养琼脂纯化 ➢ （2）氧化酶试验 ➢ （3）金氏B培养 ➢ （4）产氨试验
包装饮用水中铜绿假单胞菌检测
227科研与教育2020年第3期包装饮用水中铜绿假单胞菌检测钟 杰（深圳市计量质量检测研究院，广东 深圳 518000）摘 要：随着现代生活水平的提高，饮用水安全问题越来越受到关注。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种极具危害性的致病菌，检测其在饮用水中是否符合规定，对提高包装饮用水品质、普及健康用水理念有很大帮助。
检测方法参考新标准《食品安全国家标准包装饮用水生产卫生规范》（GB 19304—2018）中的铜绿假单胞菌滤膜-过滤法，并将检测出铜绿假单胞菌的水质通过PCR法扩增进行验证实验。
分析实验条件对结果的影响，并将结果与标准规定比对，判断抽取包装饮用水的质量，为消费者生产商提供可靠数据，为相关质量卫生部门加强监督管理提供依据。
关键词：包装饮用水；铜绿假单胞菌；滤膜-过滤法；PCR法中图分类号：R123.1 文献标志码：A 文章编号：2096-3092（2020）03-0227-02随着生活水平的提高，包装饮用水已在人们的日常生活中得到普及。
矿泉水方便易携带且口感好，桶装水便于家庭饮用且健康、安全，这些改变了人们长期以来的饮水习惯。
近年曝光的包装饮用水企业，很多是因为不合乎标准，微生物（铜绿假单胞菌）超标引起水质污染。
造成包装饮用水中铜绿假单胞菌超标的主要原因为水源遭受铜绿假单胞菌污染或生产过程中卫生控制不严格没有及时杀灭病菌，这对抵抗力较弱的人群存在较大健康风险。
因此，及时检测避免其带来经济损失是非常重要的。
为了进一步了解广东省包装饮用水的卫生状况，现随机从市面抽检包装饮用天然矿泉水和饮用纯净水进行检测。
机选取在2017年55批、2018年90批和220批。
1.2 菌株菌体有1～3根鞭毛，运动活泼。
/CN琼脂，乙酰胺肉试剂：萘啶酮酸（CN琼脂配套试剂），甘油，钠氏试剂（乙酰胺肉汤配套试剂），氧化酶试纸。
1.4 评价标准包装饮用矿泉水和饮用纯净水测定方法和标准参考新发行的标准《食品安全国家标准包装饮用水生产卫生规范》（GB 19304—2018）进行。
食品检验检测指标种类
食品检验检测指标种类食品安全是事关每个家庭、每个人的重大基本民生问题，加强监管、提升食品行业素质是实现食品安全形势持续稳定好转的根本基础。
食品检测作为食品安全的重要组成部分和关键环节，具有十分重要的意义。
一、微生物类项目1.菌落总数菌落总数是指示性微生物指标，并非致病菌指标。
主要用来评价食品清洁度，反映食品在生产过程中是否符合卫生要求。
菌落总数超标说明个别企业可能未按要求严格控制生产加工过程的卫生条件，或者包装容器清洗消毒不到位；还有可能与产品包装密封不严，储运条件控制不当等有关。
2.大肠菌群大肠菌群是国内外通用的食品污染常用指示菌之一。
食品中检出大肠菌群，提示被致病菌（如沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌）污染的可能性较大。
本次检出大肠菌群超标的产品均未检出致病菌，结合居民膳食结构、抽检情况等因素综合分析，健康风险较低，但反映该食品卫生状况不达标。
大肠菌群超标可能由于产品的加工原料、包装材料受污染，或在生产过程中产品受人员、工器具等生产设备、环境的污染、有灭菌工艺的产品灭菌不彻底而导致。
3.霉菌霉菌超标主要原因可能是原料或包装材料受到霉菌污染，产品在生产加工过程中卫生条件控制不到位，生产工器具等设备设施清洗消毒不到位或产品储运条件不当而导致。
4.霉菌和酵母霉菌和酵母超标原因可能是加工用原料受霉菌污染，也可能是流通环节抽取的样品霉菌和酵母超标，后者为储运条件控制不当导致。
霉菌和酵母在自然界很常见，霉菌可使食品腐败变质，破坏食品的色、香、味，降低食品的食用价值。
5.铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，广泛分布于各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等，易在潮湿的环境存活，对消毒剂、紫外线等具有较强的抵抗力，对于抵抗力较弱的人群存在健康风险。
天然矿泉水中铜绿假单胞菌超标可能是源水防护不当，水体受到污染；生产过程中卫生控制不严格，如从业人员未经消毒的手直接与矿泉水或容器内壁接触；或者是包装材料清洗消毒有缺陷所致。
铜绿假单胞菌检验标准方法
铜绿假单胞菌检验标准方法本标准是由《铜绿假单胞菌检验标准方法》编写，由中国国家质量技术监督局批准，现予以公布。
一、总则1.1 本标准规定了铜绿假单胞菌的检测方法。
1.2 本标准适用于含有铜绿假单胞菌的药物，食品，生物制品，洗涤剂等产品的检测。
二、试剂2.1 生化培养基：肉汤培养基，布洛绿培养基，糖胞培养基，等。
2.2 其他试剂：自热蓝钝化试剂，绿色磷酸钴溶液，盐酸苯溴醇溶液，1.45%氯化钠溶液，洗涤剂，烧杯，胶体金，正确滴定管，滤纸等。
三、标本预处理3.1 根据样品的不同，采用不同的预处理方法，如：（1）药物检验：①总菌数：将标本加水（按标本类型要求）搅拌分散，置温度25℃-35℃条件下培养3-5小时，取其液滴，用10倍浓缩液滴定管稀释后，每管各滴取3滴，移液到细菌晶胞培养基中，置温控设备培养2-4天；②尿路感染：将标本通过磨细处理，搅拌均匀，取1mL稀释，加入9mL布洛绿培养基中，摇匀，滴入滤纸上，用芳香族氯酚橙溶液杀菌，置温控设备培养1-2天；（2）食品检验：①总菌数：将标本加水（按标本类型要求）搅拌分散，取其液滴，用10倍浓缩液滴定管稀释后，每管各滴取3滴，移液到肉汤培养基中，置温控设备培养2-4天；②污染菌：将标本通过磨细处理，搅拌均匀，取0.1mL分装，加入9.9mL糖胞培养基中，摇匀，置温控设备培养4-8小时；（3）洗涤剂检验：①总菌数：将标本加水（按标本类型要求）搅拌分散，取其液滴，用10倍浓缩液滴定管稀释后，每管各滴取3滴，移液到肉汤培养基中，置温控设备培养2-7天；②污染菌：用1.45%氯化钠溶液，洗涤剂混合清洗烧杯，将标本加入，搅拌均匀，取1mL稀释，加入9mL糖胞培养基中，摇匀，置温控设备培养4-8小时。
四、检测方法4.1 鉴别：通过观察培养基上菌落性质，如颜色，形态，菌落外观，大小，来确定菌株；4.2 鉴定：采用通用鉴定方法（如，免疫学鉴定，生物学鉴定，代谢鉴定等），以确定所测菌株是否是铜绿假单胞菌。
桶装水铜绿假单胞菌污染及检测方式
现阶段，人们对于桶装饮用水的需求量不断增加，饮用水安全问题受到了人们的高度关注。
国家标准对桶装水中铜绿假单胞菌作出了不得检出的要求，但是在近几年间有多个地区出现了桶装水中铜绿假单胞菌严重超标的问题。
铜绿假单胞菌属于水源性致病菌,属于条件致病菌的一种，在水、人体皮肤、空气、呼吸道或者肠道等空间内均可存活，免疫力低的人群误饮受其污染的水以后，有较大的可能感染相关疾病。
1 桶装水铜绿假单胞菌出现的主要原因1.1 水源水污染因素因为水源水污染是导致桶装水污染的主要诱因之一，桶装水的主要原料为自来水、河流水、湖泊水或者泉水。
近几年，我国经济市场快速发展，未经处理达标的现代工业废水或者生活污水的排放会对水源水造成污染，如果水源水在受到污染并且没有通过后续清除流程，则很可能会造成连续污染现象。
例如：部分桶装矿泉水在其生产期间为了保证水体中的矿物质含量，不会使用精滤装置进行处理，就给了铜绿假单胞菌的污染机会[1]。
1.2 卫生意识不强，生产设备消毒不彻底部分企业设备陈旧、生产工艺简陋，对于铜绿假单胞菌的控制力度不足，水源水存在污染的可能性很高。
因为用于生产的主要仪器设备有很多接口，在正式生产期间容易出现交叉污染的情况，此时病菌会进入到最终产品中。
因为铜绿假单胞菌能够黏附于管道、贮水池或者增压泵中，并在其中繁殖，通过简单的冲洗不能彻底清除。
与此同时，如果正在使用的生产设备存在未经定期消毒、消毒不彻底的情况，也有可能造成铜绿假单胞菌污染，其中，消毒剂不合格造成污染的可能性也很高。
在上述内容之外，采用传统消毒方式，利用臭氧浓度低或者短时间冲洗并不能达到完全杀灭的效果，如此周而复始，水源水污染程度会不断加剧[2]。
1.3 包装材料的消毒清洗不到位对桶装清洁以及消毒处理不到位被视为成品水受到污染的最主要原因。
时下多数桶装水产品的制造商存在回收水桶的情况，而水桶自身的特殊结构非常不利于消毒工作的展开，同时消毒效果也会因此受到影响。
铜绿假单胞菌的鉴定方法与技术进展
铜绿假单胞菌的鉴定方法与技术进展铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阴性杆菌。
它是一种多重耐药的病原菌，对众多常用抗菌药物表现出不同程度的耐受性。
鉴定铜绿假单胞菌的方法及技术的进展对于临床医学、环境卫生以及食品安全等领域具有重要意义。
一、传统鉴定方法1. 形态学特征：铜绿假单胞菌在常规琼脂平板上生长呈青绿色，细菌呈短杆状或不规则杆状，革兰染色呈阴性，不产生孢子。
2. 生理和生化特性：铜绿假单胞菌可利用较多种类的碳源生长，产生草酸酶、葡萄糖氧化酶等酶类。
此外，它还可产生金黄色脆忻素、绿色芽孢杆菌素等色素。
3. 血清学鉴定：通过血清学反应检测铜绿假单胞菌所产生的O抗原和Vi抗原，结合凝集试验、血凝试验等方法进行鉴定。
二、分子生物学鉴定方法随着分子生物学技术的发展，越来越多的分子生物学方法被用于铜绿假单胞菌的鉴定和检测。
1. 16S rRNA基因测序：16S rRNA基因是细菌共有的基因，在物种鉴定上具有较高的特异性和可溯源性，通过对铜绿假单胞菌菌株进行16S rRNA基因测序，可以快速准确地鉴定其物种。
2. 基因片段PCR：利用铜绿假单胞菌特异基因片段进行PCR扩增，如oprL基因、oprD基因等，通过特异性条带出现可以判断是否为铜绿假单胞菌。
3. 多重PCR技术：多重PCR技术可以通过扩增多个特异基因片段，提高检测的特异性和灵敏度，如gyrB、rpoB、27-kDa等基因片段。
三、质谱法质谱法是近年来快速进行菌种鉴定的一种方法，其应用已得到广泛推广。
主要有飞行时间质谱法、荧光定量PCR结合质谱法、表面增强激光解析电离质谱法等。
这些质谱方法可以通过菌株代谢产物的分子质量进行鉴定。
四、胶体金技术胶体金技术通过标记特异性抗体或引物，利用胶体金颗粒作为信号素，通过胶体溶液在酶或免疫检测中的特异性反应，可以高度敏感地鉴定铜绿假单胞菌。
五、纳米生物传感器纳米生物传感器是一种新兴的鉴定技术，通过利用纳米材料的特殊性质以及生物传感机制来实现铜绿假单胞菌的高灵敏度检测。
简述桶装水中铜绿假单胞菌的几种检测方法
THEORY | 理论论究Mar. 2019 China Food Safety ·77·引言铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），也称为绿脓杆菌，属于假单胞菌属。
广泛分布于自然界（土壤、空气、水源等）及正常人皮肤、肠道和呼吸道，大小为（1.5~3.0）μm×（0.5~0.8）μm，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。
该菌在普通培养基上生长良好，专性需氧，菌落形态不一，多数直径在 2~3 mm，边缘不整齐，扁平湿润。
在血琼脂平板上形成透明溶血环。
铜绿假单胞菌是一种重要的水源性致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。
目前检测铜绿假单胞菌的标准中采用的主要是传统生化方法，包括分离培养、生化鉴定等，不能实现大批量水样的快速检测。
近几年，随着科技的发展，检测铜绿假单胞菌的方法多种多样，本文对近年铜绿假单胞菌检测技术进行综述，为铜绿假单胞菌的快速、准确检测研究技术提供参考。
铜绿假单胞菌检测技术国标滤膜法检测桶装水中铜绿假单胞菌的方法是GB 8538-2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》。
铜绿假单胞菌产色素分为三种：产绿脓菌素，产青脓素，产红脓素；铜绿假单胞菌在4℃不生长而在42℃可以生长；具有氧化酶，可以使细胞色素C 氧化，再由氧化型细胞色素C 使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物：可以产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加纳氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色络合物；根据这些生化特性，通过滤膜过滤将铜绿假单胞菌富集到CN 琼脂上，再用生化试剂管进行生化鉴定。
也可以用VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定系统用于微生物鉴定，准确率高，可用于微生物实验室的日常检测工作。
实时荧光定量PCR 检测外毒素 A 基因在铜绿假单胞菌中高度保守，根据简述桶装水中铜绿假单胞菌的几种检测方法GenBank 中铜绿假单胞菌外毒素A 基因片段序列，设计特异性引物及TaqMan 探针，并利用实时荧光 PCR 技术，对目标靶序列进行特异性扩增，建立了一套检测食品中铜绿假单胞菌的方法，特异性试验和灵敏性试验良好，该检测方法具有特异、快速的特点，能够满足检测要求，为食品中铜绿假单胞菌的快速检测奠定了基础。
食品中铜绿假单胞菌检测(2).
铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）俗称绿脓杆 菌，因为在代谢过程中产生水溶性的绿色 色素，皮肤有伤口时易感染，使伤口与创 面呈绿色，故名绿脓杆菌。
• 铜绿假单胞菌的菌体形态
无芽孢，无夹膜，革兰氏染色后为红色， 革兰阴性杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，运动 活泼。菌体的大小为0.5～1µm×1.5～ 3.0µm，菌体笔直或弯曲。
本菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病 原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿 瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者易 感染本菌。 经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓 肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶 可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。 烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。
WHO在HACCP的评估中明确指出铜绿假单胞菌 是婴儿瓶装饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹 泻。 尤其是抵抗力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜 绿假单胞菌的瓶装水很可能导致疾病的发生。 普通人食入103~104个菌体细胞即可被侵害。
假单胞菌属包括200余种菌。 多数为腐生菌，少数为植物和动物寄生菌， 大多为条件致病菌。
假单胞菌属分布广泛，土壤、水和空气中均有存在。
人类非发酵菌感染中，假单胞菌占 70 ％～ 80 ％，
主要为铜绿假单胞菌。
铜绿假单胞菌也是医院感染的主要病原菌。
假单胞菌属致病检出率
嗜麦芽 15% 其他 13%
不动杆菌 16%
铜绿假单 胞菌56%
二、铜绿假单胞菌的致病性
主要致病物质是内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、胞 外酶和外毒素等多种致病因子。 可引起局部化脓性炎症，也可引起中耳炎、角膜炎、 尿道炎、胃肠炎、心内膜炎 、脓胸，还可引起败血 症及婴儿流行性腹泻。
2017-2018年茂名市包装饮用水中铜绿假单胞菌检测分析
2017-2018年茂名市包装饮用水中铜绿假单胞菌检测分析随着人们生活水平的提高，包装饮用水的消费量逐年增加。
与此包装饮用水安全问题也备受关注。
铜绿假单胞菌是一种常见的水质污染细菌，长期饮用受污染的包装饮用水可能会对健康造成危害。
对包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测分析显得尤为重要。
本文将结合茂名市2017-2018年的实际情况，对该地区包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测分析进行详细阐述。
一、铜绿假单胞菌简介铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性杆菌，常生存在水、土壤和植物等环境中。
它对水温和营养物质的要求较低，能在较为恶劣的环境中存活繁衍。
铜绿假单胞菌对人体的危害主要表现在两个方面，一是可以引起急性感染，如呼吸道感染和消化道感染等；二是可以引起慢性感染，如慢性呼吸道感染和尿路感染等。
包装饮用水中如果存在铜绿假单胞菌，就会对饮用水的质量和人体健康造成威胁。
二、茂名市包装饮用水中铜绿假单胞菌检测情况通过对茂名市2017-2018年的包装饮用水质量监测数据进行分析后发现，该市包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测情况总体较好。
市区主要品牌的包装饮用水中，并未出现铜绿假单胞菌超标的情况。
但在农村地区和一些小众品牌的包装饮用水中，偶有少量的铜绿假单胞菌检出情况。
这说明茂名市的大部分包装饮用水生产企业在生产过程中，对水质的监控和管理做得较好，但仍有个别企业存在管理不善或生产环境存在一定问题的情况。
对这些地区和品牌的包装饮用水需要引起重视，并加强监测和管理。
三、茂名市包装饮用水中铜绿假单胞菌检测原因分析1. 生产环境卫生差部分包装饮用水生产企业的生产环境卫生情况较差，存在一定的污染隐患。
仓储、灌装间、管道等环境没有得到及时彻底地清洁和消毒，导致铜绿假单胞菌可能进入饮用水中。
一些小规模的包装饮用水生产企业由于生产条件有限，无法达到高标准的卫生要求，也容易出现铜绿假单胞菌污染。
2. 治理设施不完善一些包装饮用水生产企业的水处理设施不完善，对水源的污染处理不到位。
铜绿假单胞菌方法学验证报告
GB 8538—2016铜绿假单胞菌方法学验证报告一、验证目的验证《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验法GB 8538-2016》-铜绿假单胞菌检验在本实验室的适用性。
二、验证方法样品采样方案依据GB4789.1-2016 《食品微生物学检验总则》的要求进行，本实验样品取三个不同品牌的饮用天然矿泉水的典型样品进行实验，严格按照GB8538-2016进行。
除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阳性对照组，对照组由标准菌株铜绿假单胞菌（CMCC(B)10104）接种培养而成，与样品实验程序同时进行。
三、验证设备和试剂1.冰箱：SC-322 青岛海尔电器2.生化培养箱：SPX-150B-Z 上海博迅实业3.电位pH计：PHS-3C+（精确度0.01）成都世纪方舟科技有限公司4.恒温振荡器：SHA-A 江苏金坛环宇科学仪器厂5.菌落计数仪：Scan-500 北京五洲东方科技发展有限公司6.天平：JE-502 上海浦春计量仪器有限公司7.六联不锈钢过滤器北京中兴伟业仪器有限公司8.三用紫外分析仪：ZF-2 上海安亭电子仪器厂培养基和试剂：1.假单胞菌琼脂基础培养基北京陆桥技术股份有限公司2.绿脓菌素测定用培养基北京陆桥技术股份有限公司3.金氏B培养基北京陆桥技术股份有限公司4.营养琼脂北京陆桥技术股份有限公司5.氧化酶试剂北京陆桥技术股份有限公司6.乙酰胺肉汤北京陆桥技术股份有限公司7.三氯甲烷国药集团有限公司8.纳氏试剂北京陆桥技术股份有限公司四、验证环境1.依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；2.依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、生物安全柜进行清洁消毒灭菌并记录；3.依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及生物安全柜进行沉降菌检测并记录；4.无菌室检验：详见《XXXX》；五、验证步骤1.操作步骤1. 1水样过滤在100级的洁净工作台进行过滤操作。
包装饮用水中铜绿假单胞菌实时荧光定量PCR快速检测
基金项目：湖南省市场监督管理局科技计划项目（编号：２０２２ＫＪＪＨ４９）作者简介：王芳妹（１９８５—），女，湖南省产商品质量检验研究院工程师，博士。
Ｅ ｍａｉｌ：ｗｆｍｍｅｉｍｅｉ＠１６３．ｃｏｍ收稿日期：２０２３ ０２ ０８ 改回日期：２０２３ ０５ ２３犇犗犐：１０．１３６５２／犼．狊狆犼狓．１００３．５７８８．２０２３．８００７８［文章编号］１００３ ５７８８（２０２３）０６ ００７５ ０６包装饮用水中铜绿假单胞菌实时荧光定量ＰＣＲ快速检测Ｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊犪犲狉狌犵犻狀狅狊犪ｂｙｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｉｎｐａｃｋａｇｅｄｄｒｉｎｋｉｎｇｗａｔｅｒ王芳妹１，２犠犃犖犌犉犪狀犵犿犲犻１，２徐 越１犡犝犢狌犲１林 丹１犔犐犖犇犪狀１朱秋燕１犣犎犝犙犻狌 狔犪狀１ 洪振柏１犎犗犖犌犣犺犲狀 犫犪犻１ 蒋 伟１犑犐犃犖犌犠犲犻１（１．湖南省产商品质量检验研究院，湖南长沙 ４１０００７；２．湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室，湖南长沙 ４１００８１）（１．犎狌狀犪狀犘狉狅狏犻狀犮犲犘狉狅犱狌犮犲犱犆狅犿犿狅犱犻狋狔犙狌犪犾犻狋狔犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犆犺犪狀犵狊犺犪，犎狌狀犪狀４１０００７，犆犺犻狀犪；２．犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犘狉狅狋犲犻狀犆犺犲犿犻狊狋狉狔犪狀犱犇犲狏犲犾狅狆犿犲狀狋犅犻狅犾狅犵狔狅犳犛狋犪狋犲犈犱狌犮犪狋犻狅狀犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犆犺犻狀犪，犆狅犾犾犲犵犲狅犳犔犻犳犲犛犮犻犲狀犮犲，犎狌狀犪狀犖狅狉犿犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犆犺犪狀犵狊犺犪，犎狌狀犪狀４１００８１，犆犺犻狀犪）摘要：目的：有效弥补传统微生物学检验方法的缺陷。
方法：针对ＧＢ８５３８—２０２２中铜绿假单胞菌的毒力基因狆犮狉犔和１６ＳｒＲＮＡ基因的Ｖ３～Ｖ４区保守序列设计合成引物和探针，建立实时荧光ＰＣＲ方法。
环介导等温扩增技术检测食品中铜绿假单胞菌
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铜绿 假 单 胞 菌 （ ｓｕｏ ｏ ａ Ａ ｒｇ ｏａ Ｐ ， Ｐ ｅｄ ｍ ｎｓ ｅｕ ｉ ｓ ， Ａ） 革 ｎ 兰染色 阴性 菌 ， 自然界 中分布广泛 ， 在 为淡水 和土壤 中 最 常见 的细菌种类 之一 。空气 、 物皮肤 、 动 肠道 、 呼吸 道等处均可有该 菌的存 在 。
ｉ ｏ ｎ Ｆｏ ｄ
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铜绿假单胞菌能力验证技术方案
食品微生物学检验铜绿假单胞菌能力验证技术方案根据《新项目论证技术要求》，为保证此次能力验证数据准确，结果可靠，特制定如下技术方案：一、检验依据《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验GB 8538—2016》二、检品三个不同品牌的饮用天然矿泉水的典型样品三、人员比对a、b分别试验进行数据比对（双人双平行）四、准备工作仔细核对试验使用试剂及相关培养基，灭菌试验所需要的试剂、耗材以及玻璃器皿等。
五、质量控制1、按照国家标准规定准确称取样品和试剂并进行前处理。
2、仪器设备性能和检测环境的确认（1）依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；（2）依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、生物安全柜、超净台、无菌衣进行清洁消毒灭菌并记录；（3）依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T 27405-2008》定期对对无菌室、生物安全柜及超净台进行沉降菌检测并记录。
3、菌株确认依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T 27405-2008》和《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方GB 8538—2016》对试验所用到的铜绿假单胞菌标准菌株（阳性对照菌株）和荧光假单胞菌（阴性对照菌株）确认。
4、对照每次实验均应进行阳性、阴性和空白对照确保实验数据的可靠性。
六、注意事项1、过滤后的滤膜应平铺在CN琼脂平板上，避免在滤膜和培养基之间夹杂气泡；2、实验后对本实验所涉及到含阳性菌的耗材、容器、玻璃器皿、培养基、菌株等进行灭菌处理并做好记录；3、实验人员要严格按照《无菌检查系统操作规程》进出无菌室；4、严格按照《食品微生物学检验总则GB4789.1-2016》进行采样和实验。
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3、生化特性 • 氧化酶和过氧化氢酶阳性。O/F试验为氧化型，
还原硝酸盐为亚硝酸盐，分解乙酰胺产生氨。 98 ％菌株产生水溶性荧光色素。铜绿假单胞菌能 液化明胶，酪蛋白水解，但淀粉不水解。90 ％以 上的菌株产生蓝绿色色素。 • 分解蛋白质能力强，发酵糖类能力较低，氧化分 解葡萄糖，产酸不产气，不分解甘露醇、乳糖及 蔗糖，能液化明胶，分解尿素，不形吲哚，氧化 酶试验阳性，还原硝酸盐产气，靛基质阴性，不 产硫化氢。
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计数结果说明
• 菌落计数公式： N＝P＋F(cF/nF)＋R(cR/nR)
– P是呈蓝/绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞 菌的菌落）。
– F是没有绿脓色素但显荧光的菌落数。 – R是呈红褐色的菌落数。 – nF是进行产氨测试的显荧光菌落数。 – cF是产氨阳性的显荧光菌落数。 – nR是进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光
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• 铜绿假单胞菌可由多种途径传播，但主要是通过 污染医疗器械、用具及带菌医护人员引起医源性 感染，因此，对烧伤病房、手术器械及治疗器械 应进行严格消毒灭菌，以保证无铜绿假单胞菌的 污染。对铜绿假单胞菌感染的治疗，可应用庆大 霉素、多粘菌素B和羧苄青霉素。
• 铜绿假单胞菌抵抗力较其他革兰阴性菌强， 56℃1h可杀灭，对很多抗生素具有耐受性。对消 毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境抵抗
纯化
• 营养琼脂：将需验证的可疑菌落划线接 种营养琼脂培养基，于36℃±1℃培养 20h～24h，对可疑菌进行纯化。
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将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验 • 氧化酶试验 ： • 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统
的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧 化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的 醌类化合物。 • 操作：取2～3滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的 洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培 养物涂布在预备好的滤纸上。在10秒内显深蓝紫色的视为 阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进 行该项测试。
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培养基和试剂
• 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（低温避 光保存）
• 金氏B 培养基（低温避光保存） • 乙酰胺肉汤 • 营养琼脂 • 氧化酶试剂 • 钠氏试剂（配制好之后低温避光保存）
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设备和仪器
• 玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121℃高 压蒸汽灭菌15分钟
• 恒温培养箱：36℃±1℃ • 紫外灯：波长应为360±20nm • 滤膜：直径47mm，微孔径为0.45μｍ （处理方法
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国内外污染情况- 参考文献
• 国内污染情况： -瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.2％～23.6％； -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6％。
• 国外污染情况： -Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单胞菌； -Rosenberg报告德国1.2％～10.2％的瓶装矿泉水检出铜 绿假单胞菌。
测试的红褐色菌落数。 – cR是产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试
均呈阳性的红褐色菌落数。
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• 举例
N=17+16×(2/5)+10×(3/5) – 17：呈蓝/绿色的菌落数； – 16：没有绿脓色素但显荧光的菌落数； – 2：产氨阳性的显荧光菌落数； – 5：进行产氨测试的显荧光菌落数； – 10：呈红褐色的菌落数； – 3：产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均
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结果观察
培养20h～24h观察滤膜上菌落的生长 情况并计数，防止因为培养导致菌落过分 生长而出现菌落融合。（ 40h～48h时更 容易观察产色素情况和荧光情况）。
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可疑菌落计数情况
• 计数所有显蓝色或绿色（绿脓色素）的菌落，初步 判定为铜绿假单胞菌。
力强，对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌 强大。
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二、生物学特性
1. 培养特性 本菌属于假单胞菌属，是一种
非发酵革兰阴性无芽孢杆菌，菌体 细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或 短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显 微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。 2．菌体形态
无芽孢，无夹膜，革兰阴性杆菌，有单鞭毛 或丛鞭毛，运动活泼。菌体的大小为0.5～ 1µm×1.5～3.0µm，菌体笔直或弯曲。
自动生化鉴定仪器 生化试剂条（以国标法为参照，二者符 合率99.6％- 参考文献）
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铜绿假单胞菌
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一、概 述
• 铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）俗称绿脓杆菌， 因为在代谢过程中产生水溶性的绿色色素பைடு நூலகம்使伤 口与创面呈绿色，故名绿脓杆菌。
• 铜绿假单胞菌能在许多污染物质中存活并繁殖， 生长营养需求不高，善于利用各种碳源和氨化合 物作为氮源，在水、土壤、食品以及医院等环境 广泛存在，甚至在蒸馏水、消毒液也不例外，如 季铵类消毒液，特别是含有一些有机物的液体。
• 计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单 胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确定试验。
（在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光 下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导 致无法在证实培养基上生长。）
• 将其它所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶试验 、乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证实验。
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：如滤膜未经灭菌，则使用前需先将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次， 每次15 min。前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤2次～3次，以除去残留溶剂。建议使用一次性 无菌滤膜。）
• 显微镜：10×～100× • 冰箱：0℃～8℃
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操作步骤-水样过滤
在100级的洁净工作台进行过滤操作。 首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分， 将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上， 固定好滤器，将250mL水样或稀释液通 过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤 后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上， 平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着 气泡。
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产荧光素实验（金氏B培养基）
• 原理：蛋白胨提供氮源，磷酸盐促进荧光素 的产生并抑制绿脓色素的产生，硫酸镁为 荧光素的产生提供必须的阳离子，琼脂是 培养基的凝固。
• 操作：将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳 性的培养物接种于金氏B培养基上，于 36℃±1℃恒温箱培养24h～5d。 每天需取 出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将 5d内产生荧光的菌落记录为阳性。
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三、致病性
• 主要致病物质是内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、胞外 酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症 ，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内 膜炎 、脓胸，还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严 重的流行性腹泻。 • WHO的HACCP评估明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装 饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹泻。尤其是抵抗 力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜绿假单胞菌的瓶 装水很可能导致疾病的发生，患者食入103~104个菌体细 胞即可被侵害。铜绿假单胞菌的生长还将增加亚硝酸 盐的含量-参考文献。
呈阳性的红褐色菌落数； – 5：进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测
试的红褐色菌落数。
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• 样品稀释 若样品污染严重，建议对样品进行稀
释，如10倍递增稀释：取30ml样液加入 至270ml无菌生理盐水中，混匀，以此类 推，进行系列稀释。
• 报告 结果以 CFU/250ml计。
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• 其他确证试验方法
• 刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少，但有文献报 道5加仑桶装产品（15～31天的保存期），铜绿假单胞 菌可生长繁殖达到 CFU/ml。
• 国内卫生标准：0 CFU/250ml
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三、实验室检验
GB/T 8538-2008 铜绿假单胞菌检测（滤膜法）
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原理
将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤， 并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36℃士1℃恒 温箱中培养48h，能够在CN琼脂上生长并产生绿 脓菌素，或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈 阳性、紫外光（360±20nm）照射下能发荧光、 能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌， 经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。
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产氨实验（乙酰胺肉汤）
• 原理：铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶，可使 乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加钠氏试剂（ 碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用 ，生成红色的络合物。
• 操作：将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试 管中，在36℃±1℃下培养20h～24h。然后向 每支试管培养物加入1～2滴钠氏试剂，检查各 试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红色 的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。